CN113201506B - 一株高效裂解碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌噬菌体及其应用 - Google Patents

一株高效裂解碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌噬菌体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一株高效裂解碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌噬菌体及其应用。本申请从西南医科大学附属医院污水处理厂的污水中分离出一株可裂解多重耐药肺炎克雷伯菌17‑11的烈性噬菌体，属于有尾噬菌体目(Caudovirales)、肌尾噬菌体科(Myoviridae)。该噬菌体的最佳感染复数为0.001，且具有较高的复制效率，指数生长期的爆发量约为31.7PFU/CELL。该噬菌体具有较宽的温度耐受范围，pH稳定性较好，且对肺炎克雷伯菌的特异性强。体外抗菌实验表明该噬菌体对宿主肺炎克雷伯菌17‑11有显著的抑制作用。

Description

一株高效裂解碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌噬菌体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一株高效裂解碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌噬菌体及其应用。
背景技术
随着产超广谱β-内酰胺酶(Extended spectrum betalactamases，ESBLs)和碳青霉烯酶(carbapenemases)的肺炎克雷伯菌的出现，多重耐药的肺炎克雷伯菌为公共卫生安全带来了极大威胁。现有的抗生素已无法满足临床需要。为此，如何高效的抑制多重耐药肺炎克雷伯菌，成为了一项亟待解决的问题。
而作为细菌“天然杀手”的噬菌体由于其数量繁多、抗菌活性高的特点，近年来被越来越多地用于治疗多重耐药菌的感染。噬菌体(bacteriophage)作为自然界中存在数量最多的物种，是一株可感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒。其作为“抗菌素”用于治疗细菌感染已有将近一个世纪的历史，格鲁吉亚和俄罗斯等国均具有丰富的噬菌体治疗经验。美国和欧洲也有进入临床试验的规模化噬菌体制剂。相比人工合成的抗生素，噬菌体所具有的天然优势使其更加适合于临床治疗。首先噬菌体具有极高的宿主特异性，几乎只对宿主细菌产生作用，不影响人体的细胞和正常菌群。其次，噬菌体对宿主菌具有极高的灭菌活性，并且噬菌体作为活的病毒可以依靠宿主进行繁殖，达到“边杀菌边繁殖”的放大效应，无需大量、多次给药可减轻患者痛苦。最后噬菌体数量繁多且易于分离，研发噬菌体制剂的时间成本和经济成本较低，更具有经济价值。
由于噬菌体对宿主菌具有高度的特异性，所以单一噬菌体的裂解范围较抗生素小。本申请旨在通过分离对多重耐药肺炎克雷伯菌特异性强、裂解效率高的噬菌体，并通过研究其生物学特性和全基因组进一步筛选适合用于临床的噬菌体以达到对细菌的抑制作用。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一株高效裂解碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌噬菌体及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明是这样实现的，一株高效裂解碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌噬菌体，保藏编号为CCTCC NO:M 2021408，培养物名称为T4-like viruses sp.vB_kpnM_17-11，于2021年4月19日保藏至中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学。
本发明还披露了如上述的噬菌体在裂解肺炎克雷伯菌中的应用。
本发明还披露了如上述的噬菌体在制备裂解肺炎克雷伯菌的药物中的应用。
进一步地，所述肺炎克雷伯菌包括多重耐药肺炎克雷伯菌。
进一步地，所述多重耐药肺炎克雷伯菌包括多重耐药肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniae17-11。
进一步地，所述应用的具体方法为将所述噬菌体与肺炎克雷伯菌混合后共培养。
进一步地，所述肺炎克雷伯菌包括碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌。
本发明还披露了如上述的噬菌体在处理含肺炎克雷伯菌的污水中的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本申请从西南医科大学附属医院污水处理厂的污水中分离出一株可裂解多重耐药肺炎克雷伯菌17-11的烈性噬菌体，根据最新病毒分类标准，该噬菌体属于有尾噬菌体目(Caudovirales)、肌尾噬菌体科(Myoviridae)。该噬菌体的最佳感染复数为0.001，且具有较高的复制效率，指数生长期的爆发量约为31.7PFU/CELL。该噬菌体具有较宽的温度耐受范围，pH稳定性较好，且对肺炎克雷伯菌的特异性强、裂解效率高。体外抗菌实验表明，噬菌体vB_kpnM_17-11在MOI为0.001时能有效抑制宿主菌17-11的生长。“Phage and 17-11”组在孵育4h后的OD595值显著低于“17-11”组，说明在体外噬菌体对宿主17-11有显著的抑制作用。
附图说明
图1是噬菌体vB_kpnM_17-11的噬菌斑图片；
图2是噬菌体vB_kpnM_17-11透射电镜图；
图3是噬箘体vB_kpnM_17-11的一步生长曲线；
图4是vB_kpnM_17-11的体外抗菌活性；
图5是MOI为0.001时，用vB_kpnM_17-11裂解对数期的17-11菌液的效果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。
本发明披露了一株高效裂解碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌噬菌体及其应用，具体如下实施例所示。
实施例1噬菌体的分离与鉴定
1、噬菌体的分离与筛选
在灭菌后的锥形瓶中采集西南医科大学附属医院未处理污水400ml，3000rpm/min离心10min。留上清。在上清中加入1ml对数期的宿主菌菌液和40ml的LB肉汤培养基，过夜培养。取过夜培养的上清液，5000rpm/min离心10min，留上清，此为噬菌体原液。将噬菌体原液按十倍比例倍比稀释，铺双层平板测定噬菌体滴度。挑取单个噬菌斑纯化多次，直至得到形态相同的单一噬菌体，且噬菌体的滴度大于1010PFU/ml。制备好的噬菌体液与100％甘油按1:1比例混合，于-80℃保存。
2、噬菌体的形态
使用透射电镜观察噬菌体形态：将噬菌体浓缩液经2％戊二醛固定后，用磷钨酸负染，在透射电子显微镜下观察其形态结构。
本申请从西南医科大学附属医院污水处理厂的污水中分离出一株可裂解多重耐药肺炎克雷伯菌17-11的烈性噬菌体。在双层琼脂平板上可见边缘清晰，直径约3mm的透明噬菌斑(图1)。透射电镜结果显示，该噬菌体长约250nm，头部为规则的正二十面体，头部长约120nm、宽约90nm(图2)。该噬菌体有一个可伸缩的尾。
根据噬菌体形态以及全基因组测序分析，该噬菌体属于有尾噬菌体目(Caudovirales)、肌尾噬菌体科(Myoviridae)。根据噬菌体命名规则，将其命名为vB_kpnM_17-11。
对vB_kpnM_17-11基因组进行分析，未检测到耐药基因和假定毒力因子，提示vB_kpnM_17-11在应用于临床治疗时不会将外界的耐药基因和毒力因子携带至患者体内。
实施例2噬菌体性能检测
1、噬菌体最佳MOI的确定
将噬菌体与17-11按照100、10、1、0.1、0.01、0、001、0.0001、0.00001、0.000001的比例等体积混合，室温静置4h后倍比稀释，铺双层平板测定噬菌体滴度，设置三个平行组，滴度最高的组别为最佳MOI。
将噬菌体vB_kpnM_17-11与宿主菌17-11按照不同比例均匀混合，静置4h后，铺双层琼脂平板检测噬菌体滴度，发现当MOI为0.001时，vB_kpnM_17-11产生子代的量最多。根据实验结果分析，0.001为噬菌体vB_kpnM_17-11的最佳感染复数，数据见表1。
表1噬菌体vB_kpnM_17-11在不同MOI下的滴度
Figure BDA0003104528370000041
2、一步生长曲线
将噬菌体与17-11按最佳MOI混合，在0min-120min以10min间隔分别取定量混合液，高速离心、滤菌，将滤液保存于4℃冰箱中，待取样结束，对所有样本进行倍比稀释，铺双层平板测定噬菌体滴度，设置三个平行组。绘制一步生长曲线图。
一步生长曲线显示，vB_kpnM_17-11的潜伏期和指数期分别为30min和60min。当噬菌体与细菌混合90min后噬菌体进入平台期(图3)。vB_kpnM_17-11具有较高的复制效率，可产生更多的子代噬菌体以裂解宿主菌。指数生长期的爆发量约为31.7PFU/CELL。
3、温度稳定性
将108PFU/ml的噬菌体分别置于4、25、37、40℃、50℃、60℃、70℃水浴1h，以10min间隔分别于0min-60min取样，后测定噬菌体滴度。发现该噬菌体在温度为4℃、25℃、37℃和40℃时滴度保持稳定(存活率>90％)，当温度为50℃时，vB_kpnM_17-11活性降低，1h后噬菌体滴度为初始滴度的20％。当温度为60℃和70℃时，10min后已无法通过双层平板法检测出具有活性的噬菌体。
4、PH稳定性
将108PFU/ml的噬菌体分别置于预先配置的PH为1-14的LB肉汤培养基中1h，于60min时取样，后测定噬菌体滴度，结果表明在pH为4-10时，vB_kpnM_17-11活性相对稳定。
5、体外抗菌活性
体外抗菌实验表明，噬菌体vB_kpnM_17-11在MOI为0.001时能有效抑制宿主菌17-11的生长(图4)。“Phage and 17-11”组在孵育4h后的OD595值显著低于“17-11”组(图5)。说明在体外噬菌体vB_kpnM_17-11对宿主17-11有显著的抑制作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一株噬菌体(Bacteriophage)，保藏编号为CCTCC NO:M2021408。
2.如权利要求1中所述的噬菌体在制备裂解肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)的药物中的应用。
3.如权利要求1中所述的噬菌体在处理含肺炎克雷伯菌的污水中的应用。
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