CN118374460B - 一种铜绿假单胞菌噬菌体及其应用 - Google Patents
一种铜绿假单胞菌噬菌体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种铜绿假单胞菌噬菌体及其应用，属于微生物技术领域。本发明分离并鉴定了一种新的感染铜绿假单胞菌的裂解性噬菌体Pa_WF01，并对该噬菌体进行了生物学特性研究、形态学观察和全遗传进化关系分析，确定噬菌体Pa_WF01是无尾噬菌体Caudoviricetes纲Schitoviridae科Litunavirus属成员。本发明使用耐碳青霉烯铜绿假单胞菌CRPA感染的小鼠模型评价了噬菌体Pa_WF01的体内治疗效果和安全性，结果表明噬菌体Pa_WF01可用于治疗CRPA感染，缓解CRPA感染引起的炎症反应。另外，其与鲍曼不动杆菌噬菌体Ab_WF01组合可进一步促进抑菌效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种铜绿假单胞菌噬菌体及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, Pa）又叫绿脓杆菌，是一种革兰氏阴性菌。铜绿假单胞菌是临床获得性感染中重要的条件致病菌（Teklemariam等，2023）。铜绿假单胞菌获得性耐药和形成生物膜的能力极大增加了治疗的难度（Nathan等，2020）。在过去的几十年里，碳青霉烯类药物曾是控制铜绿假单胞菌感染的有效抗生素。然而，随着抗生素的不当应用，铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性日趋增强。此外，新抗生素的研发速度赶不上细菌耐药性增加的速度，严重限制了临床上治疗药物的应用。因此，寻找抗生素的替代疗法刻不容缓。
噬菌体是地球上最丰富多样的生物实体（Mushegian等，2020），任何环境都是各种类型噬菌体的独特来源，其中废水以及与医院环境直接相连的医疗污水是噬菌体最丰富的来源（Kakasis等，2019）。医疗污水是临床相关细菌丰富且天然的来源，尤其像铜绿假单胞菌这样的多药耐药病原体（Li等，2020），并且从这些环境来源中分离纯化和生产噬菌体的成本要比抗生素低很多。
噬菌体是专一裂解细菌的天然病毒，其独特的杀菌机制不同于抗生素，不易产生耐药性。根据噬菌体对细菌裂解作用的不同结果，噬菌体可分为：裂解性噬菌体和溶原性噬菌体。裂解性噬菌体能在宿主细胞内复制增殖，产生子代噬菌体使宿主细胞裂解；而溶原性噬菌体的基因组可以整合到宿主染色体上且不产生子代噬菌体，会增加靶细菌毒性并诱导噬菌体耐药性出现，因此不适用于噬菌体治疗。裂解性噬菌体作为细菌的天然杀手，在应对日益增长的耐碳青霉烯铜绿假单胞菌（Carbapenem-resistantPseudomonas aeruginosa，CRPA）菌株方面表现出巨大的应用潜力。
目前，尽管已有噬菌体疗法用于治疗耐药铜绿假单胞菌感染的报道，但噬菌体抗性菌株的出现也时有发生（Vaitekenas等，2021）。要将更多的噬菌体应用于临床治疗，就需要不断分离具有新的宿主特异性的噬菌体，以满足在噬菌体和细菌之间无休止的博弈下新进化出现的细菌病原体（Oduor等，2020）。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种铜绿假单胞菌噬菌体及其应用，该噬菌体是一种特异性感染耐碳青霉烯铜绿假单胞菌的裂解性噬菌体，通过对该噬菌体进行生物学特性研究、形态学和遗传进化关系分析、以及动物模型实验，发现该噬菌体作为一种新的潜在治疗剂具有广阔的应用前景。
本发明的技术方案如下：
一种铜绿假单胞菌噬菌体Pa_WF01（Pseudomonas aeruginosaphage Pa_WF01），于2024年4月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号：CCTCC NO: M 2024661。
本发明中的噬菌体Pa_WF01仅有直径约为50nm的六边形头部、无尾，在形态学上为无尾噬菌体，是无尾噬菌体Caudoviricetes纲Schitoviridae科Litunavirus属成员。
一种含有上述铜绿假单胞菌噬菌体Pa_WF01的噬菌体制剂。
根据本发明优选的，所述噬菌体制剂还包括噬菌体Ab_WF01。
上述铜绿假单胞菌噬菌体Pa_WF01或者上述噬菌体制剂在制备抑制或杀灭铜绿假单胞菌的产品中的应用。
根据本发明优选的，所述产品包括药物、饲料、杀菌剂、消毒剂、清洁剂。
根据本发明优选的，所述铜绿假单胞菌为耐碳青霉烯铜绿假单胞菌。
本发明中，所述铜绿假单胞菌包括人体来源的铜绿假单胞菌和其他铜绿假单胞菌；其他铜绿假单胞菌，例如可以是水中的铜绿假单胞菌，或者附着于其他物种的铜绿假单胞菌。
一种抑制或杀灭铜绿假单胞菌的产品，包括上述铜绿假单胞菌噬菌体Pa_WF01或者上述噬菌体制剂。
根据本发明优选的，所述产品包括药物、饲料、杀菌剂、消毒剂、清洁剂。
进一步优选的，所述药物为体外治疗药物或体内治疗药物。
根据本发明优选的，所述铜绿假单胞菌为耐碳青霉烯铜绿假单胞菌。
在具体的实施过程中，所述产品中还可以添加相应的辅料。
有益效果：
1、本发明分离并鉴定了一种新的感染铜绿假单胞菌的裂解性噬菌体Pa_WF01，并对该噬菌体进行了生物学特性研究、形态学观察和全遗传进化关系分析，确定噬菌体Pa_WF01是无尾噬菌体Caudoviricetes纲Schitoviridae科Litunavirus属成员。
2、本发明使用耐碳青霉烯铜绿假单胞菌CRPA感染的小鼠模型评价了噬菌体Pa_WF01的体内治疗效果和安全性，结果表明噬菌体Pa_WF01可用于治疗CRPA感染，缓解CRPA感染引起的炎症反应。另外，其与鲍曼不动杆菌噬菌体Ab_WF01组合可进一步促进抑菌效果。因此，噬菌体Pa_WF01作为一种新的潜在抗菌制剂具有广阔的应用前景，为临床应用噬菌体治疗CRPA感染提供理论依据和技术支撑。
附图说明
图1为噬菌体Pa_WF01的形态学特征；其中，A图为噬菌体Pa_WF01的纯化平板图片；B图为噬菌体Pa_WF01的透射电子显微镜照片。
图2为噬菌体Pa_WF01的生物学特征；其中，A图为噬菌体Pa_WF01在不同感染复数下的滴度柱状图；B图为噬菌体Pa_WF01的一步生长曲线；C图为噬菌体Pa_WF01在不同温度孵育后的滴度柱状图；D图为噬菌体Pa_WF01在不同pH孵育后的滴度柱状图；E图为噬菌体Pa_WF01在不同浓度氯仿孵育后的滴度柱状图；F图为CRPA在被感染噬菌体Pa_WF01后的生长曲线。
图3为噬菌体Pa_WF01的基因组图谱。
图4为噬菌体Pa_WF01的系统发育树。
图5为噬菌体Pa_WF01治疗CRPA感染小鼠的效果评价；其中，A图为治疗过程中小鼠的存活率曲线；B图为治疗1天后小鼠血清中TNF-α含量柱状图；C图为治疗1天后小鼠血清中IL-6含量柱状图。
图6为小鼠肝脏、脾脏和肺脏的组织切片H&E染色图，图中，红色箭头：有少量粒细胞浸润；绿色箭头：胞核碎裂，周围轻度出血；橙色箭头：细胞质中有圆形微泡，大量静脉充血；黄色箭头：肝细胞脂肪变性；黑色箭头：肝组织内肝细胞点状坏死；蓝色箭头：少量肝细胞颗粒变性。
图7为噬菌体Pa_WF01及其与噬菌体Ab_WF01的组合的体外抑菌平板图片。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合附图和具体的实施方式对本发明作进一步详细的说明。应理解，在下述本发明的实施方式中描述的具体的实施例仅作为本发明的具体实施方式的示例性说明，旨在用于解释本发明，而不构成对本发明的限制。在具体的实施方式中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近的范围。在具体的实施方式中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的耐碳青霉烯铜绿假单胞菌（Carbapenems-resistantPseudomonas aeruginosa，CRPA）、多重耐药肺炎克雷伯菌（Multidrug-resistantKlebsiella pneumoniae，MDR-Kp）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicinllin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）、耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌（Carbapenems-resistantAcinetobacter baumannii，CRAB）、多重耐药粪肠球菌（Multidrug-resistantEnterococcus faecalis，MDR-Ef）和耐药大肠杆菌（Carbapenem-resistantEscherichia coli，CREC）均由山东第二医科大学附属医院临床实验室提供，上述菌株从住院患者的血液、粪便、痰液等中分离获得，公众可从山东第二医科大学附属医院获得，或者经山东第二医科大学附属医院同意从山东第二医科大学(即申请人)处获得，上述生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中用到的噬菌体：
噬菌体Pa_WF01：于2024年4月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号：CCTCC NO: M 2024661。
噬菌体Ab_WF01：于2023年12月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏号为CCTCC NO: M 20232519。该噬菌体Ab_WF01已经在专利CN117431221A中公开，在本专利中不涉及该噬菌体Ab_WF01的保藏。
实施例1：噬菌体的分离纯化
污水样品收集自山东第二医科大学附属医院污水处理站。将污水样品以5000g离心10分钟去除杂质，然后用0.22μm微孔滤膜过滤去除细菌后获得污水过滤液。将CRPA接种于LB液体培养基中，置于37℃摇床振荡培养至菌液OD600=0.6（菌体浓度约为1×108CFU/mL）。将10 mL污水过滤液与10 mL LB液体培养基混合均匀，然后向混合液中添加200μL培养的CRPA菌液，于37℃摇床振荡培养过夜。第二天将培养液取出以5000g离心10分钟取上清，上清使用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后获得噬菌体原始分离液。通过斑点实验以CRPA为指示菌株检测有无噬菌斑的存在，使用双层琼脂平板法纯化噬菌体至少三次，直到显示出大小均一的单一斑块。纯化结果如图1中的A图所示，在双层琼脂平板上观察到均匀的直径约为2-3mm的圆形透明斑块。
实施例2：噬菌体的生物学特性
（1）噬菌体的形态学观察
通过透射电子显微镜观察噬菌体的形态。将噬菌体附着在涂有碳的铜格栅上，并用2%磷钨酸负染色液染色5min，使用透射电子显微镜（Hitachi HT7700，Tokyo，Japan）在80kV下观察噬菌体的形态。
噬菌体的电子显微照片如图1中的B图所示，噬菌体仅有直径约为50nm的六边形头部、无尾。根据这些形态学特征和国际病毒分类委员会（ICTV）的规定，噬菌体在形态学上应为无尾噬菌体。
（2）噬菌体的宿主范围鉴定
将耐碳青霉烯铜绿假单胞菌（CRPA）、多重耐药肺炎克雷伯菌（MDR-Kp）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌（CRAB）、多重耐药粪肠球菌（MDR-Ef）和耐药大肠杆菌（CREC）分别涂布在哥伦比亚血琼脂平板上，于37℃的培养箱中孵育过夜。第二天，挑取平板上的单菌落转移到5 mL的LB液体培养基中，然后在37℃摇床振荡培养。利用细菌通用引物F27和R1492扩增16S rRNA基因对菌株进行鉴定，基因序列使用NCBI数据库的基本局部比对搜索工具（BLAST）进行序列比对。鉴定正确的菌株加入甘油后于-80℃长期保存。
通过斑点实验对上述临床耐药分离菌株（包括CRPA、MDR-Kp、MRSA、CRAB、MDR-Ef和CREC）进行检测来确定噬菌体的宿主范围。步骤如下：取100μL指数期的耐药菌株的菌液均匀涂布在LB琼脂平板上；将5μL噬菌体溶液滴在涂布耐药菌株的LB琼脂平板上，置于37℃培养箱过夜孵育，第二天观察有无裂解菌株形成的噬菌斑区域。斑点实验结果如表1所示，结果表明噬菌体对CRPA具有特异性裂解作用。因此，将该噬菌体命名为噬菌体Pa_WF01。
表1. 噬菌体的宿主范围和成斑率
注：裂解活性：“+”能产生噬菌斑，“-”不能产生噬菌斑；成斑率，通过计算每个耐药菌株的噬菌斑形成单位(PFUs)与指示菌株（非耐药铜绿假单胞菌）的PFUs之比来确定，“++”成斑率>1，“+”成斑率>0.1，“-”成斑率=0。
（3）噬菌体的最佳感染复数检测
为了确定噬菌体Pa_WF01的最佳感染复数（MOI），使用SM缓冲液对噬菌体Pa_WF01进行一系列10倍梯度稀释。为了评估噬菌体Pa_WF01能够有效抑制宿主细胞生长的最低浓度，用不同MOI的噬菌体Pa_WF01感染CRPA，并利用双层琼脂平板法检测不同MOI感染后噬菌体Pa_WF01的滴度。
结果如图2中的A图所示，当MOI为0.0001时，噬菌体滴度达到最高水平，约为4×108PFU/mL。因此，我们在后续的实验中以MOI=0.0001作为标准剂量。
（4）一步生长曲线
为了探究噬菌体Pa_WF01感染的潜伏期和爆发力大小，利用一步生长曲线法测定噬菌体Pa_WF01的感染动力学。按照MOI为0.0001将噬菌体Pa_WF01与CRPA混合，37℃孵育15分钟。将孵育后的样品12000rpm离心10分钟弃去上清液，用37℃预热的无菌LB液体培养基洗涤沉淀两次，离心后的颗粒重悬于20mL LB液体培养基中，然后置于37℃摇床、220rpm振荡，每隔10分钟收集样品用双层琼脂平板法检测噬菌体Pa_WF01滴度直至130分钟。采用文献所述方法计算潜伏期和爆发力大小（Kropinski，2018）。
噬菌体Pa_WF01的一步生长曲线如图2中B图所示，结果显示，噬菌体Pa_WF01的潜伏期约为15分钟，根据潜伏期内释放的噬菌体与最初感染的细菌的比例计算，噬菌体Pa_WF01的爆发力大小约为每个感染细胞124 PFU。
（5）热稳定性和pH稳定性
无菌条件下取7个1.5 mL EP管分别添加1mL噬菌体Pa_WF01溶液，并分别在4℃、25℃、37℃、50℃、60℃、70℃和80℃水浴锅孵育1小时后，将噬菌体Pa_WF01溶液置于冰上冷却10分钟，利用双层琼脂平板法测定不同温度下噬菌体Pa_WF01的滴度。
向LB液体培养基中加入1M的盐酸溶液或氢氧化钠溶液将pH调节为1至14，用0.22μm过滤器过滤除菌后向每个不同pH的500μL LB液体培养基中加入500μL噬菌体Pa_WF01溶液，于37℃水浴锅孵育1小时，利用双层琼脂平板法检测不同pH下噬菌体Pa_WF01的滴度。
噬菌体Pa_WF01的热稳定性测试结果如图2中的C图所示，噬菌体Pa_WF01在4~37℃活力较高，在25℃时表现出最高的活力，并且噬菌体Pa_WF01的热稳定性随着温度的升高而降低，当温度达到60℃时完全失去活力。
噬菌体Pa_WF01的pH稳定性测试结果如图2中的D图所示，噬菌体Pa_WF01在pH为6时显示出最佳活力，且在pH 4-12范围内仍保持活力；另外，pH的进一步增加或降低噬菌体Pa_WF01的活力完全丧失。
（6）氯仿敏感性
噬菌体蛋白质外壳中的脂质在将病毒基因组递送到宿主细胞中起关键作用（Peralta B等，2013）。为了测试噬菌体Pa_WF01病毒粒子是否含有脂质，在不同浓度的氯仿（0%、1%、2%或5%，质量百分比）下于37℃孵育噬菌体Pa_WF01 30分钟，利用双层琼脂平板法测定不同浓度氯仿下噬菌体Pa_WF01的滴度。
噬菌体Pa_WF01的氯仿敏感性测试结果如图2中的E图所示，发现不同浓度的氯仿处理后，噬菌体Pa_WF01均没有活力。结果表明，噬菌体Pa_WF01颗粒中存在脂质，并且噬菌体Pa_WF01不耐受氯仿。
（7）宿主细胞裂解活性检测
将宿主细菌CRPA接种于LB液体培养基中，按照MOI为0.0001用噬菌体Pa_WF01感染CRPA，置于37℃摇床、220rpm振荡培养，每隔1小时取样，用分光光度法测定OD600nm，检测细菌浊度，持续检测12小时。试验重复三次。以不添加噬菌体Pa_WF01作为对照。
宿主细菌CRPA的活性检测结果如图2中F图所示，结果显示，在对照组中，未感染噬菌体Pa_WF01的CRPA菌液的吸光度迅速增加，9小时后OD600nm达到1.5，然后进入平台期；与对照组相比，用噬菌体Pa_WF01感染的宿主细菌CRPA生长受到显著抑制，这表明噬菌体Pa_WF01对CRPA具有较好的抑制效率。
实施例3：噬菌体全基因组测序与生物信息学分析
按照制造商的说明书，使用TIANamp病毒DNA/RNA提取试剂盒（Tiangen，Beijing，China）从噬菌体Pa_WF01中提取基因组DNA。使用上海生工生物的Illumina测序平台进行噬菌体Pa_WF01全基因组测序。SPAdes软件用于从头基因组组装（Bankevich et al.，2012）。开放阅读框架（ORF）通过使用RAST的快速注释进行注释（Aziz-RK等，2008）。使用tRNAscanSE对基因组序列中的tRNA进行预测（Chan-PP等，2019）。将噬菌体Pa_WF01基因组中的毒力因子和抗生素抗性基因与VFDB数据库（http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm）和CARD数据库（https://card.mcmaster.ca/）进行比对。噬菌体Pa_WF01基因组的环形图谱由CGview服务器构建（Grant JR和Stothard P，2008），在可视化环形基因组中，最内圈展示GC偏移，中间环表示GC含量，最外两个圆圈表示噬菌体Pa_WF01的预测编码蛋白序列（CDS），箭头表示转录方向，不同的CDS代表不同的功能：形态发生蛋白、宿主裂解蛋白、DNA复制和代谢蛋白、假定蛋白杂类RNA。
噬菌体Pa_WF01基因组的环形图谱如图3所示，噬菌体Pa_WF01的全基因组序列大小为73369bp，GC含量为54.78%。在噬菌体Pa_WF01基因组中包含94个开放阅读框（ORF），ORF的编码密度为94.07%，共覆盖69020bp。ORF的最大长度为10197bp，最小长度为153bp，这些ORF分别编码噬菌体Pa_WF01的DNA组分和假定蛋白。在噬菌体Pa_WF01的基因组中没有检测到耐药或毒力基因，表明噬菌体Pa_WF01几乎没有介导抗生素抗性基因水平转移的能力。噬菌体Pa_WF01功能基因注释被预测为五组：参与DNA复制/修饰、代谢、裂解蛋白、DNA包装和噬菌体结构相关蛋白。
在NCBI数据库中，用BLAST对噬菌体Pa_WF01与其他噬菌体的相似性进行了比较分析，结果表明，铜绿假单胞菌噬菌体YH30（GenBank编号：NC_029101.1）与噬菌体Pa_WF01的相似性最高，显示出96.92%的同一性和96%的查询覆盖率。
实施例4：噬菌体系统进化分析
基于噬菌体Pa_WF01的全基因组序列进行系统发育分析，用Clustal W算法进行多重比对，构建系统发育树，以推断噬菌体Pa_WF01与其他噬菌体的进化关系。系统发育树是通过MEGA X软件使用邻位连接法构建的，设置bootstrap为1000（Kumar S等，2018）。
噬菌体Pa_WF01的系统发育树如图4所示，在每个分支上显示1000个重复的引导值，GenBank的加入编号列在噬菌体名称之前，噬菌体按属用颜色编码：蓝色，Litunavirus属；橙色，Luzseptimavirus属；紫色，Littlefixvirus属；绿色，Inbricusvirus属；噬菌体Pa_WF01用红色表示。由图可知，噬菌体Pa_WF01与铜绿假单胞菌噬菌体vB_Pae_HMKU_23聚在一起，二者均属于无尾噬菌体Caudoviricetes纲Schitoviridae科Litunavirus属成员，这个结果也被实施例2中的透射电子显微镜结果证实。以上结果表明，噬菌体Pa_WF01是一种新型的无尾噬菌体。
实施例5：小鼠感染模型中的噬菌体治疗
实验小鼠：SPF级6-8周C57BL/6j小鼠（随机雄性/雌性），购自济南朋悦实验动物有限公司。
统计分析：所有数据均使用GraphPad Prism 8.0软件进行分析。通过非配对t检验确定两组之间差异的显著性，通过方差分析确定多组之间差异显著性。当p＜0.01时，这些值被认为是差异显著。
（1）小鼠感染模型中的噬菌体治疗
取50只小鼠，随机分为5组，每组10只小鼠。其中3组为感染组，腹腔注射100μLCRPA菌液（1×108CFU/mL），感染1小时后，3组小鼠分别对应注射100μL噬菌体Pa_WF01溶液（MOI =0.0001）、100μL亚胺培南溶液（IPM；5 mg/mL）、100μL SM缓冲液；其余2组为对照组，腹腔注射100μL PBS缓冲液，1小时后，2组小鼠分别对应注射100μL SM缓冲液、100μL噬菌体Pa_WF01溶液。实验中所有小鼠间隔48小时腹腔注射100μL环磷酰胺溶液（200mg/kg）连续免疫7天，每天观察各组小鼠的存活率。为了检测细胞因子，在治疗1天后对小鼠实施安乐死后立即心脏采血，血清储存在-80℃下，通过ELISA试剂盒（Solarbio）检测血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的浓度进行细胞因子分析。
治疗过程中小鼠的存活率结果如图5中的A图所示，未感染CRPA的小鼠（治疗阶段仅给予SM缓冲液或噬菌体Pa_WF01）在7天后仍然存活，存活率达到100%；所有感染CRPA的小鼠不经过治疗（治疗阶段仅给予SM缓冲液）在感染后第4天全部死亡；而经噬菌体Pa_WF01治疗的感染CRPA小鼠在感染后第7天达到60%的存活率，且经噬菌体Pa_WF01治疗4天后，噬菌体Pa_WF01治疗组的存活率（60%）高于抗生素IPM治疗组的存活率（30%），说明与IPM相比，噬菌体Pa_WF01具有更好的治疗效果，表明噬菌体Pa_WF01可用于治疗CRPA感染。
治疗1天后小鼠血清中TNF-α和IL-6的水平如图5中的B图和C图所示，发现未经治疗的细菌CRPA感染组小鼠的血清中TNF-α和IL-6水平显著高于噬菌体Pa_WF01治疗的细菌CRPA感染组小鼠（p<0.01），这表明噬菌体Pa_WF01治疗可以减少CRPA感染引起的促炎反应。另外，IPM治疗能降低血清中TNF-α的浓度（p<0.05），但明显高于噬菌体Pa_WF01治疗组（p<0.01）。结果表明，噬菌体Pa_WF01对可替代IPM，缓解CRPA感染引起的炎症反应。
（2）小鼠组织器官的病理学观察
为了分析小鼠肝脏、脾脏和肺脏的病理组织学变化，在治疗第3天处死小鼠，立即收集肝脏、脾脏和肺脏置于4%多聚甲醛中固定24小时，然后通过分级无水乙醇脱水、石蜡包埋，切3μm厚的组织切片后进行H&E染色。光学显微镜下观察小鼠各器官的病理变化（200×）。
各组经H&E染色的小鼠肝脏、脾脏和肺脏组织切片如图6所示，未经感染的对照组小鼠的各器官均未见明显病理改变，组织细胞结构正常；未经治疗和经IPM治疗的感染组小鼠肝脏组织可见肝细胞小灶性坏死（黑色箭头），所有感染组小鼠的脾脏组织边缘区及红髓内可见少量粒细胞（红色箭头），各感染组之间差异不显著，然而，在经噬菌体Pa_WF01治疗的感染组小鼠的器官中，这些病理结果大多有所改善，偶见少量肝细胞脂肪变性（黄色箭头），表明噬菌体Pa_WF01具有治疗CRPA感染的潜力。
实施例6：噬菌体Pa_WF01及其组合物抑菌效果检测
将宿主细菌CRPA均匀涂布在LB琼脂平板上，然后分别单独取噬菌体Pa_WF01溶液5μL以及其与鲍曼不动杆菌噬菌体Ab_WF01的组合溶液5μL（滴度比1:1）滴在涂有CRPA的LB琼脂平板上，置于37℃培养箱孵育过夜，第二天观察LB琼脂平板上有无噬菌斑存在。
结果如图7所示，圆形透明斑块表示CRPA上的噬菌斑，左侧为噬菌体Pa_WF01，右侧为噬菌体Pa_WF01和鲍曼不动杆菌噬菌体Ab_WF01的组合，透明斑块中的小白点表示抗性菌株，结果表明单独的噬菌体Pa_WF01的抑菌效果较好，仅有少量抗性菌株，而噬菌体Pa_WF01和鲍曼不动杆菌噬菌体Ab_WF01的组合抑菌效果更好，几乎无抗性菌株。
Claims (8)
1. 一种铜绿假单胞菌噬菌体（Pseudomonas aeruginosa phage）Pa_WF01，其特征在于，于2024年4月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号：CCTCC NO: M 2024661。
2.一种含有权利要求1所述的铜绿假单胞菌噬菌体Pa_WF01的噬菌体制剂。
3.如权利要求2所述的噬菌体制剂，其特征在于，所述噬菌体制剂还包括噬菌体Ab_WF01。
4.权利要求1所述的铜绿假单胞菌噬菌体Pa_WF01或者权利要求2所述的噬菌体制剂在制备抑制或杀灭铜绿假单胞菌的产品中的应用，所述铜绿假单胞菌为耐碳青霉烯铜绿假单胞菌。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品包括药物、饲料、杀菌剂、消毒剂、清洁剂。
6.一种抑制或杀灭铜绿假单胞菌的产品，其特征在于，包括权利要求1所述的铜绿假单胞菌噬菌体Pa_WF01或者权利要求2所述的噬菌体制剂；所述铜绿假单胞菌为耐碳青霉烯铜绿假单胞菌。
7.如权利要求6所述的产品，其特征在于，所述产品包括药物、饲料、杀菌剂、消毒剂、清洁剂。
8.如权利要求7所述的产品，其特征在于，所述药物为体外治疗药物或体内治疗药物。
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN111789132A (zh) * | 2020-07-04 | 2020-10-20 | 菲吉乐科(南京)生物科技有限公司 | 一种新型复合制剂及其在细菌性病害中的应用 |
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|---|---|---|---|---|
| CN104140957B (zh) * | 2013-05-07 | 2017-04-26 | 兰州大学 | 一株可裂解多重耐药铜绿假单胞菌的噬菌体及其治疗感染的应用 |
| CN116478936A (zh) * | 2023-05-23 | 2023-07-25 | 河南省中医院（河南中医药大学第二附属医院） | 一株高效裂解耐碳青霉烯铜绿假单胞菌的噬菌体及应用 |
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2024
- 2024-06-21 CN CN202410805183.8A patent/CN118374460B/zh active Active
Patent Citations (1)
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| CN111789132A (zh) * | 2020-07-04 | 2020-10-20 | 菲吉乐科(南京)生物科技有限公司 | 一种新型复合制剂及其在细菌性病害中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
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| Therapeutic effect and anti-biofilm ability assessment of a novel phage, phiPA1-3, against carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa;Yu-Chuan Tsaia et al.;Virus Research;20231231;摘要，第4页3.1-第8页3.10，第11页左栏第3-4段 * |
| Yu-Chuan Tsaia et al..Therapeutic effect and anti-biofilm ability assessment of a novel phage, phiPA1-3, against carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa.Virus Research.2023,摘要，第4页3.1-第8页3.10，第11页左栏第3-4段. * |
Also Published As
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