CN113201501A - 一株具有跨种裂解能力的弧菌噬菌体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株具有跨种裂解能力的弧菌噬菌体及其应用。所述具有宽裂解谱的弧菌噬菌体，拉丁名为Vibrio parahaemolyticus，被命名为vB_VpaS_PG28，保藏编号为CGMCC NO.16393，于2018年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物学中心；优选地，所述弧菌噬菌体能够裂解副溶血弧菌和溶藻弧菌，上述噬菌体对副溶血弧菌和溶藻弧菌具有高效的跨种裂解活性，所述噬菌体单次泼洒养殖水体后，能够显著降低水体中副溶血弧菌的数量；将噬菌体拌料后饲喂或将对虾浸浴噬菌体，能够有效预防和治疗由副溶血弧菌引起的感染，提高对虾成活率。

Description

一株具有跨种裂解能力的弧菌噬菌体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株具有跨种裂解特征的宽裂解谱的副溶血弧菌噬菌体及其应用。

背景技术

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是革兰氏阴性嗜盐菌，其菌体呈杆状、弧状或丝状，大部分菌体在液体培养基中有单端鞭毛和侧鞭毛，能运动并可以黏附。副溶血弧菌可游离在水中，也可附着在活动或静止的物体上，如浮游动物、鱼类、贝类及悬浮颗粒的表面，是一种在海洋和河口环境中常见的细菌。副溶血弧菌可在10～44℃(最适温度35～37℃)、pH＝5～11、NaCl含量为3～8％的条件下生长。溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是革兰氏阴性嗜盐菌，其菌体呈短杆状，无芽孢、荚膜,单独存在或尾端相连成“C”或“S”形，兼性厌氧海生弧菌,适宜温度为17～35℃。

副溶血弧菌常常从海产品中分离出来，普遍存在于对虾、蟹类、牡蛎、贻贝和蛤蜊等海产品中，其中对虾养殖时受到副溶血弧菌的影响尤为明显。副溶血弧菌是急性肝胰腺坏死综合征(AHPND，acute hepatopancreatic necrosis disease)的致病菌，是对虾养殖场一种新型的爆发性的病害，即早期死亡综合征(EMS，early mortality syndrome)。该病最早于2009年在中国海南首次报道，主要危害南美白对虾和斑节对虾，具有致死率高、发病急、传染性强等特点。该病害已经对国内及全球对虾养殖业造成巨大冲击，使得对虾产量急剧下降并造成了严重的经济损失。

溶藻弧菌广泛分布于世界各地海水及河口处，并且数量居海水类弧菌之首,但其为嗜温菌，从夏季到冬季,由赤道向两极随着温度的降低其数量也明显减少。另外,溶藻弧菌也大量分布在海洋动物中，是鱼、虾、贝等海水养殖动物的条件致病菌。

目前，对弧菌疾病的防治方法多停留在改良养殖环境、改善虾苗的抗病性、使用化学性药物和抗生素进行预防和治疗等方面。随着抗生素及化学药物的大量使用，水体严重污染，水产品的品质明显降低。近年来，人们更倾向采用生物方法进行防治，噬菌体制剂得到大力发展。

噬菌体(Bacteriophage，Phage)是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物病毒的总称，其体积微小、结构简单，不具备细胞结构，只能寄生生活，分布十分广泛，凡是细菌存在之处几乎都有相应的噬菌体。利用噬菌体制剂在治疗细菌性水产养殖疾病方面有诸多优势：

1)对细菌耐药性适应性强，虽然细菌也会对噬菌体产生抗性，然而噬菌体能够适应宿主生物的变异，从而裂解宿主菌；

2)专一性强，噬菌体只针对其特定的细菌病原菌作为宿主，不会破坏正常菌群；

3)无残留、无毒害，噬菌体具有宿主依赖性，随宿主的清除而消亡，不会残留在动物体内，而且噬菌体的降解终产物为氨基酸和核苷酸对人和动物无影响。

目前，关于副溶血弧菌噬菌体的应用，仅见于对食品表面和器具表面的消毒，将副溶血弧菌噬菌体制剂用作养殖环境水体消毒、饲料添加剂等还未见报道。此外，公开的副溶血弧菌噬菌体都具有相同的缺点，即裂解谱较窄，不具备跨种裂解的特点。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一株具有跨种裂解能力的高效裂解活性的副溶血弧菌噬菌体及应用。该副溶血弧菌噬菌体具有跨种裂解能力及高效的裂解活性，可被用于防治因副溶血弧菌和溶藻弧菌感染导致的疾病，也可制备为水体消毒剂应用于水产养殖，旨在解决水产养殖过程中因副溶血弧菌和溶藻弧菌感染而导致发病急、改水慢等问题。

本发明的技术方案如下：

本发明一个方面提供了一种具有宽裂解谱的弧菌噬菌体，其拉丁名为Vibrioparahaemolyticus，被命名为vB_VpaS_PG28，保藏编号为CGMCC NO.16393，于2018年9月26日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物学中心。

在本发明的技术方案中，所述的弧菌噬菌体基因组大小为77598bp，为双链DNA。

在本发明的技术方案中，所述的弧菌噬菌体基因组含有与噬菌体宿主裂解相关的细胞壁水解酶，基因序列见序列表SEQ ID No.1，位置分别为72760-73029bp。

在本发明的技术方案中，所述的弧菌噬菌体基因组含有保守的dCTP脱氨酶，基因序列见序列表中SEQ ID No.2，位置为59674-60225bp

在本发明的技术方案中，所述的副溶血弧菌噬菌体为长尾噬菌体科。

本发明另一个方面提供所述副溶血弧菌噬菌体在制备预防或治疗副溶血弧菌或溶藻弧菌引起的疾病的药物中的用途。

在本发明的技术方案中，所述的疾病选自对虾早期死亡综合症(EMS偷死病)或对虾急性肝胰腺坏死病(AHPNS)的弧菌病。

本发明另一个方面提供了一种治疗或预防副溶血弧菌或溶藻弧菌引起的疾病的药物，其包括本发明所述的副溶血弧菌噬菌体。

在本发明的技术方案中，所述的药物为外用药物或饲料添加剂。

本发明另一个方面提供了一种水体消毒用添加剂，其包括本发明所述的弧菌噬菌体。

可选地，上述噬菌体通过拌料口服给药，饲喂0.5h后即可在对虾肝胰腺中检测到噬菌体，饲喂一次可在对虾肝胰腺中存在3d以上。通过饲喂噬菌体浸润后的饲料，可使因肌肉注射致病性副溶血弧菌发病的南美白对虾的死亡率得到有效控制，与对照相比，可显著提高对虾存活率。

优选地，所述疾病为对虾急性肝胰腺坏死综合征。本发明的副溶血弧菌噬菌体vB_VpaS_PG28可为控制由副溶血弧菌感染引起的急性肝胰腺坏死综合征提供环保新药。

本发明还提供所述副溶血弧菌噬菌体在制备防治水产品在养殖、运输及保存过程中的细菌污染的制剂中的用途。

优选地，水体消毒剂的有效成分为上述噬菌体vB_VpaS_PG28，使用前噬菌体制剂的浓度为1×10¹⁰PFU/mL以上。上述水体消毒剂使用方法简便，可有效减少养殖环境中的副溶血弧菌和溶藻弧菌等致病性弧菌的数量。

优选地，所述水体消毒剂可制备成不同剂型，用于对水体进行消毒或对病原菌的监测，剂型为粉剂、混悬剂、分散体或溶液剂。

优选地，所述水体消毒剂还包含其他相配合的杀菌活性成分或其他佐剂。如能延长副溶血弧菌噬菌体的有效期的保护剂。

本发明还提供一种对虾饲料添加剂，其包括上述噬菌体vB_VpaS_PG28。上述噬菌体作为饲料添加剂添加入南美白对虾的饲料中，能有效预防由于对虾感染副溶血弧菌而导致的对虾急性肝胰腺坏死综合征等疾病，降低死亡率，提高虾苗成活率，降低养殖风险。

优选地，饲料中副溶血弧菌噬菌体的含量为1×10⁸PFU/g以上。该条件下，对对虾因感染副溶血弧菌而导致的疾病的防治效果最佳。

此外，试验结果表明，对虾浸浴噬菌体后可有效控制因感染副溶血弧菌导致的死亡，显著提高对虾保护率。由此可推断，噬菌体制剂可用于南美白对虾虾苗分塘前的处理，能够预防副溶血弧菌感染，减少发病率，提高对虾成活率。

本发明实施例提供的具有高效跨种裂解活性的副溶血弧菌噬菌体及其应用具有以下有益效果：

1)上述噬菌体对副溶血弧菌和溶藻弧菌具有强烈的裂解作用，可由宿主菌特异性扩增，且增殖时间短，发酵产物效价高，为工业化生产噬菌体及其应用提供了噬菌体来源。

2)该噬菌体可制备用于治疗副溶血弧菌感染的药物，为控制由副溶血弧菌感染引起的对虾急性肝胰腺坏死综合征提供新型药物。所述噬菌体作为水体消毒剂使用时，单次泼洒养殖水体后，能够显著降低水体中副溶血弧菌和溶藻弧菌的数量；将噬菌体作为饲料添加剂拌料后饲喂南美白对虾，或者将对虾浸浴噬菌体，能够有效预防和治疗由副溶血弧菌引起的感染，提高对虾成活率，降低死亡率，降低养殖风险，降低养殖成本。

3)本申请中的副溶血弧菌噬菌体针对126株副溶血弧菌，裂解率高达91.3％，针对132株溶藻弧菌，裂解率高达86.3％，并且本申请中的副溶血弧菌噬菌体具有高效的跨种裂解活性。

附图说明

图1为噬菌体vB_VpaS_PG28的电镜照片；

图2为噬菌体vB_VpaS_PG28的热稳定性结果；

图3为噬菌体vB_VpaS_PG28的pH稳定性结果；

图4为噬菌体vB_VpaS_PG28的体外裂解实验结果；

图5为噬菌体vB_VpaS_PG28降低水体中副溶血弧菌的效果图；

图6为拌料饲喂噬菌体vB_VpaS_PG28后对虾肠道中噬菌体的代谢结果；

图7为拌料饲喂噬菌体vB_VpaS_PG28后对虾肝胰腺中噬菌体代谢结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一 噬菌体的分离与纯化培养

本发明中样品取自青岛市城阳区海鲜市场的污水，样品先以10000rpm离心5min，取上清液配制2216E肉汤，分装于锥形瓶中；每个锥形瓶中按照1％的体积加入若干株副溶血弧菌菌液，混匀后，于37℃、170rpm的空气振荡器中振荡培养过夜；过夜培养的液体经10000rpm离心5min，取上清液用0.22μm的细菌滤器过滤除菌；将滤液和宿主菌混合，于37℃孵育5min后制备双层平板，待凝固后放入37℃的恒温箱中倒置培养，6～8h后观察结果。若滤液中有噬菌体存在，则会在双层平板上形成透明、规则的圆形空斑，即为噬菌斑。纯化噬菌体时抠取单个噬菌斑，置于1mL 2216E肉汤后，于37℃、170rpm的空气振荡器中孵育30min，经10000rpm离心5min后，取上清再用双层平板法得到单个的噬菌斑，如此重复3～5次直至得到大小、形态一致的噬菌斑。所述噬菌体经过上述分离、纯化步骤后，保存为PG28。

实施例二 噬菌体的形态及分子生物学鉴定

1、电镜下噬菌体的形态观察

取20μL效价为1×10⁹PFU/mL的所述噬菌体样品滴于微孔铜网上，沉淀15min，用滤纸吸去多余的液体。然后在铜网上滴加15μL的2％的磷钨酸(PTA)，染色5min，用滤纸吸去多余的染液。干燥后用透射电镜观察并拍照。

噬菌体的形态结果参见图1。

观察结果为：PG28的头部为直径70nm左右，其非伸缩尾部长约130nm，根据国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)第九次报告，可确定噬菌体PG28为长尾噬菌体科，命名为vB_VpaS_PG28，所述噬菌体已于2018年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物学中心，保藏编号为CGMCCNO.16393。

2、噬菌体的分子生物学鉴定

(1)噬菌体vB_VpaS_PG28的基因组提取

取500μL已纯化噬菌体，加入DNaseⅠ和RNase A至终浓度1mg/L，37℃孵育1h，80℃加热15min，使DNA酶失活；然后加入EDTA(终浓度0.02mol/L)，蛋白酶K(终浓度50mg/L)，10％SDS(终浓度0.5％)，56℃水浴1h裂解噬菌体；加入等体积平衡酚上下颠倒混匀，10000rpm离心10min，收集上层水相至新的1.5mL离心管中；加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合液(3种试剂体积比25:24:1)，温和混匀后10000rpm离心10min，以去除蛋白、糖类等杂质；收集上层水相至新的离心管中，加入等体积氯仿再抽提一次；最后收集上层水相并加入等体积无水乙醇沉淀核酸，-20℃放置2h后12000rpm离心20min，弃上清收集沉淀；用1mL75％的冰乙醇洗涤上述DNA沉淀，12000rpm离心10min，室温干燥后，用30μL无核酸水溶解DNA。

(2)噬菌体vB_VpaS_PG28的全基因组测序

使用IlluminaMiseq(San Diego，CA，USA)测序仪对噬菌体进行全基因组测序。使用Miseq Reagent Kit v2试剂盒构建600bp测序文库，主要流程如下：对基因组DNA进行超声打断，末端补平，并加上特异接头后，扩增纯化筛选DNA，即得到构建的测序文库。使用软件Newbler2.9对噬菌体原始测序数据进行组装和拼接。最后得到噬菌体基因组大小为77598bp，为双链DNA，G+C的含量为48.32％，含有115个预测的开放阅读框。

使用在线工具BLASTp和保守域数据库(CDD)分别对噬菌体vB_VpaS_PG28的115个ORFs蛋白序列进行比对，其中，噬菌体vB_VpaS_PG28含已知编码功能蛋白11个，其余ORFs为假想蛋白。此外，根据基因组测序结果进一步可得：该噬菌体基因组含有与噬菌体宿主裂解相关的细胞壁水解酶(cell wall hydrolase)，基因序列见序列表SEQ ID No.1，位置分别为72760-73029bp；保守的dCTP脱氨酶(deoxycytidine triphosphate deaminase)，基因序列见序列表中SEQ ID No.2，位置为59674-60225bp。

SEQ ID No.1

SEQ ID No.2

上述基因的具体信息见下表1。

表1噬菌体vB_VpaS_PG28的基因序列信息表

实施例三噬菌体生物学特性的检测

(一)噬菌体的增殖和效价测定

各取100μL宿主菌和噬菌体抠取单斑的浸出液加入到5mL 2216E肉汤中，于37℃、170rpm的空气振荡器中培养3～4h，待混合液变澄清，得到噬菌体增殖液。10倍倍比稀释噬菌体增殖液，双层平板法测效价，每个稀释度分别做3个平行样。计数前观察平板中的噬菌斑，取30～300之间的平板来计数，计算效价。

取稀释度为10^-7的3个平行样计数，结果分别为：189、192、206个噬菌斑，计算噬菌体vB_VpaS_PG28的效价为1.96×10¹⁰PFU/mL。

(二)噬菌体vB_VpaS_PG28的裂解谱检测

选取实验室保存的副溶血弧菌126株和溶藻弧菌132株，采用双层平板法检测vB_VpaS_PG28的裂解谱。这些菌株是2017～2019年在烟台、滨州、江门、漳州、海口等地的发病南美白对虾肝胰腺和养殖池水中分离鉴定而来。126株副溶血弧菌中有122株携带与致病性相关的毒力基因，包括tdh、trh、tlh、T3SS、pirA、pirB；132株溶藻弧菌中均含有与致病性相关的毒力基因，包括tdh、trh、tlh、tdh、toxR、sto、ctxA和Vpi。

取100μL菌液与100μL vB_VpaS_PG28制备双层平板，置于37℃的恒温箱中倒置培养16h左右，观察vB_VpaS_PG28对各株菌的裂解情况。实验结果见表2和表3。

结果显示：针对临床分离的126株副溶血弧菌，vB_VpaS_PG28能够裂解其中的115株，裂解率高达91.3％，其中122株带有毒力基因的副溶血弧菌有111株可被裂解，裂解率为91.0％；针对临床分离均含有毒力基因的的132株溶藻弧菌，vB_VpaS_PG28能够裂解其中的113株，裂解率高达85.6％。说明该噬菌体不但可以跨种裂解，而且宿主谱很宽，能够应用到南美白对虾养殖环境中，用于净化水体中的副溶血弧菌和溶藻弧菌。

表2噬菌体vB_VpaS_PG28对副溶血弧菌裂解谱

表3噬菌体vB_VpaS_PG28对溶藻弧菌裂解谱

(三)噬菌体对温度和pH稳定性检测

将1.96×10¹⁰PFU/mL的噬菌体vB_VpaS_PG28增殖液分别于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，水浴中作用20min、40min、60min，每个温度设两个平行组。双层平板法测定噬菌体的效价。

具体结果参见图2，噬菌体vB_VpaS_PG28在40℃和50℃作用60min后基本保持原活性；60℃作用20min后仍保持在2.56×10⁹PFU/mL以上，作用60min后效价下降2个数量级为2.15×10⁸PFU/mL；70℃的高温作用下，作用20min噬菌体效价为3.56×10⁴PFU/mL，作用40min噬菌体效价为3.40×10¹PFU/mL，作用60min噬菌体效价降为0；80℃高温下，噬菌体均未被检测到。从上述数据可看出噬菌体vB_VpaS_PG28的热稳定性较好。

取无菌试管中加入不同pH值(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)的2216E肉汤4.5mL，各三支，置于37℃的水浴锅中，待温度稳定之后，各加入500μl1.96×10¹⁰PFU/mL的噬菌体增殖液，混匀后于37℃水浴作用1h、2h、3h。作用结束之后，向混合液中加入适量的HCl或者NaOH使混合液的pH值约为7，双层平板法测定噬菌体的效价。

具体结果参见图3，结果可见：在pH＝4～9范围内噬菌体vB_VpaS_PG28效价稳定，波动较小；当pH＝3、11，处理3h时后，噬菌体效价下降不到2个数量级；当pH＝12，处理3h后，噬菌体的效价仅下降3个数量级；当pH＝2、14，处理1h后，噬菌体仍可被检测到，且效价在1×10³PFU/mL以上。由上述数据可见，该噬菌体对pH的适应范围较广。

(四)噬菌体的最佳感染复数(MOI)测定

按照常规方法增殖副溶血弧菌噬菌体vB_VpaS_PG28和宿主菌，测定噬菌体及宿主菌效价。将噬菌体vB_VpaS_PG28和宿主菌稀释后，按照感染复数为100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001和0.00001各取100μL不同梯度的vB_VpaS_PG28和宿主菌的稀释液加入到NB肉汤中。于37℃、170rpm空气振荡器中振荡培养，至液体变澄清，记录液体变澄清时间。双层平板法测定噬菌体的效价，结果如表4。

表4噬菌体的最佳感染复数(MOI)测定结果

结果可见噬菌体的最佳感染复数是0.1，该感染复数下噬菌体感染宿主菌产生子代噬菌体的效价最高，为7.56×10¹⁰PFU/mL，且增殖时间为3.5h，适合应用于工业大批量发酵生产中。

实施例四 噬菌体体外裂解试验和水体消毒试验

(一)vB_VpaS_PG28对副溶血弧菌菌株的体外裂解试验(OD值法)

按照感染复数等比例加入副溶血弧菌菌株ATCC17802和噬菌体vB_VpaS_PG28，副溶血弧菌ATCC17802的终浓度为5.00×10⁶CFU/mL，噬菌体的终浓度分别为5.00×10⁷PFU/mL、5.00×10⁶PFU/mL、5.00×10⁵PFU/mL和5.00×10⁴PFU/mL，对照组加入与噬菌体溶液相同体积的2216E培养基。菌液和噬菌体混合后放置在37℃、170rpm的空气振荡器内振荡培养。每隔一定的时间测定混合液OD值直至试验组OD值结果基本稳定，记录OD值数据；结束OD值测定后，取试验组混合液通过涂布法测定各组中残留的菌的效价。

结果可见vB_VpaS_PG28对副溶血弧菌菌株的裂解效果很好，4个不同感染复数下噬菌体对副溶血弧菌ATCC17802的裂解效率都达到99.90％以上，且均能在3h内达到该裂解效率，与体系中初始浓度相比噬菌体处理组菌浓度下降3个数量级，与对照组相比菌浓度下降5个数量级，具体数据见表5和表6。噬菌体vB_VpaS_PG28对ATCC17802裂解的OD值变化的结果见图4。

表5各时间段OD值变化

表6 OD值测定结束后测定菌残留量

(二)vB_VpaS_PG28水体消毒试验

取6个空桶，每桶装3L无菌海水，28℃水浴，小气泵通氧，每桶放入5尾南美白对虾；向体系中加入终浓度为1×10⁶CFU/mL副溶血弧菌ATCC17802菌液；1h后向4个桶中加入噬菌体vB_VpaS_PG28，每组设置平行，使其中2个桶内感染复数为1:1另外两个感染复数为0.1:1，攻毒组加入等体积2216E培养基，详细分组情况见表7。于1、6、12、24h后用涂布平板法检测水体中副溶血弧菌的数量，副溶血弧菌残留数据见表8。水体消毒试验效果图见图5。

表7水体消毒实验分组

表8水体消毒试验副溶血弧菌残留量(CFU/mL)

噬菌体vB_VpaS_PG28在养殖水体中能够显著降低副溶血弧菌的活菌数量，高达3个数量级。所以噬菌体可以作为水体消毒剂用于杀灭副溶血弧菌。

实施例五 噬菌体在南美白对虾肠道和肝胰腺中的代谢动力学及安全性实验

体重5g左右健康的南美白对虾，空腹过夜。按照体积与质量比为5％的添加量，将噬菌体vB_VpaS_PG28与对虾饲料均匀混合；将饲料阴干，再以对虾体重3％的剂量饲喂；喂食后0.5、6、24、48、72、96、120、144h检测虾肠、肝胰腺以及空白对照组正常对虾体内噬菌体的含量。结果见图6和图7。噬菌体拌料后效价为2.67×10⁸PFU/g。

实验结果：饲喂0.5h后，虾体肠道、肝胰腺内即可检测到噬菌体的存在，效价可达5.15×10⁶PFU/g；虾体内噬菌体可持续存在3天以上。上述实验结果说明噬菌体可以通过喂食进入虾体内，说明噬菌体vB_VpaS_PG28可作为饲料添加剂进行应用。实验结果还表明，噬菌体对南美白对虾的健康没有影响，不影响对虾正常活动，说明噬菌体vB_VpaS_PG28有良好的安全性。

实施例六 噬菌体预防副溶血弧菌感染南美白对虾效果实验

(一)噬菌体拌料饲喂预防效果测定

体重5g左右健康的南美白对虾，分为3组，每组50只，空腹过夜。设置2个试验组和1个对照组，试验组互为平行。按照体积与质量比为5％的添加量，将噬菌体与对虾饲料均匀混合，饲料阴干后，实验组以对虾体重3％的剂量饲喂，对照组按照同样剂量饲喂用2216E培养基浸泡后的饲料。饲喂1h后对所有对虾注射副溶血弧菌，剂量为1.00×10⁶CFU/只。记录各组48h内死亡对虾数目，并计算噬菌体的保护率。具体数据见表9。

表9噬菌体拌料的预防效果

上述实验结果表明，噬菌体vB_VpaS_PG28通过拌料方式能够预防南美白对虾因感染副溶血弧菌而导致的疾病，而副溶血弧菌是对虾急性肝胰腺坏死综合征的主要致病菌，说明噬菌体vB_VpaS_PG28可作为饲料添加剂或药物添加入饲料中，有效预防对虾感染副溶血弧菌而导致的疾病，从而降低死亡率，提高虾苗成活率，降低养殖风险。

(二)噬菌体浸浴预防效果测定

体重5g左右健康的南美白对虾，分为3组，每组50只，正常饲喂。设置2个试验组和1个对照组，试验组互为平行。试验组使用效价为1×10⁸PFU/mL的噬菌体浸浴，对照组加入等体积2216E培养基。对虾浸浴2h后注射副溶血弧菌，剂量为1.00×10⁶CFU/只。记录各组48h内死亡对虾数目，并计算噬菌体的保护率。具体数据见表10。

表10浸浴噬菌体的预防效果

结果显示，浸浴噬菌体vB_VpaS_PG28能有效预防南美白对虾感染副溶血弧菌引起的疾病，包括但不限于对虾急性肝胰腺坏死综合征。浸浴噬菌体可与拌料同时或单独应用，以降低对虾的死亡率，提高养殖成活率，降低养殖成本。

实施例七噬菌体治疗南美白对虾感染副溶血弧菌效果实验

体重5g左右健康的南美白对虾，分为3组，每组50只，空腹过夜。设置2个试验组和1个对照组，试验组互为平行。所有对虾注射副溶血弧菌攻毒，剂量为1.00×10⁶CFU/只。攻毒1h后，试验组按照对虾体重3％的剂量进行饲喂噬菌体vB_VpaS_PG28和饲料的混合物，对照组按同样剂量饲喂用2216E培养基浸泡后的饲料。记录各组48h内死亡对虾数目，并计算噬菌体的保护率。具体数据见表11。

表11噬菌体拌料对急性肝胰腺坏死综合征的治疗效果

上述实验结果表明，给对虾饲喂含有噬菌体vB_VpaS_PG28的饲料可有效控制对虾的死亡率，与对照相比，显著提高对虾存活率。说明噬菌体vB_VpaS_PG28可用于制备抗副溶血弧菌的药物，从而治疗包括但不限于由副溶血弧菌感染引起的对虾早期死亡综合症(EMS偷死病)或对虾急性肝胰腺坏死病(AHPNS)的弧菌病。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛诺安百特生物技术有限公司

<120> 一株具有跨种裂解能力的弧菌噬菌体及其应用

<130> CP120030532C

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 270

<212> DNA

<213> 噬菌体vB_VpaS_PG28

<400> 1

atgggcgcac aatcatttga aaaagaagta accaaaatcg taggtgagat ttccgctgtt 60

ctttcagaaa tggcagcaac tcacaaacgc cttgtagccc ttgtgcaaga aatgccacta 120

atgcagcaag tgacggttca acgtgctttg aataacggtt ggatgctatc tcagatagac 180

ggtgacaagg ttaagttata caaccaagtt gggaagtcta agaagtgggt agacatgtgg 240

gtaatggctg atggttcata cactcgctag 270

<210> 2

<211> 552

<212> DNA

<213> 噬菌体vB_VpaS_PG28

<400> 2

atgaaaccct ttgaccaccc gcaaggcatg atcgtaggcg tagacctaca ccgattggta 60

caccatggtg ccattaaagg tatagaaacc tctcagattg gtaactgtgc tattgacgtt 120

aaactaggtt catgggtgaa gatggagaaa aagcccctca ctctagcgat agaagacgag 180

gaggtggttc tagttactga tcaacactcc gaccacctag tgaaagttga acccctcacc 240

atcaaacatg gggcgcgggt gtggaagatc ccacctaaga ccttcgccct aaccgtaacc 300

tcggagacgt tttgcctacc ccctaatgta tcggcaacct tttccctgag atccgtatgt 360

gcccgtaatg ggttggatca ggtaatgtca gttaatctct gggctggctt caaaggttcg 420

ctagtactag aactctacaa cctattgacc tatactccgc tttacctaaa agagttcgat 480

tgtatcggtc aggtagagtt taagtgtcac cgtgagacgg taccttatga cggcaagtac 540

cagcatcaat aa 552

Claims (10)

1.具有宽裂解谱的弧菌噬菌体，其特征在于，拉丁名为Vibrio parahaemolyticus，被命名为vB_VpaS_PG28，保藏编号为CGMCC NO.16393，于2018年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物学中心；优选地，所述弧菌噬菌体能够裂解副溶血弧菌和溶藻弧菌。

2.根据权利要求1所述的弧菌噬菌体，所述的弧菌噬菌体的基因组含有与噬菌体宿主裂解相关的细胞壁水解酶，基因序列见序列表SEQ ID No.1。

3.如权利要求1所述的弧菌噬菌体在制备预防或治疗由副溶血弧菌和溶藻弧菌引起的疾病的药物或饲料中的用途；优选地，药物为外用药物或口服药物。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述疾病为对虾早期死亡综合症或对虾急性肝胰腺坏死综合征。

5.如权利要求1所述的弧菌噬菌体在制备防治水产品在养殖、运输及保存过程中的细菌污染的制剂中的用途，优选地，所述细菌污染为副溶血弧菌和溶藻弧菌引起污染。

6.一种用于防治副溶血弧菌和溶藻弧菌感染的杀菌组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的弧菌噬菌体，优选地，其效价为1×10¹¹PFU/mL。

7.一种水体消毒剂，其特征在于，有效成分为如权利要求1所述的弧菌噬菌体；优选地，实际应用时弧菌噬菌体的效价为1×10³PFU/mL以上；更优选地，所述的水体为淡水或海水。

8.如权利要求7所述的水体消毒剂，其中还包含其他用于环境中病毒、细菌的抑制或消灭的活性成分。

9.一种水产品饲料，其特征在于，包括如权利要求1所述的弧菌噬菌体，优选地，对虾饲料中弧菌噬菌体的浓度为1×10⁸PFU/g以上。

10.根据权利要求9所述的水产品饲料，所述的水产品选自南美对虾。

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