CN112852750B - 一株海洋来源的弧菌噬菌体、微生态制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

一株海洋来源的弧菌噬菌体、微生态制剂及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株海洋来源的弧菌噬菌体、微生态制剂及其制备方法与应用，该海洋来源的弧菌噬菌体保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2020年8月6日，保藏编号为CCTCC NO：M2020397。该弧菌噬菌体具备感染并高效裂解致病弧菌的潜力，其裂解溶藻弧菌效率可达80％～90％，可利用该噬菌体制备生物微生态制剂应用于防控养殖水体致病弧菌等相关领域。

Description

一株海洋来源的弧菌噬菌体、微生态制剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一株弧菌噬菌体、微生态制剂及其制备方法与应用，尤其涉及一株海洋来源的弧菌噬菌体、微生态制剂及其制备方法与应用。
背景技术
溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是一种革兰氏阴性短杆菌，其隶属于弧菌科(Vibrionaceae)，弧菌属(Vibrio)。溶藻弧菌广泛分布于海洋和河口水体环境中，是鱼虾贝类的条件致病菌，对我国海水养殖产业造成一定的影响；同时也是人类食物中毒，造成胃肠道感染的重要病原菌之一，危害人类健康。有效控制养殖环境中溶藻弧菌对我国海水养殖产业和国民健康具有重要的意义。
目前，国内有关溶藻弧菌疫苗的研究比较少，以及针对溶藻弧菌的灭活疫苗或亚单位疫苗很难同时兼顾高等哺乳动物和海洋生物，这也是制约疫苗应用的重要因素之一；抗生素是防控细菌感染的有效方法，然而此方法也不是防控溶藻弧菌的最优解决方案，有以下几种原因：1)抗生素对有机体的副作用及药物残留，2)滥用导致耐药性的产生，3)对环境的不利影响，4)针对溶藻弧菌抗生素的有效性欠佳等。近年来，国内外科研工作者也利用生物制剂来防控害菌类，特别是噬菌体(Bacteriophage)相关制剂。
噬菌体是以细菌为宿主的一类病毒，部分噬菌体(如烈性噬菌体)能够高效裂解杀灭宿主菌；该类噬菌体首先吸附到细菌表面，遗传物质进入细菌，利用宿主完成自身复制，装配病毒粒子，裂解细菌并释放到细菌外完成整个生命周期。噬菌体具有高度的宿主特异性，仅能感染某一种或某一类细菌，不能够感染(无)脊椎动物，因此噬菌体相关制剂具有高安全性。筛选高效裂解弧菌的噬菌体也成为防控致病弧菌的重要手段之一。国内也有弧菌噬菌体相关专利，例如：专利授权公告号CN106995803B名称为“一株用于防治对虾副溶血弧菌病的噬菌体及其扩培方法”；专利申请号CN201910596696.1名称为“副溶血性弧菌噬菌体vB_VpaP_MGD2、其用途和新型生物杀菌制剂”等等。然而弧菌噬菌体具有高度的宿主特异性，以上专利涉及的噬菌体仅能裂解特异的病原弧菌。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的为提供一种高效裂解溶藻弧菌的海洋来源的弧菌噬菌体，本发明的第二目的为提供一种利用海洋来源的弧菌噬菌体制得的微生态制剂，本发明的第三目的为提供一种微生态制剂的制备方法，本发明的第四目的为提供一种弧菌噬菌体或微生态制剂在制备抑制溶藻弧菌的抑菌剂中的应用。
技术方案：本发明的一株海洋来源的弧菌噬菌体，弧菌噬菌体保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2020年8月6日，保藏编号为CCTCC NO：M2020397。
该弧菌噬菌体保藏地址为中国武汉，武汉大学。该弧菌噬菌体的拉丁文名称为Vibrio alginolyticus bacteriophage。
本发明的利用海洋来源的弧菌噬菌体制得的微生态制剂。
本发明的微生态制剂的制备方法，包括如下步骤：在2-3％NaCl液体培养基中培养宿主菌；按1：500-1:1000接种噬菌体到液体培养基中，继续发酵培养；固液分离即可获得微生态制剂。
进一步地，培养宿主菌过程中转速为150-200rpm。
优选的，宿主菌在液体培养基中的培养时间为12-24h。
优选的，接种噬菌体后继续发酵培养12-48h。
本发明的弧菌噬菌体或微生态制剂在制备抑制溶藻弧菌的抑菌剂中的应用。
进一步地，溶藻弧菌为养殖水体中的溶藻弧菌。抑菌剂裂解溶藻弧菌的裂解效率可达80％-90％。
分离纯化一株以海洋弧菌为宿主的噬菌体及其在裂解溶藻弧菌方面的应用，本发明涉及的噬菌体能够在弧菌体内快速增值并高效裂解溶藻弧菌，该噬菌体可作为生物材料开发微生态制剂，可应用于防控养殖环境中溶藻弧菌等条件致病弧菌。
本发明还包括一种裂解海洋弧菌噬菌体的分离方法，包括如下步骤：浓缩海水中的噬菌体条件：300-500mL海水水样经4-16℃离心(5000-10000rpm)5-10min，上清过0.22-0.45μm滤膜；滤过液高速离心(30000rpm)2.5-3h；500μL无菌海水重悬。
还包括混合噬菌体的初步扩增：50-100μL重悬液加入到1％稀释的弧菌E-110菌液中(1mL LB+2％NaCl液体培养基)；25-30℃培养10-20h；5000-10000rpm离心5-10min收集裂解液，过0.22-0.45μm滤膜，获得混合噬菌体原液。
本发明的裂解海洋弧菌噬菌体的纯化方法，包括用无菌SM缓冲液对混合噬菌体原液按比例稀释，稀释液与对数生长期的弧菌E-110培养液1:1混匀(V/V)，加入琼脂浓度0.6-0.8％的LB(+2％NaCl)半固体培养基，混匀，倒入底层琼脂浓度0.9-1％琼脂平板，制成双层平板，25-30℃培养。挑取噬菌斑，用无菌SM缓冲液对该噬菌体按比例稀释，重复以上双层平板制备步骤3-4次；获得单一的高纯度噬菌体病毒株，其中包括一株噬菌体HH-109。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：从海水环境中分离到一株海洋来源的噬菌体，且能够高效裂解溶藻弧菌这一致病菌；同时该噬菌体能够在溶藻弧菌E-110中高效增殖，培养基易获取，扩增周期短(小于24h)，可节约经济成本和时间成本，对于制备相关的噬菌体制剂具有重要的意义；噬菌体HH-109制备的微生态制剂可应用于防控养殖水体中的致病弧菌，具有如下的特点：分离的海洋弧菌噬菌体HH-109对宿主菌具有靶向特异性，具有生物安全性；能够持续发挥作用，具有长效性；能够作为疫苗或抗生素防控弧菌的补充，防止抗生素的滥用。
附图说明
图1(a)-(b)为海洋弧菌噬菌体株HH-109透射电镜图，图1(a)为海洋弧菌噬菌体株HH-109透射电镜图，标尺为200nm；图1(b)为海洋弧菌噬菌体株HH-109透射电镜放大图；
图2为噬菌体株HH-109裂解溶藻弧菌的效率，其中，纵坐标显示OD600检测的吸光值，横坐标为噬菌体感染时间点，噬菌体各稀释浓度，阳性对照和阴性对照在图例中已标注；
图3为噬菌体制剂(1：500接种制备所得)裂解溶藻弧菌效果，其中噬菌体制剂按1:1,1:10,1:100,1:1000,1:10000稀释滴加在弧菌平板上，噬菌圈如图；
图4为噬菌体制剂(1：1000接种制备所得)裂解溶藻弧菌效果，其中噬菌体制剂按1:1,1:10,1:100,1:1000,1:10000稀释滴加在弧菌平板上，噬菌圈如图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1裂解海洋弧菌噬菌体分离与纯化
1.噬藻弧菌E-110复苏培养：
噬藻弧菌株E-110分离自凡纳滨对虾；弧菌E-110划线于TCBS(ThiosulfateCitrate Bile Salts Sucrose，BD)平板上，30℃条件下培养12h；挑取单克隆于1mL LB(Luria Bertani)+2％NaCl液体培养基中，30℃条件下隔夜振荡(200rpm)培养12h；1：100转接过夜培养菌液至100mL新鲜液体培养基中，振荡培养至OD600在0.4左右。
2.海洋噬菌体初步分离：
500mL海水水样经4℃高速离心(10000rpm)10min，上清过0.45μm滤膜；滤过液高速离心(30000rpm)3h；300μL无菌海水重悬。100μL重悬液加入到1％稀释的弧菌E-110菌液中(1mL LB+2％NaCl液体培养基)；30℃培养12h；10000rpm离心10min收集裂解液，过0.45μm滤膜，获得混合噬菌体原液。
3.噬菌体纯化：
双层平板法纯化噬菌体，详情如下：用无菌SM缓冲液对噬菌体原液按比例稀释，稀释液与对数生长期的弧菌E-110培养液1:1混匀(V/V)，加入琼脂浓度0.6％的LB(+2％NaCl)半固体培养基，混匀，倒入地层琼脂浓度1％琼脂平板，制成双层平板，30℃培养。挑取平板上的噬菌空斑，用无菌SM缓冲液对该噬菌体液按比例稀释，重复以上双层平板制备步骤4次；获得单一的高纯度噬菌体病毒株，其中包括一株噬菌体HH-109。
实施例2裂解海洋弧菌噬菌体扩增及电镜检测观察
1.单一噬菌体病毒HH-109株扩增：
噬菌空斑来源的单一噬菌体病毒株，按1：10(V/V)接种于对数生长期的溶藻弧菌E-110培养液，30℃振荡培养，10000rpm离心10min收集裂解液，过0.45μm滤膜，获得单一噬菌体HH-109病毒株原液。
2.透射电镜法检测噬菌体HH-109：
200mL单一噬菌体病毒株HH-109原液经4℃高速离心(10000rpm)10min，上清过0.22μm滤膜；滤过液高速离心(30000rpm)2.5h；重悬浓缩噬菌体。10μL浓缩噬菌体滴加至200目铜网，滤纸侧边缘吸去多余液体；用1％的磷钨酸溶液染色5min，滤纸侧边缘吸去多余液体，待干燥；利用80.0kv Hitachi TEM仪器观察噬检测噬菌体，观察病毒粒子形态，具体结果如图1(a)-(b)所示。结果表明噬菌体形态呈细杆形，由头尾两部分构成，长尾；未见其它形态的噬菌体。
实施例3噬菌体HH-109裂解溶藻弧菌效果评价
对数生长期的溶藻弧菌E-110培养菌液接种到孔板中(150μL/每孔)；按不同比例(噬菌体HH-109体积：菌液体积)分别加入不同体积的噬菌体，如表1所示；弧菌生长阳性对照不加噬菌体HH-109；每孔加入LB+2％使每孔总体积为300μL；其中阴性对照为300μL LB+2％NaCl液体培养基；详细实验组信息见表1。
表1噬菌体裂解弧菌效果检测各实验组设计
总体积300μL 1：1 1：2 1：5 1：10 1：20 1：50 1：100 阴性 阳性
E-110菌液(μL) 150 150 150 150 150 150 150 0 150
HH-109(μL) 150 75 30 15 7.5 3 1.5 0 0
LB+2％NaCl(μL) 0 75 120 135 142.5 147 148.5 300 150
将孔板在30℃下继续振荡(200rpm)培养，在0min至280min不同时间点(每间隔20min)利用全自动生长检测仪对细菌进行定量检测，设置检测波长为600nm，结果如图2所示。结果表明阳性对照组中弧菌数量随着培养时间的增加而逐渐增加，而加入噬菌体后弧菌数量随着共培养时间的增加而逐渐减少，其中噬菌体浓度越高，弧菌数量下降越快。在60至100min，各实验组的弧菌数量不同程度的下降；100至220min内，各实验组的弧菌数量逐渐趋于最小值，并在后续时间内保持稳定，说明噬菌体HH-109能够高效裂解弧菌E-110，裂解效率为80％～90％。
实施例4噬菌体HH-109微生态制剂制备
初步培养获得噬菌体HH-109病毒株原液作为F1代(1L)；同时按1：100(V/V)接种于对数生长期的弧菌E-110培养液(1L)，30℃振荡培养，10000rpm离心10min收集裂解液即获得病毒株作为F2代，经过数次培养放大，获得大量的噬菌体。F10代以内的噬菌体HH-109裂解液可作为保种病毒株(F1-F10代)，长期保藏于-80℃冰箱。F11代之后的病毒裂解液优化发酵条件在发酵瓶中进行培养增值，条件如下：宿主菌在LB+2％NaCl液体培养基中发酵培养12h，转速150rpm，1:500接种噬菌体，继续培养24h；固液分离即可获得HH-109噬菌体微生态制剂；所获噬菌体制剂按1:1,1:10,1:100,1:1000,1:10000稀释滴加在溶藻弧菌平板上，30℃过夜培养。如图3所示，梯度稀释的噬菌体制剂形成噬菌圈，说明该噬菌体制剂的有效性。
实施例5
本实施例中将噬菌体HH-109病毒株原液按1:1000(V/V)接种于对数生长期的弧菌E-110培养液，：宿主菌在LB+3％NaCl液体培养基中发酵培养，其他原料、配比、制备方法和检测方法与实施例4相同；如图4所示，所得噬菌体制剂梯度稀释滴加在溶藻弧菌平板上，过夜培养形成噬菌圈，说明该噬菌体制剂的有效性。

Claims (7)

1.一株海洋来源的弧菌噬菌体，其特征在于：所述弧菌噬菌体保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2020年8月6日，保藏编号为CCTCC NO：M2020397。
2.一种利用权利要求1所述海洋来源的弧菌噬菌体制得的微生态制剂。
3.一种权利要求2所述微生态制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：在2～3％NaCl液体培养基中培养宿主菌；按1：500～1:1000接种噬菌体到液体培养基中，继续发酵培养；固液分离即可获得微生态制剂。
4.根据权利要求3所述微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述培养宿主菌过程中转速为150～200rpm。
5.一种权利要求1所述弧菌噬菌体或权利要求2所述微生态制剂在制备抑制溶藻弧菌的抑菌剂中的应用。
6.根据权利要求5所述弧菌噬菌体或微生态制剂在制备抑制溶藻弧菌的抑菌剂中的应用，其特征在于：所述溶藻弧菌为养殖水体中的溶藻弧菌。
7.根据权利要求5所述弧菌噬菌体或微生态制剂在制备抑制溶藻弧菌的抑菌剂中的应用，其特征在于：所述抑菌剂裂解溶藻弧菌的裂解效率可达80％～90％。
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