CN111549003A - 副溶血弧菌噬菌体、蛭弧菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物防治技术领域，具体涉及一种副溶血弧菌噬菌体VP‑HYP MCS‑1、蛭弧菌Halobacteriovorax sp.MCS‑1组合物及其在防治对虾致病性副溶血弧菌感染中的应用。副溶血弧菌噬菌体为副溶血弧菌噬菌体VP‑HYP MCS‑1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19693。副溶血弧菌蛭弧菌为副溶血弧菌蛭弧菌Halobacteriovorax sp.MCS‑1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19694。本发明分离获得的烈性噬菌体VP‑HYP MCS‑1，其宿主专一性强，对副溶血弧菌具有裂解和杀灭作用；分离获得蛭弧菌Halobacteriovorax sp.MCS‑1，其宿主谱较广，对包含副溶血弧菌在内的多种弧菌具有裂解和杀灭作用；本发明提供的副溶血弧菌噬菌体和蛭弧菌在防控对虾致病性副溶血弧菌感染中具有很好的应用前景。

Description

副溶血弧菌噬菌体、蛭弧菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物防治技术领域，具体涉及一种副溶血弧菌噬菌体VP-HYP MCS-1、蛭弧菌Halobacteriovorax sp.MCS-1组合物及其在防治对虾致病性副溶血弧菌感染中的应用。

背景技术

近年来，我国的水产养殖业迅猛发展。随着海水养殖规模的日益扩大以及集约化养殖方式的推广，经济效益逐步提高。但是，水产养殖动物细菌性疾病的频发给养殖业造成了巨大的危害。其中，以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、杀鲑弧菌(Vibrio salmonicida)以及副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)等弧菌引起的弧菌病最为严重。

对虾作为我国主要的水产养殖动物之一，在渔业经济中占据着重要的地位。但是，由于副溶血弧菌造成的急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopancreas necrosis disease,AHPND)给对虾养殖业造成了巨大的经济损失，对虾一旦感染上致病性副溶血弧菌，致死率极高。

目前，预防和控制副溶血弧菌造成的水产养殖动物疾病主要包括化学抗生素法、免疫疫苗法以及微生物防治法，其中关注最多的是微生物防治法。虽然，化学抗生素法的使用方便、见效快和疗效好。但是，大面积使用抗生素，在控制致病菌的同时，也极大的加速了细菌耐药性的产生。此外，化学药物残留可能会经过食物链的传递对人类健康造成严重危害。因此，减少抗生素的使用，开发绿色的抗生素替代品成为了当前科学研究的热点。另外，部分水产养殖企业使用的水产疫苗，尽管能够增强水产养殖动物免疫力，预防相关疾病的发生，但是存在以下不足：疫苗研发基础相对薄弱，研发周期较长；渔民对疫苗认可程度不高；给苗操作方式的不同产生的疗效差异很大。因此，利用自然界已有的生物控制水产养殖动物细菌性感染成为了研究重点，其中包括抗菌防治法、蛭弧菌防治法以及噬菌体防治法，使用这些微生物防治方法的优点主要体现在对环境无污染，且不会破坏生态环境。

作为应对细菌性疾病的方法之一，噬菌体防治法受到了极大的关注。噬菌体(细菌性病毒)是一类专一性裂解细菌的病毒，广泛分布于环境中，种类多样，结构简单，宿主特异性较强。噬菌体裂解细菌的方式是通过受体识别从而吸附到特定的宿主细菌表面，将遗传物质注入到宿主体内，利用细菌的代谢系统完成自身繁殖过程，组装完成后裂解宿主菌释放子代病毒。正是由于噬菌体独特的裂解方式，应用噬菌体控制致病菌的研究引起了科学界的广泛关注。但是目前单一噬菌体疗法在应用过程中存在一些潜在的缺点，如宿主范围窄，宿主菌易产生抗性等，其中宿主菌产生抗性是单个噬菌体应用的主要缺陷。

另外一种微生物防治法-蛭弧菌防治法，该方法主要是利用蛭弧菌能够寄生于其他细菌进而裂解细菌，且其在裂解完成宿主细菌后，会因饥饿而自动消亡，对人和动物无毒副作用的特性。与此同时，蛭弧菌进入到宿主菌的周质空间，主要是利用宿主菌的周质空间作为营养供给来源，减少了宿主产生抗性的可能性。其次，蛭弧菌的宿主谱较广，能够裂解多种致病性弧菌。但是，目前大部分研究是使用大肠杆菌作为宿主菌培养蛭弧菌，在生产应用中很难完全去除未裂解的大肠杆菌以及蛭弧菌发挥作用时间相对较长；且噬菌体治疗存在宿主范围窄，易产生抗性菌等缺陷。

如上所述，单一噬菌体防治法存在宿主范围窄，宿主菌易产生抗性等缺陷，而单一蛭弧菌防治法发挥作用时间较长，易引入未完全去除的宿主细菌等缺陷。但目前国内已有很多与单一蛭弧菌和噬菌体相关的专利文献报道称二者均可以在一定程度抑制宿主菌的繁殖，那么如何高效的利用两种微生物各自的特性来发挥更好的效果成为了亟需解决的问题。

发明内容

针对目前单一噬菌体感染易产生抗性突变，蛭弧菌繁殖时间较长等缺点，本发明目的在于提供一种副溶血弧菌噬菌体VP-HYP MCS-1、蛭弧菌Halobacteriovorax sp.MCS-1组合物及其在防治对虾致病性副溶血弧菌感染中的应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种副溶血弧菌噬菌体，副溶血弧菌噬菌体为副溶血弧菌噬菌体VP-HYP MCS-1，已于2020年4月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19693。

副溶血弧菌噬菌体的应用，所述噬菌体在预防或治疗由副溶血弧菌引起的弧菌病感染中的应用。

所述噬菌体在作为对虾饲料添加剂中的应用。

一种用于预防或治疗由副溶血弧菌引起的弧菌病感染的组合物，以所述的副溶血弧菌噬菌体VP-HYP MCS-1、噬菌体分离物或噬菌体培养物作为活性成分。

一种副溶血蛭弧菌，副溶血蛭弧菌为副溶血蛭弧菌Halobacteriovorax sp.MCS-1已于2020年4月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.19694。

副溶血蛭弧菌的应用，所述副溶血蛭弧菌在预防或治疗由副溶血弧菌引起的弧菌病感染中的应用。

所述蛭弧菌在作为对虾饲料添加剂中的应用。

一种用于预防或治疗由副溶血弧菌引起的弧菌病感染的组合物，以所述的副溶血蛭弧菌Halobacteriovorax sp.MCS-1、细菌分离物或细菌培养物作为活性成分。

一种用于预防或治疗由副溶血弧菌引起的弧菌病感染的组合物，以所述噬菌体和所述蛭弧菌混合的菌液、分离物、培养物或重悬液作为活性成分；其中，噬菌体和蛭弧菌效价1：1比例混合，噬菌体和蛭弧菌的生物个体数量相同。

所述活性成分与赋形剂复配混合的组合物制备相应的组合物制剂；其中，赋形剂可为SM缓冲液、葡萄糖或蔗糖；活性成分占组合物质量的1-10wt％。

所述剂型为水剂或粉剂。

组合物的应用，所述组合物在预防或治疗由副溶血弧菌引起的弧菌病感染中的应用。其中，组合物为含所述噬菌体、含所述蛭弧菌或含所述噬菌体和所述蛭弧菌混合。

所述组合物在制备作为用于水产养殖清洁剂或者消毒剂中的应用。其中，组合物为含所述噬菌体、含所述蛭弧菌或含所述噬菌体和所述蛭弧菌混合。

所述组合物在作为对虾饲料添加剂中的应用。其中，组合物为含所述噬菌体、含所述蛭弧菌或含所述噬菌体和所述蛭弧菌混合。

上述由副溶血弧菌引起的弧菌病感染的病变可为对虾急性肝胰腺坏死病。

本发明具备的有益效果：

本发明利用副溶血弧菌作为宿主菌分离获得了一株新的烈性副溶血弧菌噬菌体和一株蛭弧菌，本发明的副溶血弧菌噬菌体VP-HYPMCS-1具有宿主专一性强，在短时间内具有强力杀灭细菌的能力；同时，副溶血弧菌蛭弧菌Halobacteriovorax sp.MCS-1具有裂解谱广，可以裂解多种致病性弧菌，疗效持久，两者均能杀灭副溶血弧菌；

本发明进一步的结合噬菌体疗法和蛭弧菌疗法，利用噬菌体能够在短时间内裂解细菌，而蛭弧菌的宿主范围较广，不易产生抗性菌的特性，将所述新的烈性副溶血弧菌噬菌体和一株蛭弧菌结合，解决目前蛭弧菌和噬菌体使用过程中出现的一系列问题；进一步将上述两者按一定比例(1:1)进行混合使用，可以有效避免单一噬菌体或者单一蛭弧菌的弊端，能够有效的裂解样品中的副溶血弧菌，能够在短时间内杀灭副溶血弧菌且长时间维持杀菌效果；并且可以有效控制养殖体系中副溶血弧菌的数量，能够应用于水产养殖业，且该制剂具有绿色环保、使用安全与高效的优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，附图用来提供对发明的进一步理解，本发明的一些实施方式及说明用于解释本发明，对于本领域普通技术人员来讲，可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提的基于16S rDNA序列构建的菌株MCS-1与相近典型菌株的系统进化树；

图2为本发明实施例提的副溶血弧菌噬菌体VP-HYP MCS-1的平板培养照片；

图3为本发明实施例提的副溶血弧菌蛭弧菌Halobacteriovoraxsp.MCS-1的平板培养照片；

图4为本发明实施例提的副溶血弧菌噬菌体VP-HYP MCS-1的透射电子显微镜照片；

图5为本发明实施例提的副溶血弧菌蛭弧菌Halobacteriovorax sp.MCS-1的透射电子显微镜照片；

图6为本发明实施例提的副溶血弧菌噬菌体VP-HYP MCS-1的氯仿敏感性实验结果图；

图7为本发明实施例提的副溶血弧菌蛭弧菌Halobacteriovorax sp.MCS-1的氯仿敏感性实验结果图；

图8为本发明实施例提的副溶血弧菌噬菌体VP-HYP MCS-1单一噬菌体感染副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus MCS-1的效果曲线图；

图9为本发明实施例提的副溶血弧菌蛭弧菌Halobacteriovorax sp.MCS-1单一蛭弧菌感染副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticusMCS-1的效果曲线图；

图10为本发明实施例提的副溶血弧菌噬菌体VP-HYP MCS-1和副溶血弧菌蛭弧菌Halobacteriovorax sp.MCS-1联合使用感染副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus MCS-1的效果曲线图。

图11为本发明实施例提的副溶血弧菌蛭弧菌Halobacteriovorax sp.MCS-1保存60d后的裂解图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。

本发明针对由副溶血弧菌引起的水产养殖上对虾急性肝胰腺坏死病致死率极高的问题以及抗生素过度使用引起耐药性细菌产生的基础上，从患病对虾养殖场分离致病性弧菌，以该致病性弧菌(副溶血弧菌)为宿主，从青岛近岸海水分离得到一株能够裂解该弧菌的烈性噬菌体和一株蛭弧菌，通过透射电子显微镜观察，确定了该噬菌体和蛭弧菌的分类地位。通过平板点滴法，根据噬菌斑的有无，测定噬菌体和蛭弧菌的宿主谱范围。

通过对单一噬菌体和单一蛭弧菌以及两者混合使用对宿主菌的侵染特性，估计不同梯度感染复数(MOI)下的抑菌能力，结果发现两者联合使用，既能够在短时间内杀灭高浓度的副溶血弧菌，且可以长时间限制副溶血弧菌的生长。

本发明的噬菌体和蛭弧菌制剂利用副溶血弧菌作为宿主直接进行分离，排除了外源宿主菌污染的可能性，高效利用这两种微生物各自的特性，达到清除水产养殖体系中致病性副溶血弧菌的效果；并且可进一步作为安全、有效的防控对虾急性肝胰腺坏死病的噬菌体和蛭弧菌制剂，在防治水产养殖副溶血弧菌感染性疾病方面具有重要应用价值。

下述实施例中不同的MOI值下的杀菌效率按如下公式计算：

实施例1副溶血弧菌噬菌体VP-HYP MCS-1的分离纯化

1)宿主菌获得：

从患有急性肝胰腺坏死病的对虾养殖池采集水样，使用平板涂布于RO固体平板(酵母粉1g，蛋白胨1g，乙酸钠1g，微量元素10mL，琼脂15g，去离子水1000mL，pH 7.8-8.0)，28℃培养24h。随机挑取单菌落，反复划线纯化单菌落5次，将纯化后的单菌落即为MCS-1，将其于-80℃甘油管保存。

为明确菌株MCS-1的分类地位，使用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5‘-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)扩增16S rDNA序列。将PCR扩增成功的序列进行克隆测序，获得16S rDNA全长序列(GenBank登录号MN901166)，并对全长序列进行分析和构建系统进化树，进而确定其进化地位，结果显示菌株MCS-1与另一株副溶血弧菌Vibrioparahaemolyticus FORC072(CP023472)亲缘关系较近(如图1所示)。结合菌株在RO平板上的菌落特征，将菌株MCS-1鉴定为副溶血弧菌MCS-1。

2)副溶血弧菌噬菌体VP-HYP MCS-1的分离纯化

采集青岛近岸海水，经过0.22μm孔径无菌滤器过滤后，加入到经液体RO培养基培养至对数生长期的上述副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus MCS-1菌液中，置于摇床中培养(28℃，150rpm)。分别在第1d、3d、5d、7d取样，样品经过0.22μm孔径无菌滤器过滤后，使用SM Buffer进行梯度稀释，稀释梯度为10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8倍，分别取每个稀释梯度的稀释液1mL与1mL宿主菌混匀，置于摇床中(28℃，150rpm)孵育30min。孵育结束后，加入5mL RO半固体培养基(酵母粉1g，蛋白胨1g，乙酸钠1g，微量元素10mL，琼脂0.5g，去离子水100mL，pH 7.8-8.0)，混匀后分别倒在各个RO固体平板上，摇匀直至半固体凝固。使用封口膜封口，置于28℃恒温培养箱中培养。待各平板上出现噬菌斑，使用无菌平滑枪头挖出各个噬菌斑，分别置于SM Buffer中过夜。过夜后的浸泡液经0.22μm孔径无菌滤器过滤，再使用SM Buffer梯度稀释，稀释梯度为10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8倍，按照上述方法倒双层板，重复纯化5次，直至平板上得到形态大小一致的噬菌斑，认为获得纯化完成的噬菌体(如图2所示)

噬菌体的鉴定：

1)形态学鉴定：将上述纯化完成的噬菌体悬液，使用0.22μm孔径滤头过滤后，加入到对数生长期的副溶血弧菌Vibrioparahaemolyticus MCS-1悬液中，进行逐级扩大培养(5mL，20mL，100mL，1L，同时每次转接菌液加入量为500μL)。将最终扩大培养至1L的扩大培养后的细菌病毒混合液，进行离心(8000×g，4℃，10分钟)收集上清，使用0.22μm孔径滤头过滤去除细菌碎片。收集滤过液，加入终浓度均为2ng·L^-1的DNA酶(Thermo,USA)和RNA酶(Thermo,USA)，混匀，置于室温1小时；加入终浓度为1M的NaCl，混匀，置于4℃冰箱1小时。将处理后的裂解液离心(10000×g，4℃，10分钟)。使用0.22μm孔径滤头过滤去除细胞碎片，收集滤过液。加入终浓度为10wt％的PEG8000，混匀，4℃避光冰箱中保存24小时。将混合液离心(10000×g，4℃，60分钟)收集沉淀，重悬于6mL SM缓冲液中，4℃避光保存。

而后经氯化铯梯度离心纯化噬菌体，具体取3mL病毒重悬液加入到含有9mL氯化铯溶液的离心管中(氯化铯溶液为82mL无菌SM缓冲液中含有67g氯化铯)进行超速离心(200000×g,8h,4℃；CP-100WX,Hitachi Limited,Tokyo,Japan)，离心结束后，使用注射器吸出病毒条带，4℃避光保存。将纯化后的病毒液加入到30KD的超滤管(UFC5030,Millipore)中离心(5000×g，4℃，5分钟)，加入SM Buffer置换剩余的氯化铯溶液，获得纯病毒液，4℃避光保存。利用醋酸双氧铀负染色法，在透射电子显微镜下观察噬菌体的形态，如图4所示。VP-HYP MCS-1显示为直径为80.8nm的正六面体头部，尾部长约为171.2nm，该噬菌体属于有尾噬菌体目，长尾噬菌体科。

2)生理生化特征鉴定：取1mL上述步骤1)中获得扩大培养裂解后的含噬菌体悬液分别与0、20、200μL氯仿混匀，剧烈震荡1min，室温静置放置30min，低速离心(800×g)，确保噬菌体保存于上清液中。取上层水相10μL滴加到含有宿主菌(副溶血弧菌)的双层平板上，置于28℃恒温培养箱中培养。观察是否会出现噬菌斑，检测氯仿是否会影响噬菌体的活性。VP-HYP MCS-1的氯仿敏感性检测结果如图6所示。氯仿处理对噬菌体的裂解活性没有影响，表明噬菌体VP-HYP MCS-1衣壳不含脂类物质。

保藏说明

菌种名称：副溶血弧菌噬菌体VP-HYP MCS-1

菌株编号：VP-HYP MCS-1

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：中国普通微生物菌种保藏管理中心

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所

保藏日期：2020年4月13日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.19693

实施例2副溶血弧菌蛭弧菌Halobacteriovorax sp.MCS-1的分离纯化

采集青岛近岸海水，经过0.22μm孔径无菌滤器过滤后，加入到对数生长期的副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus MCS-1菌液中，置于摇床中培养(28℃，150rpm)。分别在第1d、3d、5d、7d取样，使用RO液体培养基(酵母粉1g，蛋白胨1g，乙酸钠1g，微量元素10mL，去离子水100mL，pH 7.8-8.0)进行梯度稀释，稀释梯度为10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8倍，分别取每个稀释梯度的稀释液1mL与1mL宿主菌混匀，再分别置于摇床中(28℃，150rpm)孵育30min。孵育结束后，加入5mL RO半固体培养基，混匀分别倒在各个RO固体平板上，摇匀直至半固体凝固。使用封口膜封口，置于28℃恒温培养箱中培养。待各平板上出现噬菌斑，使用无菌平滑枪头挖出噬菌斑，分别置于RO液体培养基中过夜。过夜后的浸泡液使用RO液体培养基梯度稀释，稀释梯度为10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8倍，按照上述方法倒双层板，重复纯化5次，直至平板上得到形态大小一致的噬菌斑，认为获得纯化完成的蛭弧菌(如图3所示)。

所得蛭弧菌培养液中加入甘油于-80℃保存，该蛭弧菌可保存60天以上，保存60天后仍具有很强的裂解活性，如图11所示。其中，蛭弧菌培养液中甘油的终浓度为1-2％(v/v)。

蛭弧菌的鉴定：

1)形态学鉴定：按照上述噬菌体中记载的方法，纯化完成的蛭弧菌加入到在液体RO培养基中生长至对数生长期的副溶血弧菌Vibrioparahaemolyticus MCS-1菌液中，进行扩大培养(5mL，20mL；同时每次转接菌液加入量为500μL)。将最终扩大培养至20mL的扩大培养后的蛭弧菌混合液，进行离心(8000×g，4℃，10分钟)收集上清。利用醋酸双氧铀负染色法，在透射电子显微镜下观察蛭弧菌的形态，如图5所示。Halobacteriovorax sp.MCS-1显示为棒状长2.7μm，宽0.4-0.6μm，尾部长约为6.3μm。

2)生理生化特征鉴定：按照上述噬菌体氯仿敏感性检测方法对Halobacteriovorax sp.MCS-1进行氯仿敏感性检测，结果如图7所示。氯仿处理后的蛭弧菌与对照组蛭弧菌有明显差异，对照组蛭弧菌具有裂解活性，氯仿处理后的蛭弧菌失去了裂解活性，表明分离得到的蛭弧菌对氯仿敏感。

保藏说明

菌种名称：副溶血弧菌蛭弧菌Halobacteriovorax sp.MCS-1，

菌株编号：MCS-1

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：中国普通微生物菌种保藏管理中心

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所

保藏日期：2020年4月13日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.19694

实施例3副溶血弧菌噬菌体VP-HYP MCS-1的宿主范围检测

选取实验室现有的13株弧菌进行噬菌体宿主范围的检测，其中，13株弧菌为Vibrio parahaemolyticus(副溶血弧菌)，Vibrio owensii(欧文斯氏弧菌)，Vibrioneocaledonicus(新喀里多尼亚弧菌)，Vibrio plantisponsor(植物益生弧菌)，Vibriohannami，Vibrio hyugaensis，Vibrio azureus(远青弧菌)，Vibrio natriegens(需钠弧菌)，Vibrio alginolyticus(溶藻弧菌)，Vibrio harveyi(哈维氏弧菌)，Vibriovariabilis(变异弧菌)，Vibrio galatheae，Vibrio gangliei。

各取1mL上述对数生长期的不同细菌与5mL RO半固体(约48℃)混合均匀后倒双层板，而后向凝固好的RO半固体平板上分别滴加10μL上述实施例获得纯化后的噬菌体，置于28℃恒温培养箱中培养。观察是否会出现噬菌斑，每组实验重复三次，确定噬菌体是否可以裂解该细菌。噬菌体VP-HYP MCS-1表现为对Vibrio parahaemolyticusMCS-1的专一侵染特性，对其他细菌均没有裂解能力，如表1所示。

实施例4副溶血弧菌蛭弧菌Halobacteriovorax sp.MCS-1的宿主范围检测

按照上述实施例记载宿主范围检测的方法，对蛭弧菌Halobacteriovoraxsp.MCS-1的宿主范围进行检测；其中，宿主细菌为Vibrio parahaemolyticus(副溶血弧菌)，Vibrio owensii(欧文斯氏弧菌)，Vibrio neocaledonicus(新喀里多尼亚弧菌)，Vibrio plantisponsor(植物益生弧菌)，Vibrio hannami，Vibrio hyugaensis，Vibrioazureus(远青弧菌)，Vibrio natriegens(需钠弧菌)，Vibrio alginolyticus(溶藻弧菌)，Vibrio harveyi(哈维氏弧菌)共10株弧菌。

检测结果，如表1所示，蛭弧菌Halobacteriovorax sp.MCS-1的裂解谱较广，其能够裂解包含副溶血弧菌MCS-1在内的10株弧菌(检测菌株共13株)。

表1

注：“+”宿主菌对噬菌体和蛭弧菌敏感；“-”宿主菌对噬菌体和蛭弧菌不敏感

实施例5副溶血弧菌噬菌体VP-HYP MCS-1的杀菌效果测定

纯化完成后的上述噬菌体使用SM Buffer进行梯度稀释(10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8倍)，与对数生长期宿主菌(副溶血弧菌MCS-1，细菌数量大致10⁸个/ml)混合后倒双层板，置于28℃恒温培养箱中培养。待出现噬菌斑后，对平板上的噬菌斑进行计数，换算成每毫升中含有的噬菌体数量，即为噬菌体的效价。确定噬菌体效价后，设置不同的实验组(MOI＝0.1，1，10)与宿主菌进行混合，置于摇床中培养(28℃，150rpm)。对照组为宿主菌单独培养体系。每组实验设置3个平行。前10小时间隔1小时取样测定OD₆₀₀吸光度值，10小时后不定时间间隔取样直到84小时。不同MOI值条件下噬菌体VP-HYP MCS-1的杀菌效果如图8所示。结果显示：在噬菌体VP-HYPMCS-1加入到体系中，MOI值越高，杀菌效果越明显，随着时间的延长，约9小时后细菌增长明显，在84小时后，不同的MOI值下的杀菌效率为MOI＝0.1，25.4％，MOI＝1，20.8％，MOI＝10，16.4％。

实施例6副溶血弧菌蛭弧菌Halobacteriovorax sp.MCS-1的杀菌效果测定

纯化完成后的上述蛭弧菌使用RO液体培养基进行梯度稀释(10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8倍)，与对数生长期宿主菌(副溶血弧菌MCS-1，细菌数量大致10⁸个/ml)混合后倒双层板，置于28℃恒温培养箱中培养。待出现噬菌斑后，对平板上的噬菌斑进行计数，换算成每毫升中含有的蛭弧菌数量，即为蛭弧菌的效价。确定蛭弧菌效价后，设置不同的实验组(MOI＝0.1，1，10)与宿主菌进行混合，置于摇床中培养(28℃，150rpm)。对照组为宿主菌单独培养体系。每组实验设置3个平行。前10小时间隔1小时取样测定OD₆₀₀吸光度值，10小时后不定时间间隔取样直到84小时。不同MOI值条件下蛭弧菌VP-HYP MCS-1的杀菌效果如图9所示。结果显示：由于蛭弧菌复制周期所需时间比噬菌体长，导致加入蛭弧菌后的11小时内，实验组与对照组中副溶血弧菌的生长速率十分接近，在11小时后，蛭弧菌的裂解能力充分显现出来，细菌数量下降明显，在84小时后不同的MOI值下的杀菌效率为MOI＝0.1，76.1％，MOI＝1，71.2％，MOI＝10，69.7％。

实施例7副溶血弧菌噬菌体VP-HYP MCS-1和蛭弧菌Halobacteriovorax sp.MCS-1联用的杀菌效果测定

将纯化完成的上述噬菌体VP-HYP MCS-1和上述蛭弧菌Halobacteriovoraxsp.MCS-1按照效价1：1比例混合，混合液为相同数量噬菌体和蛭弧菌的总和。按照实施例5和实施例6测定的噬菌体和蛭弧菌的效价，按照不同的MOI值(0.1，1，10)与对数生长期宿主菌(副溶血弧菌MCS-1)进行混合，置于摇床中培养(28℃，150rpm)。对照组为宿主菌单独培养体系。每组实验设置3个平行。前10小时间隔1小时取样测定OD₆₀₀吸光度值，10小时后不定时间间隔取样直到84小时。不同MOI值条件下噬菌体和蛭弧菌联用的杀菌效果如图10所示。由图可见，噬菌体VP-HYP MCS-1和蛭弧菌Halobacteriovorax sp.MCS-1共同作用时，相较之于单一蛭弧菌和单一噬菌体而言，单一噬菌体在第7小时后，体系内细菌数量明显上升，两者联用下，体系中的副溶血弧菌的数量在第11小时后出现轻微升高。单一蛭弧菌体系中的细菌数量在最初的11小时与对照组的生长无差异，两者联用下，最初的11小时实验组副溶血弧菌的生长显著低于对照组。通过比较不同的MOI值的效果，在MOI＝1时，发挥的效果较之于其他MOI值的效果更好。两者连用，在MOI＝1时，在84小时后的杀菌率效果分别是单一噬菌体和单一蛭弧菌的4.1倍和1.5倍。两者联用既避免了单一噬菌体发挥作用后突变株产生的问题，也避免了由于蛭弧菌繁殖周期较长，发挥作用时间较长的问题。

由上述可见本发明利用双层琼脂平板法从青岛近岸海水中分离得到一株能够裂解副溶血弧菌的噬菌体以及一株蛭弧菌，所获得的烈性噬菌体VP-HYP MCS-1，其宿主专一性强，对副溶血弧菌具有裂解和杀灭作用；分离获得蛭弧菌Halobacteriovorax sp.MCS-1，其宿主谱较广，对包含副溶血弧菌在内的多种弧菌具有裂解和杀灭作用；将两者混合使用时，可以在很短的时间内杀灭副溶血弧菌，而且可以有效防止突变株的产生，进而达到理想的致病菌清除效果。因此，本发明提供的副溶血弧菌噬菌体VP-HYP MCS-1和蛭弧菌Halobacteriovorax sp.MCS-1在防控对虾致病性副溶血弧菌感染中具有很好的应用前景。

Claims (10)

1.一种副溶血弧菌噬菌体，其特征在于：副溶血弧菌噬菌体为副溶血弧菌噬菌体VP-HYP MCS-1，已于2020年4月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19693。

2.按权利要求1所述的副溶血弧菌噬菌体的应用，其特征在于：所述噬菌体在预防或治疗由副溶血弧菌引起的弧菌病感染中的应用。

3.一种用于预防或治疗由副溶血弧菌引起的弧菌病感染的组合物，其特征在于：以权利要求1所述的副溶血弧菌噬菌体VP-HYP MCS-1、噬菌体分离物或噬菌体培养物作为活性成分。

4.一种副溶血蛭弧菌，其特征在于：副溶血蛭弧菌为副溶血蛭弧菌Halobacteriovoraxsp.MCS-1已于2020年4月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19694。

5.按权利要求4所述的副溶血蛭弧菌的应用，其特征在于：所述副溶血蛭弧菌在预防或治疗由副溶血弧菌引起的弧菌病感染中的应用。

6.一种用于预防或治疗由副溶血弧菌引起的弧菌病感染的组合物，其特征在于：以权利要求4所述的副溶血蛭弧菌Halobacteriovorax sp.MCS-1、细菌分离物或细菌培养物作为活性成分。

7.一种用于预防或治疗由副溶血弧菌引起的弧菌病感染的组合物，其特征在于：以副溶血弧菌噬菌体和副溶血蛭弧菌的混合的菌液、分离物、培养物或重悬液作为活性成分。

8.按权利要求7所述的用于预防或治疗由副溶血弧菌引起的弧菌病感染的组合物，其特征在于：以权利要求1噬菌体和权利要求6所述蛭弧菌混合的菌液、分离物、培养物或重悬液作为活性成分；其中，噬菌体和蛭弧菌效价1：1比例混合，噬菌体和蛭弧菌的生物个体数量相同。

9.按权利要求3、6或7所述组合物，其特征在于：所述活性成分与赋形剂复配混合的组合物制备相应的组合物制剂。

10.按权利要求3、6或7所述组合物的应用，其特征在于：所述组合物在预防或治疗由副溶血弧菌引起的弧菌病感染中的应用；或，

所述组合物在制备作为用于水产养殖的清洁剂或消毒剂中的应用。

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