CN113046326A - 一株烈性副溶血性弧菌噬菌体vB_VpP_FE11的分离及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一株烈性副溶血性弧菌噬菌体vB_VpP_FE11的分离及应用，所述的噬菌体vB_VpP_FE11的耐受温度＜70℃，pH值为4至11时可以存活。水产养殖环境中，pH条件一般为中性或偏酸性。本发明的副溶血性弧菌噬菌体vB_VpP_FE11可裂解133株食源性副溶血性弧菌菌株中的35株，裂解率为26.3%，说明该噬菌体为烈性噬菌体且具有广谱性。并验证噬菌体的体外裂菌能力，制备新型生物杀菌制剂，可以有效防控副溶血性弧菌感染，解决目前抗生素治疗副溶血性弧菌面临的耐药性问题。

Description

一株烈性副溶血性弧菌噬菌体vB_VpP_FE11的分离及应用

技术领域

本发明涉及疾病防治领域，具体涉及副溶血性弧菌裂解性噬菌体及其应用。

背景技术

一般而言，养殖虾乃至其它水产品的细菌感染疾病，主要由副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)引起，严重阻碍经济平稳发展。副溶血弧菌是一种嗜盐性的革兰氏阴性菌，在硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基平板呈现圆形、绿色菌落，弧菌显色平板呈现红色菌落，显微镜下呈现短杆或弧状，隶属弧菌科、弧菌属。PirAvp/PirBvp毒素可导致虾急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND)，表现为昏睡或萎缩的肝胰腺，于2009年在我国首次爆发，然后扩散到越南，马来西亚和泰国，由于这种疾病，2013年虾的产量较2012年下降了约60％。另外，任何食用生的或未煮熟的虾、蟹、贝类和其他水产品的人都有感染副溶血弧菌的风险，极大威胁人类健康，五岁以下的儿童、老年人和自身免疫虚弱的人群相对容易被感染，感染人群表现为腹泻，呕吐，腹部绞痛，恶心、发烧等症状。2004年7月，在西班牙共确诊80例食物中毒患者，原因为食用了被副溶血弧菌污染的螃蟹；2018年9月27日，在委内瑞拉吃了新鲜蟹肉的人群中，共确诊26名因副溶血性弧菌感染的患者。

为提高水产品质量，降低细菌污染风险，抗生素广泛应用于水产品领域，如水产养殖场、运输链和销售链，这对我国当下水产品经济发展、食品安全和人民生活质量水平的确起到积极作用。但是，我国暂时没有出台抗生素针对水产品防控、消杀细菌标准，养殖户、批发商忽略抗生素消极影响，造成滥用，容易导致多重耐药致病菌爆发或者水产品中抗生素残留等严重性后果。近几年，多项微生物风险评估表明水产品中耐药性副溶血弧菌的检测率升高，即食食品也不例外，其中，来自不同食品的副溶血弧菌分离株，对链霉素的耐药率最高。这归因于包括水产品在内的动物养殖和销售大剂量施用抗生素，加快了细菌基因突变，产生抗性；另外，耐药基因一般定位在独立的质粒上，通过接合等方式可在不同种属的细菌之间转移和重组，因此，抗生素抗性基因很容易迅速传播，是抗生素使用过程最严重的问题。此外，抗生素施用期间，在快速消杀致病菌的同时，也不可避免对益生菌群造成不良影响，极易破坏水产品生存环境的生态平衡。人类食用抗生素残留的水产品后，也可能引起疾病，例如，氯霉素通过抑制身体骨髓造血功能，引起再生障碍性贫血症等疾病；呋喃唑酮可引起溶血性贫血、多发性神经炎、眼部损害和急性肝坏死，并有一定致癌性。越来越多的研究表明，抗生素滥用和多重耐药的副溶血弧菌爆发对全球人类的公共卫生和经济发展，特别是水产养殖行业，构成严重的威胁。目前，为快速有效地控制和终止致病性弧菌的增殖，预防和治疗的是主要手段是应用抗生素和消毒剂。但是抗生素的滥用，容易导致多重耐药致病菌爆发或者水产品中抗生素残留等严重性后果。近几年，多项微生物风险评估表明水产品中耐药性副溶血弧菌的检测率升高，主要原因就是抗生素的滥用。此外，抗生素在快速消杀致病菌的同时，也不可避免对益生菌群造成不良影响，极易对施用环境的生态平衡造成破坏。而且氯霉素、呋喃唑酮等抗生素对人体有一定的危害性，残留在水产品中的抗生素被人体摄入后，往往引起疾病。

越来越多的研究表明，抗生素滥用和多重耐药的副溶血弧菌爆发对全球人类的公共卫生和经济发展，特别是水产养殖行业，构成严重的威胁。除了抗生素之外消毒剂也是用于控制副溶血性弧菌感染的常用方法之一。例如，臭氧是一种强氧化剂，已在水产养殖业中用于杀死有害微生物。但是，臭氧是不稳定的，通常在水中会迅速分解。此外，尽管二氧化氯也被用作牡蛎净化过程中的副溶血弧菌消毒剂，但它是非特异性的，严重破坏了饲养水体的自然生态。

随着以上问题日益严重，科研人员将再次着眼于利用噬菌体治疗对抗病原菌。为防控、消杀多重耐药致病菌，寻找优于抗生素治疗的手段，噬菌体成为近年来最热门的研究重点之一。噬菌体是一种特殊的细菌病毒，被认为是对抗多药耐药细菌的替代品。自从20世纪初发现噬菌体以来，已经报道了一些使用噬菌体疗法成功治疗细菌感染的方法案例(林业杰等，副溶血性弧菌噬菌体的生物学特性研究，海峡预防医学杂志，1998年第1期)。一些经FDA(U.S.Food and Drug Administration)批准的噬菌体类产品，已经被用投入生产应用。噬菌体分为2个大类：温和噬菌体和烈性噬菌体。其中烈性噬菌体通过特异性侵染宿主，在利用宿主细胞的营养物质进行繁殖，最终使细胞裂解来杀死宿主，只需通过4次感染周期，一个噬菌体颗粒就可以使十亿个宿主细胞裂解死亡，具有潜在应用价值。噬菌体是生物圈中最丰富的病毒群体，人类易于从环境中分离纯化噬菌体，如：动物粪便、河水、海水和土壤等，种类繁多，噬菌体利用细菌合成子代噬菌体，噬菌体侵染、裂解宿主可释放大量子代噬菌体，获取成本比较低；噬菌体只有在活致病菌内才能复制、合成和增殖，不会在动物和食品中残留，随着致病菌的消失而死亡，而施用抗生素则会在动物或食品中残留，另外，多项研究表明噬菌体不耐受高温，是噬菌体应用于食品领域的重大优势；不管是非耐药病原菌还是多重耐药病原菌，噬菌体都能侵染并裂解，达到高效杀灭细菌的结果。噬菌体相对于抗生素，特异性比较强，只能特异性识别某一种属病原菌，并不破坏正常的细菌群落，目前，大部分烈性噬菌体全基因组分析表明并不存在已知毒力基因和耐药基因，另外，许多噬菌体在I和II期安全性试验结果显示并不存在明显的安全隐患。有望通过III期临床试验，并最终在防控、消杀病原菌发挥重要作用

目前噬菌体的应用主要受到以下几个方面的限制。

首先，噬菌体特异性侵染菌株的特性，是其能够有效在生产中应用的主要限制因素。一个病症的发生，通常并不是由单单一株病原菌引起的，会是多种病原菌共同导致，而且对于不同环境或者个体中发生的相同病原菌感染，可能存在病原菌的菌株差异。

其次，一些噬菌体具有溶源能力，在溶源噬菌体，即温和噬菌体的生命周期中，其DNA主要是以整合到细菌的染色体上的方式，与细菌一起共同繁殖，只有在遇到逆境胁迫的情况下，才会进入裂解周期。这将带来两个问题，第一是不能快速的杀死病原菌，第二会引起基因水平转移，可能将细菌致病基因整合到噬菌体基因组上，从而导致致病基因在菌株间传播。

最后，噬菌体制剂的稳定性也会影响其实际应用，一方面是噬菌体制剂在运输与销售过程中，必须保持噬菌体效价在有效范围内，另一方面是噬菌体在所投放应用的环境中，能够稳定存活，并起到有效作用。目前缺乏能够同时解决以上应用缺陷并且遗传信息和理化性质清晰的副溶血性弧菌噬菌体。

发明内容

本发明是针对现有的不足，本发明的目的是用噬菌体作为一种替代抗生素和消毒剂的生物防治剂控制副溶血性弧菌。本发明基于双层琼脂平板法从污水中分离和筛选出副溶血性弧菌，并研究噬菌体的生物学特征，获得一株裂解谱广、能裂解多种食源性的副溶血弧菌噬菌体vB_VpP_FE11。噬菌体vB_VpP_FE11可由副溶血弧菌特异性扩增，分离方法简单，可以大量获得。进一步，所述的噬菌体vB_VpP_FE11的耐受温度＜70℃，pH值为4至11时可以存活。水产养殖环境中，pH条件一般为中性或偏酸性，我们的研究表明噬菌体可在水产养殖环境中保持侵染宿主的活性，从而在防控、消杀副溶血弧菌发挥作用。

本发明提供一种具有宽裂解谱的副溶血性弧菌噬菌体(Vibrioparahaemolyticus bacteriophage)，菌株的保藏编号为GDMCC No:61187-B1。该噬菌体采用沉降-过滤方法从广州黄沙水产市场下水道水样中分离得到，所述副溶血性弧菌噬菌体具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列表示的基因组。

本发明提供含有噬菌体作为活性成分的药物组合物，进一步还包含药物上可接受的助剂。优选地，在药物组合物中的噬菌体效价≥10⁵pfu/mL。所述药物可以用于人或动物，如优选地鱼、虾、蟹、贝等水产动物，以防治食源性副溶血性弧菌感染的疾病。具体地，所述疾病为南美白对虾急性肝胰腺坏死病。本发明的副溶血性弧菌噬菌体可以为控制由副溶血性弧菌感染引起的急性肝胰腺坏死综合症提供环保新药。

对应的，本发明还提供所述新副溶血性弧菌噬菌体在制备预防或治疗食源性副溶血性弧菌引起的疾病的药物中的用途。

本发明还提供一种用于防治副溶血性弧菌感染的杀菌组合物，其含有上述食源性副溶血性弧菌噬菌体作为活性成分。优选地，所述杀菌组合物是水体消毒剂，其有效成分为上述副溶血性弧菌噬菌体，优选地，其浓度为≥10⁵pfu/mL。在此浓度下，水体消毒剂的消毒效果最佳。优选地，所述水体消毒剂还包含其他相配合的杀菌活性成为或助剂。

本发明还提供所述副溶血性弧菌噬菌体用于制备防控细菌污染的制剂中的用途，优选地，所述场景为水产品养殖、运输及保存的过程中。

本发明还提供一种包括上述副溶血性弧菌噬菌体的水产动物如对虾的饲料添加剂。该噬菌体作为添加剂加入南美白对虾的饲料中，以有效提高虾苗成活率。优选地，饲料中副溶血性弧菌噬菌体的含量在10⁵pfu/mL以上。

本发明与现有技术相比具有以下优点：本发明的副溶血性弧菌噬菌体vB_VpP_FE11可裂解133株食源性副溶血性弧菌菌株中的35株，裂解率为26.3％，说明该噬菌体为烈性噬菌体且具有广谱性。并验证噬菌体的体外裂菌能力，制备新型生物杀菌制剂，可以有效防控副溶血性弧菌感染，解决目前抗生素治疗副溶血性弧菌面临的耐药性问题。

本发明的具有宽裂解谱的副溶血性弧菌噬菌体vB_VpP_FE11(Vibrioparahaemolyticus bacteriophage)，于2020年9月14日在广东省微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏编号为GDMCC No:61187-B1；保藏单位的地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

附图说明

图1噬菌体FE11的电镜图。

图2噬菌体FE11的温度稳定性。

图3噬菌体FE11的pH稳定性。

图4噬菌体FE11的紫外耐受性

图5噬菌体FE11的MOI。

图6噬菌体FE11的一步生长曲线。

图7噬菌体FE11的基因热图。

图8对噬菌体vB_VpP_FE11、vB_VpaP_KF1、vB_VpaP_KF2和vB_Vc_SrVc9基因组进行可视化分析图。

图9噬菌体FE11防控副溶血弧菌实验效果图。

具体实施方式

以下将结合本发明实施例中的附图，进一步对本发明做进一步详细说明，所描述的实施例仅为关键的实施例，并非全部的实施例。所述实施例并不构成对本发明的限制。

实施例1噬菌体的分离培养

1.宿主菌活化与培养

本研究使用的食源性副溶血弧菌由广东省微生物研究所提供，将干粉管从4℃供冰箱取出，敲碎管口，用无菌枪头取出加到3％NaCl碱性蛋白胨水中，并置于37℃，200rpm摇床中培养24h，再经过弧菌显色平板划线鉴定后，挑取单菌落接种于5mL TSB液体培养基中，37℃，200rpm，培养24h，得到单一的悬浊液。

2.噬菌体的分离与纯化

2019年4月10日，从广东省广州市黄沙水产交易市场下水道抽取2L水样，污水样品在室温条件下，经8000×g离心10min，上清液经0.45μm过滤器过滤，除去污水样品中大颗粒杂质以及细菌颗粒，加入固体硫酸镁至终浓度为50mM，充分混匀，室温静置10min，使用抽滤装置将混合液通过0.45μm纤维素滤膜，将滤膜剪碎并加入50mL洗脱液(1-3％牛肉膏，3％Tween-80，50mM NaCl)，超声10min，洗脱液经0.45μm过滤器过滤，可放4℃保存。从-20℃取出副溶血弧菌甘油管，吸取100μL加入5mL TSB液体培养基，于37℃，200rpm振荡培养过夜(10h)，吸取100μL活化培养液加入5mL TSB，37℃，200rpm振荡培养3h至对数期，取上述噬菌体浓缩保存液2mL，加入2mL的双料TSB(2mM CaCl₂)，同时加入80μL培养至对数期的副溶血性弧菌菌液，37℃静置30min，移至摇床，37℃，200rpm培养24h。经8000×g离心10min，噬菌体扩培液经0.45μm过滤器过滤，重复此培养步骤三次，噬菌体过滤培养液可置于4℃保存。

检测扩培液是否具有烈性噬菌体使用点样法，具体操作如下：将100μL培养至对数期的副溶血性弧菌菌液加入45℃左右的5mL TSB(含0.4％技术琼脂，2mM CaCl₂)，倒入TSA(1.5％技术琼脂)平板上，待凝固后将2μL噬菌体扩培液滴在上层琼脂，放入37℃恒温培养箱培养3-24h，观察是否出现噬菌斑。出现噬菌斑的样品可进行下一步分离纯化实验。

噬菌体纯化使用双层平板法，具体操作如下：将100μL培养至对数期的副溶血性弧菌菌液和适当稀释的噬菌体扩培液加入冷却至45℃左右的TSB(含0.4％技术琼脂，2mMCaCl₂)中混匀，倒入TSA平板上，待凝固后置于37℃恒温培养箱培养3-12h，观察有无单个噬菌斑生长。根据噬菌斑形态，如：直径大小，是否有晕圈等，挑取单个噬菌斑于5mL的TSB(2mMCaCl₂)中，并加入100μL副溶血性弧菌菌液(对数期)，静置30min后，37℃培养24h,将培养液经8000×g离心10min，取上清液经0.45μm过滤器过滤，重复此步骤6次，直至得到大小和形态均一的蚀斑。将纯化噬菌体培养液与60％甘油以1:1比例混合，注入无菌EP冻存管中，放入-80℃低温冰箱中保存，纯化噬菌体培养液可直接保存至4℃冰箱。

通过上述双层平板法多次纯化，最终在培养基上形成大小形态一致的噬菌斑即纯化完成。本研究经双层平板法，一共筛选到副溶血弧菌噬菌体55株，挑选其中宿主范围最广的两株烈性噬菌体用于后续实验，其中一株噬菌体命名为vB_VpP_FE11(以下简写为FE11)保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61187-B1。另一株噬菌体另外提出专利申请。

实施例2噬菌体的菌体鉴定

1、噬菌体形态鉴定

取100μL噬菌体培养液和1mL培养至对数期的副溶血性弧菌O5-15于50mL的TSB液体培养基(2mM CaCl₂)，于37℃，200rpm振荡培养4h。将混合培养液经8000×g常温离心10min，取上清液经0.45μm过滤器过滤，加入PEG8000至终浓度为15％，NaCl终浓度为0.5M，轻缓颠倒或使用接种环轻轻搅拌使其溶解，混合液置于4℃冰箱保存过夜(12h)，使噬菌体颗粒形成沉淀。次日，于12000×g，4℃离心20min弃去上清，回收沉淀，用1mL SM缓冲液重悬沉淀，制备纯化的噬菌体浓缩液。

CsCl密度梯度离心纯化噬菌体浓缩液。分别制备密度为1.3、1.5、1.7g/mL的CsCl溶液。对于10mL Beckman超速离心管，CsCl分级梯度由三份均为2.5mL的CsCl溶液组成，将注射器针管插入离心管底部，从轻到重一层一层往下加，并在离心管外侧作上标记，用一次性吸管将纯化的噬菌体浓缩液加至CsCl分级梯度上，于200600×g，4℃离心3h(SW41Tirotor)。收集位于1.5g/mL密度带附近的噬菌体颗粒。

取上述噬菌体颗粒15μL滴加到微孔铜网上，自然沉降15min，用滤纸吸收多余的液体，滴加10μL磷钨酸(2％)染色5min，用滤纸吸收多余的液体，自然干燥之后使用透射电镜(TEM,Hitachi H-7650)寻找噬菌体颗粒，并观察其形态。噬菌体形态鉴定根据ICTV标准进行。

如图1所示，噬菌体vB_VpP_FE11头部直径47±3nm，呈六边形，推测是正二十面体结构。尾部直径约为27±2nm。根据国际病毒分类委员会(ICTV)最新病毒分类系统的标准，该噬菌体属于有尾噬菌体目(Caudovirales)，自转录短尾病毒科(Autographivirina)。

实施例3噬菌体的分子生物学鉴定DNA的提取

1、噬菌体vB_VpP_FE11的DNA提取

1mL宿主菌与0.1mL的噬菌体混合于1.5mL EP管中，再加入50mL的TSB中，37℃，4h。将30mL培养液5000×g，离心10min，取上清液经0.45μm滤膜过滤，加入6mL的PEG8000(60％)和4mL的NaCl溶液(5M)，用接种环轻轻搅拌使之混合，然后置于4℃冰箱保存过夜。

噬菌体浓缩液在4℃，12000×g离心20min后，弃上清，加入1mL的SM缓冲液充分洗涤管壁和沉淀，转移至1.5mL离心管，分别吸取10μL10 U/mL DNaseΙ，65μL DNase Buffer和5μL30 mg/mL RNase A，上下颠倒混匀后放置恒温水浴锅，37℃水浴1h，然后分别加入20μL10％SDS，1μL 10mg/mL蛋白酶K，20μL 0.5M EDTA，上下颠倒混匀后放置恒温水浴锅，65℃水浴60min，期间，上下颠倒混匀两次，使得蛋白酶K充分消化噬菌体蛋白。待混合液冷却至室温，加入等体积已恢复至常温的Tris饱和酚溶液(pH7.7-8.1)，涡旋振荡30s，12000×g常温离心5min，吸取上层水相于一新的无菌离心管。加入等体积预混匀苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)，涡旋振荡30s，12000×g常温离心5min，移上层水相于一新的无菌离心管。再用等体积的氯仿抽提，直至无苯酚的气味(该步骤重复3次)。将上层抽提液吸取至一新的无菌离心管，加入等体积的异丙醇，温柔地上下颠倒混匀，-20℃放置30min，从冰箱取出后，在4℃条件下，12000×g离心20min，收集DNA沉淀。用500μL 70％的乙醇洗涤DNA沉淀，12000×g离心5min(该步骤重复2次)。弃去70％的乙醇，DNA沉淀在室温条件下，干燥5-10min。加入50μL无菌水(65℃预热)，使DNA充分溶解，-20℃保存备用。

2、噬菌体vB_VpP_FE11的基因组分析噬菌体

vB_VpP_FE11基因组DNA利用Ion Torrent S5平台进行测序。噬菌体vB_VpP_FE11的全基因组测序结果如SEQ ID NO:1所示：噬菌体vB_VpP_FE11是双链DNA噬菌体，完整基因组序列长43397bp，GC含量为49.24％，预测含有49个开放阅读框(ORF),其中26个ORF(53.1％)是已知功能的蛋白编码基因，而其它23个ORF为编码假定蛋白，无编码tRNA和毒素基因。BLASTn结果表明，vB_VpP_FE11基因组与弧菌噬菌体vB_VpaP_KF1(NC_048035.1)、弧菌噬菌体vB_VpaP_KF2(NC_048036.1)、弧菌噬菌体vB_Vc_SrVc9(LR794124.1)、弧菌噬菌体vB_VpaP_MGD1(MT501516.1)、弧菌噬菌体OWB(MN974282.1)和弧菌噬菌体VP93(NC_012662.1)的基因组相似性分别为93.95％、93.80％、93.19％、91.98％、88.8％、91.81％。根据热力图(图7)显示，不同颜色代表不同ANI数值，vB_VpP_FE11与弧菌噬菌体vB_VpaP_KF1、弧菌噬菌体vB_VpaP_KF2、弧菌噬菌体vB_Vc_SrVc9、弧菌噬菌体vB_VpaP_MGD1、弧菌噬菌体OWB和弧菌噬菌体VP93的ANI分别为93％、93％、92％、92％、90％和92％，均低于95.00％。

表1中简要注明噬菌体vB_VpP_FE11功能基因组的特性。这些ORF可以分为DNA代谢功能域，结构功能域，裂解功能域，包装功能域和其它功能域。本研究对噬菌体vB_VpP_FE11、vB_VpaP_KF1、vB_VpaP_KF2和vB_Vc_SrVc9基因组进行可视化分析，如图8所示，箭头代表ORF，方向代表序列编码的方向，不同箭头颜色代表行使不同功能，噬菌体基因组之间的颜色代表氨基酸序列相似性。四株噬菌体基因组差异主要集中在DNA代谢功能域和裂解功能域。

表1噬菌体vB_VpP_FE11全基因组开放阅读框功能分类

实施例4:副溶血性弧菌噬菌体vB_VpP_FE11的稳定性测试

在1.5mL EP管中各加入1mL噬菌体悬浮液(1×10⁸PFU/mL)，分别置于不同的水浴温度(20、37、40、50、60和70℃)孵育1h，结束后冷却至室温，通过双层平板法检测噬菌体悬浮液效价。对于pH稳定性实验，将TSB液体培养基pH分别调至3、4、5、6、7、8、9、10、11，过滤除菌，将1mL噬菌体悬浮液(1×10⁹PFU/mL)加入9mL具有特定pH值的TSB液体培养基，噬菌体终浓度为1×10⁸PFU/mL，置于37℃水浴1h，结束后马上冷却至室温并适当稀释，通过双层平板法检测噬菌体悬浮液效价。UV耐受实验具体方法如下：将噬菌体悬浮液(1×10⁸PFU/mL)加入无菌培养皿，并在生物安全柜内使用紫外灯，样品距离紫外灯约15cm，从0min开始，每隔5min，通过双层平板法测定噬菌体滴度。本研究中，噬菌体的三个稳定性实验需进行三个独立实验。

如图2所示，噬菌体vB_VpP_FE11在20℃至50℃水浴1h，噬菌体效价并无明显变化，所以可以确定在20℃至50℃的温度范围内，噬菌体可以保持其活性。60℃水浴1h，绝大部分噬菌体失活，70℃以上时所有噬菌体致死。

如图3所示，pH对噬菌体vB_VpP_FE11具有一定的影响。噬菌体vB_VpP_FE11在pH5.0至pH 9.0条件下仍可以保持最佳活性。随着pH值降低或升高时，噬菌体的效价急剧降低，而在pH 4.0时，噬菌体基本失活。当pH值增加到11.0时，仅少部分噬菌体保持活性。

如图4所示，噬菌体vB_VpP_FE11在UV照射5min，效价降低2.4log，绝大部分噬菌体已经致死，然而，要使噬菌体完全致死，需保证UV照射时间>20min。

实施例5：副溶血性弧菌噬菌体vB_VpP_FE11的最佳感染复数(MOI)

感染复数是指实验初始，加入噬菌体颗粒数与活菌数量的比值，也称感染倍数。产生最高噬菌体效价的MOI条件被定义为最佳MOI。为了确定最佳MOI，将副溶血性弧菌O5-15(5mL)培养至，将细菌悬液稀释至1.0×10⁸CFU/mL，将连续稀释的噬菌体vB_VpP_FE11悬液添加到菌细胞悬液中。用不同比例的(100、10、1、0.1、0.01、0.001和0.0001)噬菌体-对数期副溶血性弧菌O5-15菌液共培养。简言之，将100μL噬菌体和100μL菌液(1×10⁸CFU/mL)被添加到5mL的TSB(2mM CaCl₂)。之后，在37℃下震荡10h，在8000×g室温条件下离心5min以去除细胞。去除沉淀和上层清液过0.45μm滤膜。用双层平板法测定噬菌体滴度。获得最高噬菌体滴度的是最佳MOI。本MOI试验进行了三个平行实验。

如图5所示。噬菌体vB_VpP_FE11侵染副溶血弧菌O5-15，在MOI为0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10条件下，噬菌体效价均>8.00log，其中MOI 0.001时，噬菌体效价最大，为8.4×10¹⁰PFU/mL，因此，该噬菌体最佳MOI为0.001。

实施例6：副溶血性弧菌噬菌体vB_VpP_FE11的一步生长曲线

副溶血性弧菌O5-15在37℃下孵育直至对数期,随后取200μL分别加入96孔板的三个孔中，同时取200μL培养基于三个孔中，测OD₆₀₀。根据得到的OD值和宿主菌的标准曲线方程计算出1×10⁸CFU菌的体积，然后加SM buffer配置成1mL菌液，于1.5mL离心管中，12000×g，离心5min。去除上清液，用1mL的SM buffer重悬沉淀，然后与噬菌体(总体积100μL)以MOI＝0.1一同加入含有0.2mM氯化钙和0.79mL SM buffer的1.5mL离心管中，37℃放置10min。取出离心管，之后12000×g，离心2min，去除上清，再用1mL的TSB重悬。取0.1mL液体加入含有9.8mL的TSB和0.2mM氯化钙的50mL离心管中，混匀后，取出少量液体过滤铺板，记作0min，同时在取出液体后，把50mL离心管放入摇床，37℃，200rpm，随后每隔5min取样品过滤进行铺板，直至1h。把所有平板放入37℃培养箱中，5-6h后取出数板。根据公式算出裂解量。

裂解量＝裂解期平均噬菌斑数/潜伏期平均噬菌斑数

结果如图6所示。噬菌体vB_VpP_FE11潜伏期为0-15min，裂解期为15-30min，裂解量120PFU/cell。表明该噬菌体为烈性噬菌体。非常快速的裂解生长，并伴随相对高的裂解量表明噬菌体可以快速破坏宿主细胞，这有益于噬菌体疗法用于保护食物或各种材料免于细菌定殖。而副溶血性弧菌噬菌体vB_VpP_FE11由于其生长速度快，潜伏期短，裂解量大，潜在应用前景大。

实施例7：噬菌体vB_VpP_FE11的宿主谱测定

使用点样法对噬菌体宿主谱进行研究。简而言之，将100μL处于对数中期的细菌培养物和5mL(0.4％技术琼脂和2mM CaCl₂)的TSB肉汤培养基混合，倒入TSA板上，在室温下静置5min或待软琼脂凝固后，将2μL噬菌体培养液(1×10³-1×10⁸PFU/mL)添加到软琼脂上，做好标记，然后将平板置于恒温培养箱，37℃条件下进行孵育，3h后菌苔在软琼脂均匀分布，每隔1h观察噬菌斑形成情况并做好记录。细菌对噬菌体的敏感性是通过点样区域是否形成清晰透明空斑决定，根据噬菌斑的清晰度，将结果分为两类：点样区清晰(+)和点样区无空斑(-)。

如表2所示，采用点样法测定噬菌体对133株副溶血性弧菌的裂解情况，副溶血性弧菌噬菌体vB_VpP_FE11对35株食源性副溶血性弧菌(O1、O2、O3、O4、O5、O6、O8、O10、O11和O12)有裂解作用，裂解效果(35/133)。

表2：噬菌体vB_VpP_FE11的宿主谱

实施例8：噬菌体防控副溶血弧菌实验

为检测噬菌体应用前景，进行噬菌体防控副溶血弧菌实验。将100μL副溶血弧菌过夜培养物接种至5mL TSB，置于震荡培养箱，37℃，200rpm温育至OD₆₀₀＝0.2，并将细菌细胞悬浮液稀释至1×10⁸CFU/mL，用移液枪吸取100μL细菌培养液至5mLTSB液体培养基(2mMCaCl₂)，实验组根据MOI 0.1、1和10，添加噬菌体悬浮液，充分混匀，吸取200μL混合液添加至96孔板，空白组不加细菌培养液和噬菌体保存液，对照组不需添加噬菌体悬浮液，放置Microplate Reader(37℃)培养，从0h开始，每隔1h检测每个样品孔吸光值(OD₆₀₀)，实验进行三次独立实验。

由图9可知，VP O3-15培养8h后可达稳定期，噬菌体vB_VpP_FE11在MOI为0.1、0.01、0.001条件下，与VP O3-15共培养，随时间增长细菌OD₆₀₀稍微增大，说明细菌浓度增大，但OD₆₀₀值可以保持在较低值下与对照组呈现明显差距，说明噬菌体在一定程度抑制细菌生长，把细菌浓度控制在较低水平下。

<110>广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）；华南农业大学

<120>一株烈性副溶血性弧菌噬菌体vB_VpP_FE11的分离及应用

<160>1

<170> PatentIn Version 3.1

<210>1

<211>43397

<212>DNA

<213>ibrio parahaemolyticus bacteriophage

<400> 1

tttttttgct cacctgttaa ctcactggct tgtcgcctgt cagcctatgg ctatctactg 60

gctatccact tgttaacgta tggcatctgc gatgcgctac gctatccact tgttagcact 120

cgctatcgtg ctgctatcca tatgctatcc tattgatttg cgctttgtcg ctttcgcttc 180

gcttcgctcc gtcgctacaa tagggaatgc ttgctagtgt tagtcagtgg acatacggcg 240

acagtggaca ctacgcttcg ctccgtgtcg gtcgcctcct gtcagtgggc taaatgcatt 300

ataccggata gaacattgtg cgactaggct attgactgtg gataactcat tgctagacca 360

ctgtataacc actgtatata ccgcttttat tgtgatacac ctcacatttc tagtcgtagg 420

gcttgattat ccagtctagc tatgggatag ttcattccgt cgacaggggc gtgctccagt 480

taggcggact agataagctc gcaaggctat ctatcagggt cgctgtcgat gtcctagcaa 540

tagggcgatt ggaagtgatg agccaatctt aaatactcgc tctttaaaaa tatgcttgac 600

aatgaatcac tggttagtgt agcttaaata gcgtgctcag tgagtcacaa ctaagtgccc 660

ttgatgctag ggttcaacaa tgcagagcgg cgtctgctgg cttagttgta aagtgttgga 720

attaccgctt acagcgtgac cgactgacta aacactgaat cacaaaacgc ttgacaggtt 780

gaacaactta gtgatacatt gaaaagcatg ttaacgagag ttaacgactc aaggcactag 840

ccagtcctgc gggacactct gaaaccttgc gaggtattgc agagcaccac ggcactagcc 900

agcgagtcat agcccaatag ggcatcgttc tttaacaatc tggtaaacgg tctaacactc 960

aagcgagagc agttattgcc accatctgca agcgatacgg agacacttgt atctgctgta 1020

aggggtcagc gagaagcgaa gcgagtagag ttaaaagtaa gagttagacg acgggcaacg 1080

cgattgatac tcgctgcgtc cggtgaattg taagtgtaaa gtagtcaggc ttgaaatccg 1140

tatacagttt tccgcttacg atgtactggc aacaactgag ccagcggcaa cctatcccga 1200

aagcataggt catttgatag ggcttagtgt attcattcat atttgctgac actatatgtt 1260

cgctgagtcc tatcaaatgc aatcttgtgc aatctagcac gaagcggtgt aacagtccta 1320

ttaagcgcaa tcttttaacc attggtcaaa gtctatgggt atttgtgtgc gatgcgctgg 1380

tagggtagct tgtttcaccg cttattttat tgaggacaat gtatgttcaa acgtttaaag 1440

caactgtcaa agagtttcta cttgactttc cttagaccac gccgtgtgta tcactttgaa 1500

gtggtttacc gtgacggtct gcgtcgtgtc cagaagaaac actttcaagt gtgtgcgaga 1560

acccgtaacg aggcttacgg tctagcgcgt cacgttagct atatcaacaa tgtgcgaggc 1620

tataagctgt ctctcactca tgtatcaccg ttcgacggtg gtcaatcaat gcaatccgcg 1680

tactaatctg tactaaccta ctaatcgcca aacgagggct aaattatgtc aactgtaaca 1740

acaaacaaag cgccaaaact aacgtctgta aaacaaatcc gtactcaact tgtaaaagct 1800

gagactatgc gccgtaacgt gacaatctct gcactgtacc atgcgctagt gaaatctaac 1860

gtcgcttgga tggataactg gtcacgtaat gacgccgcta tgcttgacgc aactctacgt 1920

gttctatgcc ctactaagtg ggtgaaacct gagcctagca agggcatcaa aggtcattac 1980

aagcgtgaca ttgagaaagc cgataaaatc atgggtgaac taggtgtaaa ccgtgaaatg 2040

acgtacccag agtttttccc aatccttgag caatactgga ttgagaactc agagaagaaa 2100

aagtctgagg aactaacact agaccagaaa caaggcaagc tgaaaggtca aatggcgcgt 2160

ttgttggggc agtgggctga ggctggcttg tcatacggcg aagttgaaac catgctcaag 2220

cgtgctcgtg atggtaaaga cattctacca aaggcgaagt aatcgtggcg cttaactcta 2280

aacaacttga gtacgtccgt aacaattacg ggcgtctctc taagaaagag ttgtgtgatt 2340

atcttggcgt tacgtacaat gagattaatc atgctatccg ctacaatggc atcaaaggta 2400

atgcaaaacg ctccggttca aagcttaatg ctgagagtaa gcgtaaactt atcaagatga 2460

aacagaaagg tgtgtcaagt caagtcattg ctgatatgtt gggcatcaca ccgcaacacg 2520

tgaatcgtgt gtacgctgca cacaatcata tcccgtacta ggaggtacta tgagtgaatt 2580

aaagcagtgg tttaaccact acattgaact tatcaagttt atactggtgc ttgtaggcgc 2640

agtaacagcg gtagtggctg tcggttgggg actcaaagca cttgagttga tgttttataa 2700

atgggcgtta gggttttaac atggcaactt taaccaaggg atacatgaat gctcaggagc 2760

atgctgagta cctaaagaat gagcacctga aactgcaaga tgctttccac aaataccaca 2820

accacactcg taaacgtcaa gaaacgctgc gtgagattta ctcagagcgt gctcgtgtag 2880

tgggcttgtc tcttgtcacc tactgcaagc gtttcaatat ccgtggtgtt ctgttcaaag 2940

gagaactaga tgcgaatcta tcaaatggta gcgcgtaact tcaacagtgg acacatccac 3000

cgcatcattc gaaagaatct tgagcaaggc gagaagttaa ccctgcgcga ttcaaccgca 3060

ctcatttggt ttatgttgag tgaacaaaag tctttccgat tatcgtacca agaattacaa 3120

ctggtacatc ctaagctgcg caagctgcta ccactcgaac gcaagctgtg tcaccgtaca 3180

ttaactgacg gtactcaggt actagacacg gtgcgctttt attctgaggc gtatgctaag 3240

cgtacactca agctactcaa agagcacgga cagtacgatt tattgtctga gttaaccaac 3300

ggtcaagagc aagcattcaa tgcactgttc gaggctaccc aacgtatagc aaatgcatgg 3360

caatctgaca tgcttgacta atctgatact actcatgtaa ggagttccaa atgtctaagt 3420

ttttccaacc attcgaagca atccaactgt tcggcgttaa tgaccctgat ggttacaagc 3480

tactagctga gcaatctgat aacgttgtcg agcgattcac tgtgatgcca gctttctata 3540

gtcgtatagc ctcagagaac gtggatttca tggggcagag tggtaaggtg ttccagtacc 3600

taccacgcta cggtaagaac gcaccacaag gtgaggatat tgacgtgaca tcggctatcg 3660

gtaaagagac tgttagctca cgccacttta tctcgaacca acgtagtacc gatgaccgta 3720

agcttgaagt tttgttcact ggtctatgtc ctgactggta cagcacacaa atcctaacgg 3780

cacaccacca acgcggcatg ttcgattcat tcgctggttg gttaaacttt ggctggcaac 3840

gtggtggtaa gggtatctct ccacgtacca cactactacg tgagaagttc gagaagtacg 3900

agggcacaca ccgtggttgg gtattcaaag cgtgccaacg tattgcacga gtacactacg 3960

caactaacta tttgaacatg actgacggcg gttatcaaag tgtccaaccg gatgttaatg 4020

gtactgactc acccgaccgt atctttcgta aggcgtgtga taatgaaatc ggtgcgctta 4080

tccacgctag aggcactggc ttgcaagggt tagacttcga ctctgaaatg tcgtatgaaa 4140

tgcaagtgca ccaactaagt acgtacgtac tgaatacagc taagctgcta ggttacacac 4200

accctaagct gctggctttt gtcgaagaat attgtgctaa cgttatcttc ttaggtactg 4260

atagtatctg caaaggtatc cgtttagcta acgtgctgca cgagtgctgg tacagagatt 4320

acgacttaca cttcggtgcg cctagtatca atggttttga tggtcgagtc gtttgcttct 4380

tacgtgtttg gaactgcttc ttccagaacc aaggtgtgac acctgtcggt ttaatctggg 4440

acggtgagag cgaagtgaag aacatcactg ctaagcctac cgctgtagta actgctgatg 4500

gtcgtgtgca aatccgtgtt atcattaacg acctaccaat cccacgtttg tacgctgacg 4560

gttctgacta ccgtgacgca ttgcaagcaa tgaaagcact gaactctcca atccatacaa 4620

caatcattcc agcgcagcct gagtatgacc atatctggca ctttgtgtac gagaatggcc 4680

cgggttcatg tatgactgac tacccttacg aacgttgtcc ggtgcgtgtg tactgtcacg 4740

aagacaatag ccttggtcta gctgtctgct accgttcacc acgtgagcta accgtagaag 4800

aattcaatgt gctagctagc aaaggtgagc tggacacacc agagttcgcc gctaaggacg 4860

tgttcattaa tatcactggg cgtgctatct gtaacattga cgacaagcag tacgtccgct 4920

cgtacggttg caacactgag gggcacttga tgaacgctgg ttacaaccac aactctaact 4980

gtcttgatgg tcaagaactg cgttacatca aataccctaa ctccactgac actgtactta 5040

tgccttacct tgacggctac gaagaacacg tagagttgtg tgacggtgcg aaaggtcagt 5100

actggagagt gtgcgatggt tactctagct catacgaagc acaaagcgcc tccggttaca 5160

tcgaaatcaa cctagaagaa tgttacgagt gtgacaaccg tactcatgaa gatgacatgt 5220

gtactgtgta tgagggtggt catgagcgtc aggtgtgtga gaactgtcgt gaccgccatt 5280

acgtgtgggt tgaccacgac caagactacc accaccaaag tgatgtgacg tactctgagt 5340

acactggcga gtacatcctt gatggtgatg tggaagtgtg cccactggtc ggcccaatgc 5400

atgaagaccg catggatgag tgtgcggcaa ctggcaagcg tgtgttcgaa gaccgtcttg 5460

ttgatggatg tttaacatcc gaagacgcgg aaacgcttgg tgttcttgac gagtggctag 5520

actaccaccg tgaagacgaa gacgaagaat aataactact acaattaagg agtcgtgatg 5580

actaacccaa acaacacaaa agctttcgaa ctactactag caatcttaag cgaagaacgt 5640

cccggtttac gtgggcaaga agtggtagcc gaagtgcttg atgctgaggg tattgagtac 5700

tcgacggaca gacatgggaa catgtttgta caagtgggtg agcgtgatga catcatgttc 5760

acaagccaca cagatacggt tgactttgac gggcaaatcc cactgtggat gggcggtaaa 5820

cctgatagtg atgaaccaca tacccctaag aagaagaagt tatgtgtcct taacgggcac 5880

ttagcactgg atgctgatgg tatttgggac tgtctcggcg ctgatgacgg tgctggtgtt 5940

gtgcttatga ttatgatgat taagcaaggc atccaaggac agtactggtt ctttgccgag 6000

gaagaagtgg ggcgcgtcgg ttcaaccgga gcgtacgagg atgacacaga gtcattcgaa 6060

aaggtgaagt ggtgtatcag ctttgaccgc cgtggtactg acatcatcca cactcagatt 6120

ggtgggcgtt gtgcctcaga tgaattcgtc gaagcactag ctgaacgctt tgaccgtccg 6180

aagtcccgta tcacgacggg tatctacact gactcggcaa cgttcatcga cacaatccct 6240

gagtgtacta acatcggtgt tggttactac agtgagcaca ctgaccgtga gacactgaac 6300

ttgaatgagt tctatgatac acttgaacac tgcttgaagc ctgagacttg ggcggagttg 6360

ccagttggcg agcgtcctgt atctaagtct gtgccttggg ttgatggcga cttcgacctt 6420

gacgattact tgaacagcct tgacaacgcc actgacattg acgaagtgct gcttgagttc 6480

ggcgctaagg gcgagttaga aatgcttgag tgggtacaga cacacccact actagcggct 6540

agtatcctat accttgcagg taatcagaca gcgcgtggtt gtatcggtaa agacattcgc 6600

cgcgctgtgg atgacgaggg gcgtaccctt gatgacctag tgcgtatgat gcgcaaaact 6660

attcagtaac ttaaactgca cttaggaggt gcttatgtat tggttaatca ttgctttaac 6720

ttggggtggc agtgctccgg ttgctgtgcc tattcaagac gaggcgactt gtatctcaga 6780

gagtaagcgc cttgaccgta ctgcgtatgt ccagtacaca ctgtgtgtta agtctagtga 6840

tgaaaaggta agaccgtgat ggacgcaccg tggttaagag cttgtaagcg tttagccatt 6900

ggtcagacta gacgctttcg ctgctgtggt gctaccgcag cggctatctt gtataacaat 6960

ccgcagtcgt gggaaatgtg gtgtaaccgc tgtaagaaga ctaccaagga gtataagaaa 7020

tatgtgcgcc ttgatgccac cgtacatgag cggagcatgc agcctatacc cacagatgct 7080

ttatgcatta gccagacgag tgcggaaata cagcactttg tgttttcata ccttacaagc 7140

aaaggtataa cgccaaacat gttggaggac gtatgtcgct tagagtggtc agagagcaaa 7200

gggcggataa tcttccgctt cgagaacgtg gttcttgggc ggagcatatc accgaacgta 7260

acgccgaagt gggttcaata tgggagcaac ttccagacat tagtgaactt gaaacccgac 7320

tgtacgcagc catcgctagt ggtacttacc gaggacacgt tgagtgcgat aaaggttcag 7380

tacgtggcga atttgttctt caagggacgc gtactggtcg tatcaacact cggcactaca 7440

atctctctaa ccgtccgggc acttttagcg tcccttatgg agcaggtggg cagtaagcca 7500

aacgtcctct gttggtacga cggagacaag gcaggagttg acggggcacg gaaagctcag 7560

aaagtactac gaccattcgc aaatgtacat cccctaacaa tcgacggcaa agacccgaaa 7620

gattgtgaac cgacacagat taaagaggtt ttatggacgc agttatcgta aaggcattgt 7680

gtgacaaagc acgctacagc aacctgttgc cttacgtccc taaagatatg ttagcaccgg 7740

atacttccgc actgcttagt tgggttggtc tttactggaa gacctatcca gagcacgacg 7800

aagtagactt tgctgcattc aatagcatgg tttcactacg agccacgcag agcacacccg 7860

aagaactggc aaccatgaaa gcactgactc atgaagtgca agcggttgac gattccagtg 7920

tcgatggggt tgtaactatg atgcatgagc tggcgtattc tggacgagcg gcaagcatcc 7980

tcacgaagta ccaagcaggt gaagaaatcg acctgatgta tgaaatgaag aagcttcaac 8040

gggagttcgg tgataacgtc aagactcaga acgagttgtt ttcatgggaa gaccgtggac 8100

tcgatgacgt actcgcagcg aacgaggagg gcgctggtct gaaattgcgc cgctttggtc 8160

agctccgtca taatatccgt gctctgcgtg gcggcgatac agtagcagtt gccgcacctg 8220

ttgatgcagg taagacatca ctgcttgctg caatcgccgc tgactttgct aaccaaatga 8280

agtgtgcccc tgagcgttat ggtgacagac ctatcctatg gctagtgaac gaatcaatgg 8340

ctgtacgaac tgtgccacgt atttaccaag cagcaacagg taagacgtta gcagagattc 8400

gtgagctgca ccgtgagggg cagttcgagc cgctgtactt agctgaggtg ggtgactggc 8460

atcgtatccg tgtcaaggat gcccactcaa tcactatgcc acagattgca acgctggtgg 8520

aagaaatgaa ccctgctgtg gtaatcattg acatggtggc aaacatccgt ggtggtactg 8580

ctgagacaga gcaccagaac ctagaagcga agtggcagga gctgcgttcg ctggcttgtg 8640

agcatgactt cctgatggtt ggtacaatgc agttcagtgc tgagggttac gatatgttgt 8700

acccaccgct gactgccttg aagcagtcta agattggtgt gcaaggtgca ttggatgtgg 8760

cactgttcat gggtaaactt aacaacgata ctgagggctt gcgagggctt agcacaccta 8820

agaacaagtg tccggtatca ggtagaccga gcgtgaacca gttcgaagtc ctgttcgacg 8880

ctcaacgatg tcaattcaat tgtggcttcg cagaatcggc tatggaggct taatggaaaa 8940

ggtgaaacgt gtgtttcatc cagacgtggg ggctaatcgc agtccccatg ctgtccgaat 9000

caagggtaaa tgtgttcgta ctggtgacga gcattactat cacagcatcg ggcaagctga 9060

gctggatggt tggtgtcgca aaggcattag aaagtgtcta cgtggcgaac aaatacagtc 9120

gaacggaatg ttctgggcgg cttgggatgg agtagagcat gagtagtgta ttatttatag 9180

acttggagac tgagaaccat gaatatcacg gtagtaaagc cagtccgtac tgtccagaca 9240

actatatcgt tgagtcaggc ttccgtattg accgcaaaca accagatgga actacagagg 9300

ttggtagcgt cggcagtgtc cgatacaact cacgagaggc tttcgttagt gctccaacaa 9360

ctgagtggct acccattccc gaagactgtt ggctcatcgt tgcacataac gccgcatatg 9420

aagtgtcatg gttcttgcaa ttcgcacgag attcatttga gggctttctt cgacgtgggg 9480

gtagagtttt ctgtaccatg cacggagagt atcttgcaac tgaccagaca tcactctatc 9540

cgagcctcga tgaaacagcc cctaaatacg gcggaactca taaagtgaat ggtattaaac 9600

tgctttggga acaaggagta cttacctccg agattgaccc catcctcttg catgaatacc 9660

tcgcagggcc gaacggcgac gttgcaaaca ccgccctatg tttctatggt cagtgtgcga 9720

cacttgccga acaaggtaag ttccccctcg tttgggaacg tatggatgcc ctgctgagct 9780

ttgcgttctg tgagtggttc ggtctgtacg tgaacatgcc agtagctcag aagaaccaag 9840

cggttcaaga agctgagatt gcagagttaa ccactcgcct cagaacgtac ctaccggatg 9900

acatgccaga agaaattgac ttcaactggg gttctgactt ccacatgtcg gcgttacttt 9960

acggtggccc gattaaatac aagaagaaag ttcactacga caagccaacg tatgtcaagg 10020

tcgatgcgta ccaactacat gaccacgtac tgcgagtcaa agaggtgtgg actgaccctg 10080

ttgatgggtt acgttacatc acacctgaga cgtacgacaa gtacggtctg tgtccagccg 10140

acgtagtaat ctataagtcc ggtaaaaaca agggcttacg taaggtgttc cgtgctaaca 10200

cgaacgaact caagatgaag tggggcgagg gtgtatacca gtgtccgggc ttgtgtaaaa 10260

tctcggagct acctgagcac ttccaagata agttcggtga gcgcggtgag ttccgtcaga 10320

accgcacctt gtgtgatggc tcaccagtgt tcagctcaag cggcgattgt atggctggtc 10380

tagccaagca gggctttgag ttcgctagtg acatttctcg attggcaaca cttgagaaag 10440

atacaggtac ttactatctg cgccatgaat atgatgacga gggtaacatc actaaatcta 10500

gtgggatgtt acagtacgtt atccctgaga agcctgatgg ttctggtatc atccaccaca 10560

gacttaacac ttgtgcaaca gtgacaggcc gtttgtcagc atcgaacccg aacttgcaga 10620

acttaccacg tgctgaggaa gacaaggacg gcaacgcgaa gtctcgtgtt aaagaaatgt 10680

ttacctcacg ctttggtgaa gatggtcgca tcattgaggt ggactactct gcgctggaag 10740

ttgtaatggg cgttgtgcat actggcgata tgaagctact tgagctgctt aaagctggta 10800

ctgatatgca ctgttaccgt ctcgcgttcc aagagaacct cgactacgaa gaagtatacc 10860

gtcgctgtca cgacgagggc tacgagttcc acccactgtg gaagtcaatg cgtactgcaa 10920

tcaaagcgcc tagttttgcg gctcagtacg gcgcgtcagc cgctggtatc gcattcgcta 10980

ctggttgtac tgtcgaattc gcccaagcgt tcctagacaa cgaggcggcg ctattccctg 11040

atactgcgaa gttccgtcag gtaatccggg atgaagtcga gcgcactggt aacttaccgg 11100

gtaacttgaa acgtgaaatg accgacgatg gctctgtccg cctgtaccgt cgtggctact 11160

ggacatcacc tgctggtatg cgttacagct tccgtcaggt tgaacgttgg gttaagcgtg 11220

ctgatggtcg tggcatggaa aaagtcatgg actacaagga tacacagctt gctaactact 11280

ggtgtcaagg cgaggcgttc ttcctcatgg cggttgcatt cggtatgatt ctgcgccata 11340

tgattgctaa gaactggtat gacaaccaag tgtgcctaat cacgaacgtt cacgatgctg 11400

cgtacctaga cgctgctaat gaagaagtag ggcgtgaggc tgcactggct gtgaaagaca 11460

tcatggagcg tgctaaagac cgcatcctgc aactgtggcc taactacggt cacttgaaag 11520

acgtaccgtt ccctgctgct gcggaaatgg gttcatcaat gtacaacaaa acacacattc 11580

actaagagag agattctact atggctacta tccgactaaa cgctgacaaa cgccgcgcaa 11640

ttctgaacaa catcatgact gagtggaaag ctaagcaccc tgccccaacc gctcctaaaa 11700

tgaatgcacg agctgctttc gttaaagctt atcaagagct gtggtataaa cgctcaggca 11760

ttgagaaagc tgtgcagaac ggcctcacac ctacagcgct gcataccagc tcatcattgc 11820

acctgtacat tcaagaccgc actggcaaag ctttgggtac ggtttgggaa tactttcgtg 11880

atggtgagaa cagtactgtt caactgcgtg taccaaacgc cacaacggta gtttacaacg 11940

acgacccact gtacctacag tacttgaaag acaagggtgc tgatgacaag tacacaattg 12000

atgtagagca gtggcacgaa gaacgccgcg cccaagagcg tgtgtacaag caagcacttg 12060

aacagttcaa gacgcttaaa cagttgactg acggttggga cggtattgag aagtacctac 12120

cagaagaatt tgaagtgcag acaactgctg tggctattat cccacaacta ccataggagt 12180

gcgtatggat aagcatgtac tagatattgc agcacgtgac atcactcagc ttatccactc 12240

tactatcaac cgcccgtatg aagtggcggt tgctggtggg gcggtgcgag atatggcacg 12300

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gcctcaactg agttggggat gtcgtctatc caatctcttg gtacgtcgct aggtcgctca 18300

gtgcaatcag aaatcatagc tcagaatgct gaggtggttg cacctgcgta catgaaccga 18360

gtgtacgagt acttgaaaga gcacaagacg cgttcccaat ctcatatctt gcgtacgttc 18420

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cacgaagaca tttacaacgg cggttactta actgacctga gtcgtcgtca tacgtactcg 18720

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tacgacttgg tactgcaagc caaggctact ggctttgacg ttggtatccc gagccaccat 18900

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gatgaagatg cactgtactt cccgacttgt gttgactggc gttaccgcct gtacttcaaa 19140

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tatgagtcga acattgcggt tgcactggat gccactaact ctggtggtca acacttctct 19500

gcaatgctac gtgacccaat cggcggtaag ctaacgaacc tattctggga cggtaactta 19560

accaaggccg acctgtacat ggacgtcaag cagcgtactg actcgaaaat caaggttgcc 19620

ctacgtgacc ctgagacaat cgtgcaagcg cattactgga cattgaaccc tatcacacgt 19680

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gaacaagagg aaaagtacgg cgacacatta gccccgtaca tcaagatgct gattgaacag 39480

ggcgcacgac gcactggctt tggcgttgat ggtacgcttg gagaaactac tgaccctcaa 39540

cgttacgacg aggaagcgtt gatagagaaa gagctggact tcggcccaga gggtttcgca 39600

ttacagtaca tgctggacac aaccttatca gatgcgatgc gtacgcgtat caaactgtct 39660

gatatgatta tccatgctgg cgattcgaac tctgcaccgg atatgttcag ttggacagcg 39720

gataaacgtg ccctttaccc agaggtgcat gatggtgtcc ttggtgcacg cttgtacact 39780

cctttgagca ttgggactga gattatcccg tacaagcaca aagtcatggt aatcgaccct 39840

gctggttgtg gtggtgatga aatctccttt gcaatcggtg gtgctgctag tgcgtacgtg 39900

cacttgttcg gcacaggcgg tttccaaggt ggtgtatctg aggaaaacat gaaccgcttg 39960

attgacttag ctgaggactt cgaagttaag gacatcgtta tcgagagcaa catgggtcat 40020

ggtacagtta caatgctgtt ccagaacgcc ctagcgcagc gtgacattgc acacatcggt 40080

gtgcgcgact tacgtaacag tacgcagaaa gagcgtcgta tcatcgacac tatctctccg 40140

gttactcgtc gtcaccgcct agttgtccat acgtctgcat tagacatgga catcgagtgc 40200

tgtatggcat atccacgtga ccgccgttgg cagtacagtg cgttcctgca attacaggac 40260

atcacgtacg acaaaggctg tctggctaag gatgaccgcg cagatgctat cgctatgttg 40320

gttcaagaac tgaatgccca cttagttgag gacgaacgtt cagccgctga gaaagcacta 40380

caaatgcgtg tagccgagtt cattctgaac ccaatggctt accaaggcgt agacactcgc 40440

ccacgcaaca aaggcactgc aagccgccta tcggtagctg gcaagccact tcataaacga 40500

actggtatcg gagtaggcac aggcacattg tctcgtctga actcacgaca ccgtaaacga 40560

ggtagactat gaacaaacga ctagactcat ttaaacgcga agactggttt ggtcttctac 40620

gtacaattgc tgactttatc ctacgtcgca aaaacaagta atgtaaggag ctgctaatgg 40680

cagagaaaga tactgtcttc atgcaggact ttgaggacaa atctacacga gaaatccttt 40740

tagaccacga acgacggtta ttcgctatgg aacagacaca gaaagaactt gcagacagtt 40800

tgaagcaaat gcgtgaagac tccgcagaaa tgttgaagac ctttaaggaa gttgcacctg 40860

tggttaagaa gaccctgtac ttcttagcag gtgtgggtgc tgtgtactta gtgggtgggg 40920

atggtaagct tttagagact gccgttaacg tcgctactaa actagctgca atgtaggaga 40980

ttgtatgcaa atcgtaattc cgtatcgcat tccgggatta ccagtgattc cttggttacg 41040

ggctgctgtg cgcactaacg ctgtgcagca gttcccacga ctcgatacag tgctgtgggc 41100

agaccgcgag gcgttccgtc aggaaatgta ctcacgctac cctgcactgc gtccgggtca 41160

agttgaactt atccttggtt ggccttggcc tgaccctgaa cctgctgagg gttcgccgtg 41220

gtcagatggt tggtcagatg gattcggtac aggtgcaccg ccaccgacgt acacacacga 41280

gttgacatcg gctgacttga ctgcaactgt actaggcttt aacccatcaa acggtagtat 41340

cacaccaccg gatttagatg gttgggcatt gtatgcattc gaggtgaaca gttcaagtaa 41400

cttcgttcga ctaacaccag tagaccctgc tgtgacatgg acagcggtta ctgtggaata 41460

cgctggtatc agcatccgta tggcacgctc tggcaaccgc tacgactcgc cgactggccc 41520

tgctgctgat gacctgtata atgcgctaaa accattcgta ggctcacctg tgggcattac 41580

attgacaccg gaggtataat ggctacggta aagaaattaa atgcactagc ggctgatatt 41640

caggcgttaa tgccagacaa caacgagggc ttcatcgtgc cagcttcggc acgtgagctt 41700

tatgacaaca tcatggtcag tgttattgac gccaagggcg tactcgacat gaccaacaac 41760

acaactgagc agtcactgag tgcaaccgct gtccctgtgt tgaactggac agccacctac 41820

aaagatgacg gtatggactt caatgctgca ttaggctcag tcactgcgta cgcacaggct 41880

ggctggtggc acgagttccg ctttgtgtgt actatcacag gcgtccagaa ccgcattgta 41940

acagcgacgt tgtacatcaa cgaccaacct accactgtac agagtcaggt acgtctagat 42000

ggtgctaaca gtcctgtaat catccagttg gatgcactac ctacagtgac gggtgctgct 42060

gatacattca gtgttaagct gagtgctgac caaccgacta acgtattaat cccacgtgga 42120

ttcatgcaga ttgtccgtaa accaacccaa taaggaatag tatgctaatt aaagacacgt 42180

tgaactttaa aatctctaag ttcgcgtgtc agcactgtgg ggctttgaaa ctagacttag 42240

ccctgcttat gctggcacag atggtacgag aacacttcgg agaaccgcta aaggttgaat 42300

ccggttatcg ctgcccaaca cacaatgaag ccgtaggcgg tgctgccgac tctcgtcact 42360

tacatggtga tgcagtggac ttgcacctgc tgaacaaaga ccgagggaac ttccagaagc 42420

tccagaagct ctatgacgta gctttagctc tgaatcctaa tggtggtata ggtctgtacg 42480

actggggtgt acacattgat acacgcggtg agaaagcccg atgggattac cgctctgaca 42540

agtataagca agcaatgggg aaattgaatg tctgaacata aggtaacaca ggaactcgta 42600

gagtccaagg ttaagtctga gcagtacgtg gttgtaccgg gtactacgct aacgttctgt 42660

gtgttaacac tagagaatgg cttcactgtc acaggtgagt cagcttgtgt tgacccagag 42720

aacttcgaca aagcggttgg agagcattgg gctaaggtag atgccatgaa gaaagtgtgg 42780

cctcttgaag cgtacctgat gaagcagaag ctgtatgagg ctgagctaga gaaagagcgt 42840

acgttcttag caatggcagt tcgtggtgaa gcgcagcgaa gtgaaacgaa gcaagctgaa 42900

cacaacgcgg tgtacgaggg ttaagccctt gacacgaagt gtccatgtgt agagagtgga 42960

aagctaatgg aaagccagtg gtgacatggg gaaagcctgt gaaagccatt ggcaatcaga 43020

cgcaaaaccc tgcacaagaa aaatgttata ctcaggcgag ggggttctcc ctcatccacg 43080

cgcgcgtttc ccccgtaggg gtgcgtgtgt gtgcgctggc gtgcgtgcgc tcgcgtgtgc 43140

gtgtgtgggc tatccagcgc gtgcgcgtgt gtgcgtgctg ctatccgtgg gaaagcgact 43200

agaaagcctt gtgctatccg tgtgattgct tgcggctgcg tgggcggcgc ggctgtgctc 43260

tgcgcttgcc tttttttgct cacctgttaa ctcactggct tgtcgcctgt cagcctatgg 43320

ctatctactg gctatccact tgttaacgta tggcatctgc gatgcgctac gctatccact 43380

tgttagcact cgctatc 43397

Claims (10)

1.一株烈性副溶血性弧菌噬菌体vB_VpP_FE11，其特征在于，其于2020年9月14日在广东省微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏编号为GDMCC No: 61187-B1。

2.含有如权利要求1所述噬菌体作为活性成分的药物组合物。

3.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，进一步还包含药物上可接受的助剂，优选地，在药物组合物中的噬菌体效价≥10⁵ pfu/mL。

4.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物用于人或动物，例如鱼、虾、蟹、贝水产动物，以防治食源性副溶血性弧菌感染的疾病。

5.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述疾病为南美白对虾急性肝胰腺坏死病。

6.如权利要求1所述的噬菌体在制备预防或治疗食源性副溶血性弧菌引起的疾病的药物中的用途。

7.一种用于防治食源性副溶血性弧菌感染的杀菌组合物，其特征在于，其含有权利要求1所述的噬菌体作为活性成分。

8.如权利要求7所述的杀菌组合物，其特征在于，所述杀菌组合物是水体消毒剂。

9.如权利要求8所述的杀菌组合物，其特征在于,所述水体消毒剂还包含其他相配合的杀菌活性成为或助剂，所述噬菌体的效价≥10⁵ pfu/mL。

10.一种包含如权利要求1所述的噬菌体的水产动物饲料添加剂，优选地其用于对虾饲料的添加剂。

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