CN116286678A - 一种变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07及其应用 - Google Patents
一种变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116286678A CN116286678A CN202310428198.2A CN202310428198A CN116286678A CN 116286678 A CN116286678 A CN 116286678A CN 202310428198 A CN202310428198 A CN 202310428198A CN 116286678 A CN116286678 A CN 116286678A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- phage
- proteus
- pmim
- bacteria
- amoebobacter
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 title claims abstract description 98
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 14
- 241000191001 Thiocapsa Species 0.000 claims description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 9
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 claims description 8
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 claims description 8
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims description 8
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 claims description 7
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 claims description 6
- 241000588770 Proteus mirabilis Species 0.000 claims description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 claims description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 208000022274 Proteus Infections Diseases 0.000 abstract description 6
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 abstract description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 abstract description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 33
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 7
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 7
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 4
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 2
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxotungsten Chemical compound O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.OP(O)(O)=O IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 101710183434 ATPase Proteins 0.000 description 1
- 206010000117 Abnormal behaviour Diseases 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010033546 Pallor Diseases 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 208000011501 Proteus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 101710166729 Tail fiber protein Proteins 0.000 description 1
- 101710091588 Tripartite terminase subunit 3 Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000011331 genomic analysis Methods 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000010871 livestock manure Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011076 safety test Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000010865 sewage Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 208000019206 urinary tract infection Diseases 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/40—Viruses, e.g. bacteriophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
- A01P1/00—Disinfectants; Antimicrobial compounds or mixtures thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K10/00—Animal feeding-stuffs
- A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
- A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
- A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
- C12N2795/10111—Myoviridae
- C12N2795/10121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
- C12N2795/10111—Myoviridae
- C12N2795/10131—Uses of virus other than therapeutic or vaccine, e.g. disinfectant
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
- C12N2795/10111—Myoviridae
- C12N2795/10132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本申请涉及微生物技术领域，尤其涉及一种变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07及其在防治变形杆菌引起疾病的药物中的应用；本申请公开了一种变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07，保藏编号为CGMCC NO.23812；变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07具有广谱杀菌效果，大大拓宽了其杀菌范围，增加其杀菌活性，可大幅度地提高变形杆菌感染的治愈率；变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07无毒副作用，安全性高，且便于大规模的生产；该变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07对环境中的变形杆菌可进行有效杀灭。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07及其在防治变形杆菌引起疾病的药物中的应用。
背景技术
变形杆菌是一种人畜共患病原菌，广泛存在于自然界中，主要存在于水源、土壤、人和动物的呼吸道、消化道及排泄物中，可以引起肺炎，肠炎，尿路感染及食物中毒等多种疾病，严重可导致死亡。奇异变形杆菌属于变形杆菌的一种，是致病性较为严重的致病菌。我国就有很多猪，鸡，犊牛发生变形杆菌导致的疾病，造成了严重的经济损失。近些年变形杆菌致病的情况越来越多，主要临床表现为食欲废绝、精神沉郁、被毛粗乱、皮肤苍白、体温升高、乏力、咳嗽、呼吸加快，偶有呕吐、腹泻，重症者鼻孔流出泡沫样黏液，即使康复，生长发育也会严重受阻，饲养价值大大降低，防治变形杆菌感染成为动物养殖的一个关键因素。
目前，抗生素是治疗变形杆菌的首选药物，但是由于近几年来抗生素药物的滥用，导致细菌本身的耐药性越来越强，变形杆菌已经对大部分抗生素产生了耐药性，而且多重耐药严重。变形杆菌在人食物中毒中也十分重要，近年来也成为人类肠道感染的重要条件致病菌之一。变形杆菌的耐药性在人和家畜、家禽上都比较严重，因此急需要寻找一种能够代替抗生素的安全有效的药物。
噬菌体是感染细菌的病毒，是一种普遍存在的生物体，只要有细菌的地方就会有噬菌体的存在。噬菌体的靶向性很强，一旦病原菌表面含有可以被噬菌体识别的受体就会迅速吸附，在裂解特定的细菌后，噬菌体会停止繁殖逐渐排出体外，无毒，杀菌效果好且不会产生耐药性，因此，噬菌体是超级细菌的克星。噬菌体因为存在广泛，研发时间短，特异性强，增殖速度快，而且安全有效，无残留的特点，可以作为抗生素的一个替代品，其发展具有很大的前景。
目前还没有发现安全有效、裂解谱宽的噬菌体制剂，用于防治变形杆菌所造成的相关疾病，因此，还需要进一步进行新噬菌体的筛选和研究工作。
发明内容
针对上述问题，本申请提供了一种可高效杀灭变形杆菌的噬菌体及其应用，其裂解谱宽，可高效裂解从养殖场分离到的变形杆菌临床菌株，还为养殖场的环境消毒提供一种安全、有效、无污染的噬菌体产品。
本发明的技术方案具体如下：
第一方面，本申请提供一种变形杆菌噬菌体，采用如下的技术方案：
一种从养殖场污水中筛选出的变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)，被命名为变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07，该噬菌体已于2022年04月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国，北京，保藏号为CGMCC NO.23812；该噬菌体为肌尾噬菌体，噬菌体在固体培养基上可以形成透亮噬菌斑，形态大小一致，边缘清晰规则，直径为0.5mm。
在电子显微镜下观察到：变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07的形态，其头部长90-95nm，头宽80-85nm，尾长110-115nm，属于肌尾噬菌体科。
变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07的原始效价为9.55×109PFU/mL。
变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07在40℃、50℃和60℃作用1h后效价保持在5×109PFU/mL；70℃作用30min和60min后噬菌体下降3个数量级，说明变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07的热稳定性较高。
变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07在pH4-10范围内噬菌体vB_PmiM_PF07效价不变或略有下降，效价在108PFU/mL以上，说明变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07能够耐受一定的弱酸强碱环境。
变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07的最佳感染复数是0.1，该条件下噬菌体感染宿主菌产生子代噬菌体的滴度为1.23×1010PFU/mL，在7个感染复数中噬菌体滴度最高。
第二方面，本申请提供一种变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07在制备预防和/或治疗变形杆菌感染的药物中的应用，采用如下的技术方案：
一种变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07在制备预防和/或治疗变形杆菌感染的药物中的应用。
本申请中术语“预防”是指包括通过给予所述组合物来抑制或延迟所述疾病的所有行为。本文中术语“预防”是指包括通过给予所述组合物而使所述疾病好转或有所改善的所有行为。
第三方面，本申请提供一种变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07在作为饲料添加剂中的应用，采用如下的技术方案：
一种变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07在作为饲料添加剂中的应用。
第四方面，本申请提供一种变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07在作为环境消毒剂中的应用，采用如下的技术方案：
一种变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07在作为环境消毒剂中的应用；其中，所述养殖场环境包括饲料、水源、料槽、笼子、地面、墙壁、粪便和垫料。
第五方面，本申请提供一种噬菌体制剂，采用如下的技术方案：
一种噬菌体制剂，包括变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07。
优选的，噬菌体制剂还包括药学上可接受的载体。
优选的，噬菌体制剂还包括不同种类细菌的特定病原菌的噬菌体。
优选的，制剂形式为口服给药剂型、外用剂型或肠外给药剂型；具体而言，可以经由皮肤、口服、经直肠、外用、腹膜内、肌内、鼻内和吸入途径来给予本申请的噬菌体制剂。
第六方面，本申请提供一种饲料添加剂，采用如下的技术方案：
一种饲料添加剂，包括变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07。
优选的，饲料添加剂还包括不同种类细菌的特定病原菌的噬菌体。
第七方面，本申请提供一种环境消毒剂，采用如下的技术方案：
一种环境消毒剂，包括变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07，其中噬菌体的浓度为1×109PFU/mL以上。
优选地，所述环境消毒剂还包含其他用于抑制或消灭环境中细菌的活性成分。
使用变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07对变形杆菌污染的地面进行消毒后，1h后地面变形杆菌的数量下降一个梯度以上，2h后地面的变形杆菌的数量下降至10CFU左右，3h后在地面上已经检测不到变形杆菌，说明噬菌体vB_PmiM_PF07可以有效杀灭环境中的变形杆菌。
第八方面，本申请还提供一种检测试剂盒，采用如下的技术方案：
一种检测试剂盒，包括上述噬菌体组合物，该试剂盒用于检测变形杆菌噬菌体污染导致的疾病。
本发明具有以下有益效果：
1、本申请的变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07，裂解能力强，可用于防治由变形杆菌感染导致的疾病。
2、本申请的变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07，具有广谱杀菌效果，对环境中的变形杆菌可进行有效杀灭。
3、本申请的变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07，无毒副作用，安全性高，且便于大规模的生产。
附图说明
图1为变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07噬菌斑照片；
图2为变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07电镜照片；
图3为变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07的热稳定性图；
图4为变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07的pH稳定性图；
图5为变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07的杀菌效果时效图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
本实施例中：
上层营养琼脂的配方为：每100g配方中含有琼脂0.8g、牛肉浸粉0.3g、蛋白胨1g、Nacl0.5g、NaoH 200μL。
下层营养琼脂的配方为：每100g配方中含有琼脂2g、牛肉浸粉0.3g、蛋白胨1g、Nacl 0.5g、NaoH 200μL。
实施例1：噬菌体的分离和纯化培养
1、宿主菌的分离培养
实施例中的变形杆菌噬菌体的宿主菌为变形杆菌临床菌株，从养殖场感染变形杆菌的病料上取得。
取宿主菌接种于SS培养基上，培养过夜后，挑取单菌落接种于5mL的营养肉汤培养基中，37℃，170rpm摇床中振荡培养16h作为宿主菌培养物备用。
2、噬菌体的分离培养
将从养殖场取得的污水放入泡样瓶中，将200μL宿主菌加入泡样瓶中，然后加入营养肉汤培养基，37℃，170rpm摇床中振荡培养过夜。取过夜培养后的部分液体放于10mL离心管中，11000rpm离心10min，取上清液，用0.22μm滤器进行过滤，形成噬菌体原液。
将96孔板中每孔加入190μL的营养肉汤培养基，然后在分别加入5μL的宿主菌和噬菌体原液，每种宿主菌要设置一个对照组，对照组为195μL的营养肉汤和5μL的宿主菌；将96孔板放入37℃温箱中，培养5h，测OD600，计算OD值，噬菌体组比对照组OD值下降50％，将96孔板中的液体取出，用移液枪取100μL孔板中的液体加入900μL的营养肉汤中，进行10倍比稀释，稀释至10-6，然后将其与宿主菌混匀后放入37℃温箱孵育5min，噬菌体吸附于宿主菌，将噬菌体与宿主菌混合液加入上层营养琼脂(琼脂的质量浓度为0.8％)中，迅速混匀，倒在下层营养琼脂(琼脂的质量浓度为2％)的培养皿上，待凝固后，放入37℃温箱中培养4-5h，则出现单个噬菌斑。
3、噬菌体的抠斑纯化、增殖
无菌镊子抠取单个噬菌斑放入1mL营养肉汤中，摇床37℃，170rpm震荡浸出30min，11000rpm离心5min，取上清用双层平板法得到单个的噬菌斑，抠取单斑纯化3-5次，直至培养皿上出现大小、形态均一的噬菌斑。
各取100μL宿主菌和噬菌体抠斑浸出液加入到5mL营养肉汤中，再取100μL宿主菌加入另一个5mL营养肉汤中，作为对照，同时放入37℃，170rpm摇床中培养3-4h，待混合液变清亮，得到噬菌体增殖液。10倍比稀释噬菌体增殖液，双层平板法测效价，每个稀释度分别做3个平行样。变形杆菌噬菌体形成透亮空斑，大小、形态均一，边缘清晰规则，直径为0.5mm；通过上述方法分别分离纯化出噬菌体，命名为：变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07，如图1所示。
实施例2：噬菌体的形态学观察实验方法：取1×109PFU/mL噬菌体样品20μL滴于微孔铜网上，沉淀15min，用滤纸吸去多余的液体。在铜网上滴加15μL的质量浓度2％的磷钨酸(PTA)，染色5min，用滤纸吸去多余的染液，干燥后用透射电镜观察并拍照。
如图2的电镜图片所示，变形杆菌噬菌体的头部长90-95nm，头宽80-85nm，尾长110-115nm。根据病毒分类国际委员会(ICTV)的定义，噬菌体PF07的形态符合肌尾噬菌体科的特征，为肌尾噬菌体，将其命名为变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07。
实施例3：噬菌体的生物学特性研究
1、噬菌体vB_PmiM_PF07的生物学特性研究
(1)噬菌体的热稳定性检测
将9.55×109PFU/mL的变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07增殖液分别于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，水浴中作用30min、60min，每个温度设两个平行组。双层平板法测定噬菌体的效价。
结果可见，变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07在40℃、50℃和60℃作用1h后效价保持在5×109PFU/mL；70℃作用30min和60min后噬菌体下降3个数量级，80℃的高温作用下噬菌体失活，具体结果见图3，说明变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07的热稳定性较高。
(2)噬菌体的pH稳定性检测
取无菌试管中加入不同pH值(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)的NB肉汤4.5mL，各3支，置于37℃的水浴锅中，待温度稳定之后，各加入500μL 9.55×109PFU/mL的变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07增殖液，混匀37℃水浴作用1h、2h、3h。作用结束之后，向混合液中加入适量的HCl或者NaOH使混合液的pH值约为7，双层平板法测定噬菌体的效价。
具体结果见图4，可见在pH4-10范围内噬菌体vB_PmiM_PF07效价不变或略有下降，效价在108PFU/mL以上，在pH2-3及pH11-13中活性降低甚至完全失活，说明变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07能够耐受一定的弱酸强碱环境。
(3)噬菌体的最佳感染复数(MOI)测定
按照常规方法增殖变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07和宿主菌变形杆菌F37，测定噬菌体及宿主菌效价，并将变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07和宿主菌进行适当的稀释。按照感染复数为10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001的比例各取100μL变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07和宿主菌加入到NB肉汤中。于37℃，170rpm振荡培养至液体变澄清，记录液体澄清时间。11000rpm离心5min，双层平板法测定噬菌体的的效价。
变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07的最佳感染复数是0.1，该条件下噬菌体感染宿主菌产生子代噬菌体的滴度为1.23×1010PFU/mL，在7个感染复数中噬菌体滴度最高。
(4)噬菌体的体外裂解试验
按照一定的比例加入猪场分离的变形杆菌和变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07，变形杆菌的终浓度为1×108CFU/mL，变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07的终浓度分别为1×109PFU/mL，1×108PFU/mL，1×107PFU/mL，对照组加入与变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07相同量的无菌肉汤，将上述变形杆菌菌液分别和不同终浓度的变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07混合后在37℃温箱中培养。每隔一定的时间测定OD值直至混合液变清亮，涂布平板法测定作用一定时间后各组菌的残留量。
变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07对变形杆菌的裂解效果很好，3个不同浓度的噬菌体对变形杆菌菌株的裂解率能达到99.9％以上，只是时间长短不同。
实施例5：噬菌体裂解谱的测定
变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07噬菌体裂解谱的测定
采用双层平板法测定噬菌体的裂解谱，步骤如下：按照实施例1中的方法得到宿主菌的菌悬液，49株变形杆菌分别来源于患有变形杆菌疾病的养殖场动物。将变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07分别与49株变形杆菌铺双层平板，倒置培养过夜。
结果显示，用49株变形杆菌为宿主菌进行裂解谱的测定，噬菌体vB_PmiM_PF07能裂解其中的49株，裂解率达100％。
表1变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07裂解谱
实验结果显示：本申请的变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07对49株变形杆菌的裂解率达100％。
实施例6：噬菌体的基因组分析
提取变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07的基因组，进行全基因组测序，对其序列进行分析：噬菌体vB_PmiM_PF07的基因组大小为161372bp，基因组序列A、G、C、T 4种碱基所占的比例分别为35.03％、16.47％、14.58％、33.92％，G+C％含量为31.05％。
经RAST预测分析，变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07基因组含有250个开放阅读框(ORFs)；使用在线工具BLASTp和保守域数据库(CDD)分别对变形杆菌噬菌体vB_RanS_PT24的250个ORFs进行比对，其中，变形杆菌噬菌体vB_RanS_PT24含已知编码功能蛋白96个，其余ORFs为假想蛋白。
变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07基因组含有250个开放阅读框(ORFs)；使用在线工具BLASTp和保守域的基因组中：与噬菌体宿主识别相关的尾部纤维(phage tail fiberprotein)蛋白基因序列见SEQ ID No.1，高度保守的末端酶大亚基(terminase largesubunit)蛋白基因的序列见SEQ ID No.2，DNA聚合酶(DNA polymerase)基因的序列见SEQIDNo.3。
表2噬菌体的vB_PmiM_PF07基因序列信息表
实施例7：变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07的安全性试验
选择体重为18-20g的健康BALB/C小鼠20只，雌雄各半，分成1个实验组和1个对照组，每组小鼠雌雄各半，分别灌服纯化的变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07增殖液和营养肉汤各200μL，连续灌服7天，观察小鼠的行为表现，并剖检观察小鼠脏器的变化。
结果可见，实验组和对照组小鼠行为无异常，剖检肝脏、肺脏、心脏、脾脏、肾脏等脏器正常，与对照组无明显差别。
实施例8:变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07对猪场中变形杆菌的消毒效果将在猪场中分离的变形杆菌菌液浓度稀释至1×104CFU/mL，对照组先将稀释至1×104CFU/mL的变形杆菌菌液1mL均匀喷洒在1m2的地面上，然后均匀喷洒等体积的PBS；实验组先将稀释至1×104CFU/mL的变形杆菌菌液1mL均匀喷洒在1m2的地面上，然后将稀释至1×109PFU/mL的变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07均匀喷洒在地面上，每组2个重复。每隔1h，在相同面积的地面采样，使用平板计数法检测地面变形杆菌的数量，共检测5h。
结果可见，使用变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07对变形杆菌污染的地面进行消毒后，平板计数结果显示1h后地面变形杆菌的数量下降一个梯度以上，2h后地面的变形杆菌的数量下降至10CFU左右，3h后在地面上已经检测不到变形杆菌，对照组地面变形杆菌的数量一直处于上升状态，如图5，说明噬菌体vB_PmiM_PF07可以有效杀灭环境中的变形杆菌。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种变形杆菌噬菌体，其特征在于：所述变形杆菌噬菌体（Proteus mirabilisphage）被命名为变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07，保藏编号为CGMCC NO.23812。
2.一种如权利要求1所述变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07在制备预防和/或治疗变形杆菌感染的药物中的应用。
3.一种如权利要求1所述变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07在作为饲料添加剂中的应用。
4.一种如权利要求1所述变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07在作为环境消毒剂中的应用。
5.一种噬菌体制剂，其特征在于：包括权利要求1所述变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07。
6.根据权利要求5所述的噬菌体制剂，其特征在于：噬菌体制剂还包括药学上可接受的载体。
7.根据权利要求6所述的噬菌体制剂，其特征在于：制剂形式为口服给药剂型、外用剂型或肠外给药剂型。
8.一种饲料添加剂，其特征在于，包括权利要求1所述变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07。
9.一种环境消毒剂，其特征在于，包括权利要求1所述变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07。
10.根据权利要求9所述的环境消毒剂，其特征在于：噬菌体的浓度为1×109PFU/mL以上。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310428198.2A CN116286678A (zh) | 2023-04-20 | 2023-04-20 | 一种变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310428198.2A CN116286678A (zh) | 2023-04-20 | 2023-04-20 | 一种变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116286678A true CN116286678A (zh) | 2023-06-23 |
Family
ID=86825969
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310428198.2A Pending CN116286678A (zh) | 2023-04-20 | 2023-04-20 | 一种变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116286678A (zh) |
-
2023
- 2023-04-20 CN CN202310428198.2A patent/CN116286678A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112029732B (zh) | 一种耐高温宽裂解谱的沙门氏菌噬菌体及其组合物 | |
| US20210046131A1 (en) | Wide-spectrum salmonella phage and application thereof | |
| CN111172119B (zh) | 具有宽裂解谱的新副溶血弧菌噬菌体、其特异性引物及其应用 | |
| CN113416712B (zh) | 一株宽裂解谱沙门氏菌噬菌体及其应用 | |
| CN111254121B (zh) | 一种沙门氏菌噬菌体及在防治沙门氏菌感染的疾病的药物中的应用 | |
| CN113583971B (zh) | 一株可同时裂解大肠杆菌的沙门氏菌噬菌体及其应用 | |
| CN114717199B (zh) | 一株不具转导耐药基因能力的沙门菌噬菌体ckt1及其应用 | |
| CN113430176B (zh) | 一株稳定高效的烈性沙门氏菌噬菌体rdp-sa-21004及其应用 | |
| CN113201501A (zh) | 一株具有跨种裂解能力的弧菌噬菌体及其应用 | |
| CN111363724B (zh) | 一种新型噬菌体、噬菌体混合制剂及其在防治水貂出血性肺炎的药物中的应用 | |
| CN113583966B (zh) | 一株烈性沙门氏菌噬菌体及其应用 | |
| CN117586966B (zh) | 一株耐酸碱产气荚膜梭菌噬菌体rdp-cp-22005及其应用 | |
| CN110964700B (zh) | 一株马流产沙门氏菌噬菌体及其应用 | |
| CN106795498B (zh) | 噬菌体、包括其的组合物及其用途 | |
| CN116083374A (zh) | 一株耐高温鸡白痢沙门氏菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用 | |
| CN114940977A (zh) | 一株鸭沙门氏菌噬菌体、其噬菌体组合物及其在防治鸭沙门氏菌感染的疾病中的应用 | |
| CN116286678A (zh) | 一种变形杆菌噬菌体vB_PmiM_PF07及其应用 | |
| CN115029323A (zh) | 一种耐药型金黄葡萄球菌噬菌体sp160及其在制备抑菌剂中的应用 | |
| KR20180073489A (ko) | 신규한 녹농균 특이 박테리오파지 pa4 및 이를 포함하는 항균 조성물 | |
| CN114480307B (zh) | 一株巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS30、其噬菌体组合物及其应用 | |
| CN117737001B (zh) | 一种防治犬细菌性腹泻的大肠杆菌噬菌体及其应用 | |
| CN118374460B (zh) | 一种铜绿假单胞菌噬菌体及其应用 | |
| CN114703151B (zh) | 一株巴氏杆菌噬菌体vB_PmuP_PS07、其噬菌体组合物及其应用 | |
| CN113046328B (zh) | 一株化脓隐秘杆菌噬菌体及其医用用途 | |
| CN116606815A (zh) | 一株克雷伯氏菌噬菌体及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |