CN115197919A - 弧菌噬菌体组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，具体涉及弧菌噬菌体组合物及其制备方法和应用，所述弧菌噬菌体组合物包括：弧菌噬菌体VpST‑1、弧菌噬菌体VpA‑1和弧菌噬菌体VpC‑1中的至少一种。本发明提供的这种弧菌噬菌体组合物可裂解耐药菌，治疗弧菌感染引起的疾病，在复杂细菌的环境中不会对益生菌造成伤害，效价高，大规模生产成本低，防治效果好。本发明提供的弧菌噬菌体组合物可选择包括多种弧菌噬菌体，避免单一噬菌体容易产生抗性的问题，扩大宿主谱范围，有效抑制宿主菌抗性的产生，具有快速高效的裂解作用，并且通过噬菌体之间的协同作用降低了在相等条件下单株噬菌体的添加剂量，起到了节约成本的作用。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及弧菌噬菌体组合物及其制备方法和应用。
背景技术
我国是水产养殖大国。近年来，我国的水产养殖业获得迅猛发展。随着海水养殖规模的日益扩大和集约化养殖方式的不断推广，疾病的频繁发生对水产规模化养殖的健康发展造成了严重的威胁。水产养殖的病原体主要包括细菌、病毒、寄生虫等，其中细菌性疾病是对危害程度较为严重的一类疾病。
弧菌是能运动的芽孢短杆状细菌，广泛分布于近海岸、河口海区海水及生物体内，是海洋中最常见的细菌类群之一，同时也是引起海水养殖鱼虾细菌性疾病最重要的病原菌。弧菌的致病强度与宿主的生理状态及水质环境条件等综合因素有关，属于条件性致病菌，其主要通过口或伤口感染，产生毒素，致使伤口肌肉溃烂化脓以及内脏器官的严重病变从而导致鱼虾类的死亡。由弧菌引起的疾病又称弧菌病，具有“流行面积广、发病率高、致死性强”等特点，是水产养殖动物的主要疾病，同时也被确定为是阻碍水产养殖业发展的重要限制性因素，给养殖业造成了巨大的危害。其中鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)和杀鲑弧菌(Vibrio salmonicida)等弧菌引起的弧菌病被认为是鱼虾类养殖中最为严重的病害之一。早期死亡综合征，也称作肝胰腺急性坏死综合征影响的主要对虾种类包括凡纳滨对虾、斑节对虾和中国明对虾在内的多个主养品种，其中凡纳滨对虾和斑节对虾的死亡率最高。由于该病发病急、造成的死亡率高、流行范围广，对对虾养殖业危害严重，备受关注。亚利桑那大学的研究已经确定，该疾病是由细菌剂副溶血弧菌引起的，副溶血弧菌通过口腔传播并定殖于虾的胃肠道，并产生毒力蛋白，导致虾消化器官的组织破坏和功能障碍。
目前针对水产养殖相关动物疾病的预防和控制方法主要以化学抗生素法和免疫疫苗法，其中以化学抗生素使用为主。作为当前控制水产动物疾病的主要手段，化学抗生素法具有使用方便、见效快和疗效好等优点。但是，大批量频繁使用抗生素在控制病原菌的同时，极大了助长了病原菌的耐药性，并加速了广谱耐药菌的产生。这使得致病菌的耐药性问题日益严重。此外，化学药物残留也是导致人类食源性疾病产生的重要原因之一，对人类健康造成严重危害。
噬菌体又称细菌性病毒，是一类专一性裂解细菌的病毒，在环境中分布广泛、种类多样、结构简单，具有很强的宿主特异性。最重要的一点，噬菌体裂解细菌的机制不受细菌耐药性的影响，其通过受体识别从而吸附在特定宿主菌表面，将自身遗传物质注入宿主体内进行自我复制组裝，并最终通过裂解宿主菌释放子代从而实现自我的生长繁殖。因此，噬菌体疗法是一种很有前景的预防和治疗弧菌疾病方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中抗生素使用受限及耐药菌泛滥的问题；同时，针对噬菌体培养过程中可能伴随宿主菌毒力蛋白释放的问题，本发明提供一种弧菌噬菌体组合物，及无害化的噬菌体制备方法和应用。
为此，本发明提供了一种弧菌噬菌体组合物，包括：弧菌噬菌体VpST-1、弧菌噬菌体VpA-1和弧菌噬菌体VpC-1中的至少一种，所述噬菌体VpC-1 的保藏编号为CCTCC NO:M20211704，保藏日期为2021年12月30日，分类命名为Myoviridae。
具体的，上述弧菌噬菌体组合物的效价为109PFU/mL-1012PFU/mL。
具体的，上述弧菌噬菌体组合物的感染复数MOI为0.1-10。
本发明还提供了上述弧菌噬菌体组合物的制备方法，包括以下步骤：选择无致病基因的弧菌作为宿主培养弧菌噬菌体，培养时间为12-20小时，培养温度为28℃-32℃，转速为200rpm-240rpm，培养结束后离心过滤去除宿主菌。
具体的，上述无致病基因的弧菌为溶藻弧菌VA-3和/或溶藻弧菌 VP-18。
具体的，上述弧菌杀菌剂还包括以所述弧菌噬菌体组合物的体积计为 30％-60％的辅剂。
具体的，上述辅剂包括分散剂、稳定剂、填料和溶剂中的至少一种。
本发明提供的这种弧菌杀菌剂在控制由弧菌引起的水产动物致病菌中有广泛应用。
具体的，以养殖水体体积计，所述弧菌杀菌剂的使用剂量为10mL/cm3。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
(1)本发明提供的这种弧菌噬菌体组合物可裂解耐药菌，治疗弧菌感染引起的疾病，在复杂细菌的环境，例如动物肠道发生杀菌作用时，不会对益生菌造成伤害，效价较高，大规模生产成本低，防治效果好。此外为避免单一噬菌体容易产生抗性的问题，本发明提供的弧菌噬菌体组合物可选择包括多种弧菌噬菌体，形成噬菌体鸡尾酒组合，扩大宿主谱范围，有效抑制宿主菌抗性的产生，具有快速高效的裂解作用，并且通过噬菌体之间的协同作用降低了同条件下单株噬菌体达到相同杀菌效果所需剂量，起到了节约成本的作用。
(2)噬菌体目前的传统制备方式是由需杀灭的目标宿主菌培养，由于使用致病性弧菌培养噬菌体时，噬菌体会裂解弧菌导致弧菌体内毒力蛋白的释放，使噬菌体培养液含有毒力蛋白，对后续噬菌体的治疗和预防效果造成影响。本发明提供了一种利用无致病性弧菌制备弧菌噬菌体组合物的方法，制备的噬菌体组合物内不含导致水产动物发病的毒力蛋白，有效避免了噬菌体培养液含有毒力蛋白而对后续噬菌体的应用产生影响。
以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1是本发明实施例1中弧菌Pir致病基因检测结果示意图。
图2是本发明实施例1中10株包含Pir致病基因的弧菌的进化树。
图3是本发明实施例3中VpST-1、VpA-1和VpC-1及其组合对4株致病弧菌的抑菌曲线；其中A为对副溶血性弧菌VP-6的抑菌曲线；B为对副溶血性弧菌VP-B3的抑菌曲线；C为对副溶血性弧菌VPAH-1的抑菌曲线； D为对副溶血性弧菌VPAH-5的抑菌曲线。
图4是本发明实施例5中VpST-1、VpA-1和VpC-1在不同的MOI下对宿主菌VP-6的抑菌曲线。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。尽管已经详细描述了本发明的代表性实施例，但是本发明所属技术领域的普通技术人员将理解，在不脱离本发明范围的情况下可以对本发明进行各种修改和改变。因此，本发明的范围不应局限于实施方案，而应由所附权利要求及其等同物来限定。
下面通过具体实施例对本发明的弧菌噬菌体组合物的效果进行研究。
实施例1：致病性副溶血弧菌及其噬菌体的分离
在广东省内的各南美白对虾养殖场采集病死对虾，从病灶中分离得到上弧菌，如图1所示，通过PCR鉴定确定其中10株弧菌基因组中包含Pir 致病基因，该Pir基因会转导独立蛋白的合成和释放，对虾感染实验表明这 10株弧菌会造成对虾产生急性肝胰腺坏死综合症，10株弧菌的进化树如图 2所示。
采集广东沿海海水及污水样本，8500g离心10min后取12mL上清液并除菌，将其与6mL的3×2216E液体培养基及200μL的培养至对数期的副溶血性弧菌VP-6均匀混合，30℃下150rpm过夜培养。次日将样本富集液 8500g离心10min，取上清液经0.22μm的滤膜过滤除菌得到含有噬菌体的滤液。取100μL滤液与200μL处于对数期的VP-6菌液均匀混合，将混合液加入3mL冷却至50℃的含有0.7％琼脂的2216E培养基，混匀后铺于已凝固的琼脂浓度为1.5％的平板上，待琼脂凝固后于30℃倒置培养过夜，观察噬菌斑生长情况。若形成噬菌斑，则挑取噬菌斑至1mL的2216E培养基中，梯度稀释并与VP-6菌液混合后重复上述铺板操作对噬菌体进行纯化，纯化3次后得到形状和大小一致的噬菌斑，取单个噬菌斑与30μL对数期VP-6菌液混合后加入3mL的2216E培养基过夜震荡培养，次日将培养液离心过滤得到无菌的噬菌体培养液，加入终浓度为20％的甘油置于-80℃冰箱中保存。
本实施例得到三种弧菌噬菌体：VpST-1、VpA-1和VpC-1。
实施例2：分离得到的噬菌体对10株致病性弧菌的裂解能力测定
对培养至对数期的10株含致病基因的弧菌浓度进行测定，并调节浓度为1×109CFU/mL；用双层平板法测定噬菌体VpST-1、VpA-1和VpC-1 的浓度，并调浓度为1×109CFU/mL。在96孔酶标板中进行实验。
对照组：每孔加入10μL菌液和190μL 2216E液体培养基；
实验组：每孔加入10μL菌液、100μL噬菌体培养液和90μL 2216E液体培养基。
每组3个重复，30℃恒温持续震板，测定600nm处OD值，总时长22h，绘制生长曲线。测定结束后将各实验组生长曲线与未加入噬菌体的对照组生长曲线进行比较，若加入噬菌体后OD600出现降低，且实验组的OD600最小值＞0.5，则该噬菌体能侵染对应菌株，标记为+，若实验组的OD600最小值≤0.5，则该噬菌体对对应菌株有较强的裂解能力，标记为++，若加入噬菌体后生长曲线与对照组无区别，则该噬菌体不能侵染对应菌株，标记为-。结果如表1所示。
表1噬菌体对10株致病性弧菌的裂解能力测定
实施例3：噬菌体的筛选
比较致病性弧菌及致病性弧菌+噬菌体的生长曲线，筛选出同时满足以下条件：抑菌时间较长(抑菌时间≥10h)，裂解能力较强(OD600≤0.5) 及宿主谱较广(可裂解致病性菌株≥5株)的噬菌体用于制备弧菌噬菌体组合物，根据表1及测定结果，噬菌体VpST-1和VpA-1都分别可裂解7株致病性弧菌，VpC-1可裂解10株致病性弧菌，其中VpST-1、VpA-1和VpC-1 分别对1株、5株和2株致病菌有较强的裂解能力。
VpST-1、VpA-1和VpC-1及其组合对部分致病性弧菌的抑菌曲线如图 3所示，2株以上噬菌体组合成噬菌体鸡尾酒制剂能显著提高噬菌体的抑菌效果，其中VpST-1、VpA-1和VpC-1混合成的噬菌体鸡尾酒效果最佳，多株噬菌体联用效果优于单株噬菌体，因此选择VpST-1、VpA-1和VpC-1制备本发明的弧菌噬菌体组合物。
噬菌体VpST-1、VpA-1和VpC-1均保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心；保藏时间为2022年01月06日。经保藏中心于2022 年01月06日检测为存活。
噬菌体VpC-1的保藏编号为CCTCC NO:M 20211704，保藏日期为20221年12月30日，分类命名为Myoviridae。
实施例4：噬菌体制剂的无害化制备
根据图2的PCR结果显示，VA-3和VP-18不含会释放毒力蛋白的Pir 基因，因此选择无致病基因的溶藻弧菌VA-3培养噬菌体VpST-1和VpA-1，溶藻弧菌VP-18培养噬菌体VpC-1。
本实施例使用的溶藻弧菌VA-3保藏在中国典型培养物保藏中心 CCTCC，保藏编号为CCTCC NO:M 20211704。
将培养到对数期的弧菌作为种子菌，按体积比1:100接种到无菌2216E 液体培养基中，单个培养体系为500mL，在30℃条件下以220rpm的转速震荡培养3小时得到菌液，将噬菌体浓度为109PFU/mL的噬菌体种子液以体积比1:10接种到菌液中，继续培养20小时。培养结束后培养液经8500g 离心10min，取上清液经切向流过滤系统过滤得到无菌的噬菌体液。将 VpST-1、VpA-1和VpC-1噬菌体液等体积混合并加入50％辅剂制备成弧菌杀菌剂，采用双层平板法测得噬菌体VpST-1、VpA-1和VpC-1及弧菌杀菌剂中的噬菌体效价如表2所示，结果表明利用不含致病基因的弧菌培养可裂解致病性弧菌的噬菌体是可行的。
表2用无致病基因的弧菌培养所得的噬菌体效价
| 噬菌体 | 培养菌株 | 效价(PFU/mL) |
| VpST-1 | VA-3 | 1.9×10<sup>11</sup> |
| VpA-1 | VA-3 | 4.0×10<sup>11</sup> |
| VpC-1 | VP-18 | 4.8×10<sup>10</sup> |
| 弧菌杀菌剂 | — | 2.8×10<sup>11</sup> |
实施例5：不同MOI对VP-6的抑制效果
对培养至对数期的副溶血弧菌VP-6浓度进行测定，并调节浓度为1× 109CFU/mL；用双层平板法测定噬菌体VpST-1、VpA-1和VpC-1的浓度，并调浓度为1×109PFU/mL，在96孔酶标板中进行实验。
对照组：加入10μL菌液和190μL 2216E液体培养基；
实验组：加入10μL菌液后，按MOI＝10、1、0.1分别加入100μL，10μL， 1μL噬菌体培养，以2216E液体培养基补足至200μL。
每组3个重复，30℃恒温持续震板，测定600nm处OD值，总时长22h，绘制生长曲线，如图4所示。VpA-1在各MOI下对VP-6都有明显的抑制效果，VpST-1和VpC-1则在MOI＝10的条件下才能对VP-6有抑制效果。由于致病性弧菌在水体中的浓度达到105CFU/mL以上时就有可能导致对虾发病死亡，结合实施例4中弧菌杀菌剂的效价，本发明提供的弧菌杀组合物在控制水产养殖弧菌感染中的推荐使用剂量为10mL/cm3养殖水体。
以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种弧菌噬菌体组合物，其特征在于，包括：弧菌噬菌体VpST-1、弧菌噬菌体VpA-1和弧菌噬菌体VpC-1中的至少一种，所述噬菌体VpC-1的保藏编号为CCTCC NO:M 20211704，分类命名为Myoviridae。
2.如权利要求1所述的弧菌噬菌体组合物，其特征在于：所述弧菌噬菌体组合物的效价为109PFU/mL-1012PFU/mL。
3.如权利要求1所述的弧菌噬菌体组合物，其特征在于：所述弧菌噬菌体组合物的感染复数MOI为0.1-10。
4.如权利要求1-3任意一项所述的弧菌噬菌体组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：选择无致病基因的弧菌作为宿主培养弧菌噬菌体，培养时间为12-20小时，培养温度为28℃-32℃，转速为200rpm-240rpm，培养结束后离心过滤去除宿主菌。
5.如权利要求4所述的弧菌噬菌体组合物的制备方法，其特征在于：所述无致病基因的弧菌为溶藻弧菌VA-3和/或溶藻弧菌VP-18。
6.一种水产弧菌杀菌剂，其特征在于：所述弧菌杀菌剂包括如权利要求1所述的弧菌噬菌体组合物。
7.如权利要求6所述的弧菌杀菌剂，其特征在于：所述水产弧菌杀菌剂还包括以所述弧菌噬菌体组合物的体积计为30％-60％的辅剂。
8.如权利要求7所述的水产弧菌杀菌剂，其特征在于：所述辅剂包括分散剂、稳定剂、填料和溶剂中的至少一种。
9.如权利要求6-8任意一项所述的弧菌杀菌剂在控制水产养殖弧菌感染中的应用。
10.如权利要求9所述的水产弧菌杀菌剂在控制水产养殖弧菌感染中的应用，其特征在于：以养殖水体体积计，所述水产弧菌杀菌剂的使用剂量为10mL/cm3。
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Citations (2)
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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