CN115161292B - 一种多重耐药序列11型肺炎克雷伯氏菌噬菌体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种多重耐药序列11型肺炎克雷伯氏菌噬菌体及其应用。具体而言，本发明提供了一种噬菌体，其保藏编号为CGMCC No.45097。本发明还提供了所述的噬菌体在制备特异高效地裂解多重耐药序列11型肺炎克雷伯氏菌的试剂中的应用。本发明噬菌体可在短时间内大量增殖，裂解性强，并对温度和酸碱度具有良好的耐受性，可用于治疗由多重耐药序列11型肺炎克雷伯氏菌引起的感染。

Description

一种多重耐药序列11型肺炎克雷伯氏菌噬菌体及其应用

技术领域

本发明是关于一种克雷伯氏菌噬菌体(Klebsiella phage)及其应用，具体地说，是关于一种多重耐药序列11型肺炎克雷伯氏菌噬菌体及其应用，以及该噬菌体在制备用于治疗由多重耐药序列11型肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae,Kpn)引起的急性肺炎的药物中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

肺炎克雷伯氏菌是一种革兰氏阴性细菌，属于肠杆菌科，广泛分布于水、土壤、粪便、医院、社区、动物和人类等各种环境中。肺炎克雷伯氏菌可引起肺炎、脑膜炎、眼内炎、化脓性肝脓肿、败血症和尿路感染等一系列临床症状，是医院和社区获得性肺炎最常见的病原体，也是世界范围内最常见的医源性病原体之一。

肺炎克雷伯氏菌的抗生素耐药性一直是世界范围内的一个严重问题，多重耐药或极度耐药的肺炎克雷伯氏菌屡被报道。产生超广谱β-内酰胺和耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯氏菌已被世界卫生组织确定为严重的公共卫生威胁，并归类为超级细菌。研究表明，序列11型是肺炎相关的肺炎克雷伯氏菌分离株的优势型别，且多为多重耐药菌。

作为一种对抗多重耐药细菌的新方法，噬菌体疗法已显示出积极的临床效果，越来越多的证据显示其可作为抗生素的协同或替代策略。噬菌体是一种高度特异性的病毒，可以精确地杀死细菌，在体内清除宿主细菌后即可自动代谢出体外。

因此，如果找出可以特异性裂解能导致急性肺炎的多重耐药序列11型肺炎克雷伯氏菌流行株的噬菌体，将为临床治疗肺炎提供新视角和新思路。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种多重耐药序列11型肺炎克雷伯氏菌噬菌体(Klebsiella phage)。

本发明的另一目的在于提供所述噬菌体的相关应用。

本案发明人自医院污水中分离出一株烈性的、可裂解多重耐药序列11型肺炎克雷伯氏菌噬菌体(Klebsiella phage)，命名为pKp11。本发明的噬菌体pKp11已于2022年4月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名为克雷伯氏菌噬菌体(Klebsiella phage)，保藏编号为CGMCC No.45097。本发明中亦称该菌为噬菌体pKp11。

具体而言，一方面，本发明提供了一种噬菌体，其保藏编号为CGMCC No.45097。

另一方面，本发明提供了一种噬菌体制剂，其包括：保藏编号为CGMCC No.45097的噬菌体，以及辅料。

根据本发明的具体实施方案，本发明的噬菌体制剂中，所述辅料包括用于维持菌体活性的营养组分。在一些具体实施方案中，所述辅料可以为LB培养基。在一些更具体实施方案中，所述的LB培养基中，胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠10g/L。

根据本发明的一些具体实施方案，本发明的噬菌体制剂为药物。

根据本发明的一些具体实施方案，本发明的噬菌体制剂为清洁剂或消毒剂。

另一方面，本发明提供了保藏编号为CGMCC No.45097的噬菌体用于体外裂解多重耐药序列11型肺炎克雷伯氏菌的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明对噬菌体pKp11的宿主谱进行了测定，测定结果表明，噬菌体pKp11可裂解12株多重耐药序列11型Kpn菌株。

另一方面，本发明提供了保藏编号为CGMCC No.45097的噬菌体在制备用于裂解多重耐药序列11型肺炎克雷伯氏菌的制剂中的应用。

另一方面，本发明提供了保藏编号为CGMCC No.45097的噬菌体在制备用于防治由多重耐药序列11型肺炎克雷伯氏菌引起的肺炎的药物中的应用。

根据本发明的具体实施方案，本发明的噬菌体的应用中，所述多重耐药序列11型肺炎克雷伯氏菌包括Genebank号为JAJOTR000000000的菌株C10。

本发明的噬菌体pKp11属短尾噬菌体，对温度和酸碱度有良好的耐受性，其效价在温度4-50℃和pH 6-10的条件下仍可保持稳定。噬菌体与细菌的最佳感染复数为0.01。并且，本发明的噬菌体pKp11的潜伏期在0-10分钟，爆发期在10-110分钟，随后进入平台期。本发明的噬菌体可以裂解导致肺炎的多重耐药序列11型Kpn菌株，特别是对于Kpn菌株C10(Genebank号为JAJOTR000000000，为现有技术中的一株Kpn菌株)。本发明的噬菌体pKp11在感染复数为10到10^-6的范围内均可有效抑制多重耐药序列11型Kpn的生长，可为开发多重耐药序列11型Kpn所致肺炎的抗生素替代或者补充疗法奠定基础。此外，为验证pKp11的特异性，我们还检测了其它6株噬菌体对菌株C10的裂解能力，结果显示仅pKp11可裂解菌株C10。

综上所述，本发明提供了一种噬菌体pKp11，其可以特异性裂解多重耐药序列11型肺炎克雷伯氏菌，且可在短时间内大量增殖，具有裂解活性强、宿主谱广泛、温度和酸碱度耐受良好的特点，对多重耐药肺炎克雷伯氏菌具有很好的抑制效果，具有良好的应用前景。

附图说明

图1所示为噬菌体pKp11的透射电镜图。

图2所示为噬菌体pKp11的温度耐受性测试图。

图3所示为噬菌体pKp11的酸碱度耐受性测试图。

图4所示为噬菌体pKp11的一步生长曲线图。

图5所示为噬菌体pKp11的对宿主菌C10的裂解曲线图。

图6所示为7株噬菌体对宿主菌C10的裂解能力测试图。

用于专利程序的生物材料保存：

本发明的噬菌体pKp11(因其对多重耐药序列11型Kpn菌株具有裂解能力，提交保藏时以pKp11的自命名登记)：

保藏日期：2022年4月26日；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所

保藏编号：CGMCC No.45097；

分类命名：克雷伯氏菌噬菌体(Klebsiella phage)。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂，均可通过商购获得。

实施例1、噬菌体pKp11的分离纯化与保藏

噬菌体分离液的制备：2021年6月，从北京首都儿科研究所附属儿童医院下水道采集50mL污水，用于噬菌体分离。以转速4000rpm将污水离心20分钟，使用0.22μm微孔滤器过滤离心后的上清液后，得到噬菌体分离液。

噬菌体的分离：在5mL LB培养基中加入50μL宿主菌C10悬液和200μL噬菌体分离液，于37℃摇床中以转速220rpm振荡培养。培养4小时后，将培养液以转速10000rpm离心2分钟，使用0.22μm微孔滤器过滤离心后的上清液。取100μL上清液，采用双层琼脂平板法进行噬菌斑筛选。

噬菌体的纯化：待双层琼脂平板在37℃孵箱中静置培养12-24小时后，用接种环挑取单个噬菌斑至LB培养基中，同时加入50μL宿主菌C10悬液，于37℃摇床中以转速220rpm振荡培养。培养4小时后，将培养液以转速10000rpm离心2分钟，使用0.22μm微孔滤器过滤离心后的上清液。取100μL上清液，采用双层琼脂平板法进行噬菌斑筛选。重复上述操作4-5次，直至出现形态均匀、一致的噬菌斑，即获得纯化的噬菌体。

本发明中，采用上述方法，获得一株噬菌体，本发明中命名为pKp11。

噬菌体pKp11的电镜下形态观察：在纯化后的噬菌体pKp11培养液中加入1％的氯仿、DNase和RNase。离心上述溶液后收集上清，并加入10％的PEG8000，再次离心后以SM缓冲液重悬沉淀。在上述溶液中加入1％的氯仿，离心后取上层水相，获得噬菌体悬液。将噬菌体悬液稀释至适当浓度后，沉降于铜网表面，并用2％(wt./vol)的醋酸铀(pH为7.0)对噬菌体进行负染色。在80KV下用透射电镜观察，找到单个噬菌体完整形态的视野后拍照记录。如图1所示，噬菌体pKp11为短尾噬菌体，直径约为60nm。

经检测，本发明的噬菌体pKp11对温度和酸碱度有良好的耐受性，可在温度4-50℃和pH 6-10的条件下保持稳定效价，噬菌体与细菌的最佳感染复数(multiplicity ofinfection,MOI)为0.01。噬菌体pKp11的潜伏期在0-10分钟，爆发期在10-110分钟，随后进入稳定期。

噬菌体pKp11可以裂解的多重耐药Kpn菌株C10(Genebank号为JAJOTR000000000)ST分型为序列11型，已被证明是肺炎相关的肺炎克雷伯氏菌分离株的优势序列型。本发明的噬菌体pKp11已于2022年4月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏日期：2022年4月26日，分类命名为：克雷伯氏菌噬菌体，保藏编号为CGMCC No.45097。本发明中亦称该菌为噬菌体pKp11。

实施例2、噬菌体pKp11的温度耐受性测试

分别取1mL噬菌体悬液(参照实施例1中所制备)pKp11于4℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃条件下孵育1小时，使用双层琼脂平板法测定噬菌体活性。

测试结果如图2所示，噬菌体pKp11对温度耐受性良好，在温度4-50℃的条件下均可保持稳定效价。

实施例3、噬菌体pKp11的酸碱度耐受性测试

将噬菌体pKp11分别接种于酸碱度pH值为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14的SM缓冲液中，37℃条件下孵育1小时，并使用双层琼脂平板法测定噬菌体活性。

测试结果如图3所示，噬菌体pKp11对酸碱度耐受性良好，在酸碱度pH值为6-10的条件下均可保持稳定效价。

实施例4、噬菌体pKp11的最佳感染复数和一步生长曲线测试

最佳感染复数的测定：分别以噬菌体pKp11与宿主菌C10的比例即感染复数为100、10、1、0.1、0.01、0.001和0.0001混合振荡培养，培养4小时后以双层琼脂平板法测定噬菌体效价，效价最高者即为最佳感染复数。测试结果显示，当感染复数为0.01时，噬菌体pKp11的效价最高，即最佳感染复数为0.01。

一步生长曲线的测定：将噬菌体pKp11和宿主菌C10以最佳感染复数的比例混合振荡培养，培养150分钟期间，每10分钟测定一次噬菌体效价。测试结果如图4所示，噬菌体pKp11的潜伏期在0-10分钟，爆发期在10-110分钟，随后进入稳定期。

实施例5、噬菌体pKp11对宿主菌C10的裂解能力及宿主谱测试

对宿主菌C10的裂解能力测定：分别以噬菌体pKp11与宿主菌C10的比例即感染复数为10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001、10^-5、10^-6、10^-7和10^-8混合振荡培养，培养7小时期间，每1小时测定一次OD₆₀₀值。测定结果如图5所示，噬菌体pKp11在感染复数为10到10^-6的范围内均可有效抑制多重耐药序列11型肺炎克雷伯氏菌的生长，可作为治疗由多重耐药序列11型Kpn所致肺炎的候选噬菌体制剂。

宿主谱测定：分别将噬菌体pKp11和12株序列11型多重耐药Kpn以最佳感染复数的比例混合振荡培养，培养4小时后观察培养液。培养液澄清即为噬菌体pKp11可裂解该多重耐药Kpn。测定结果显示，噬菌体pKp11可裂解12株序列11型多重耐药Kpn菌株，菌株的具体信息如表1所示。

表1

菌株编号	序列型
		C10	11
Kp11-2	11
		Kp11-3	11
Kp11-4	11
		Kp11-5	11
Kp11-6	11
		Kp11-7	11
Kp11-8	11
		Kp11-9	11
Kp11-10	11
		Kp11-11	11
Kp11-12	11

实施例6、噬菌体对宿主菌C10的裂解能力测试

在含50μL宿主菌C10悬液的7管5mL LB培养基中，分别加入200μL噬菌体pKp-1、pKp-2、pKp-3、pKp-4、pKp-5、pKp383和pKp11，于37℃摇床中以转速220rpm振荡培养。培养4小时后，观察培养液是否澄清。如图6所示，pKp-1、pKp-2、pKp-3、pKp-4、pKp-5和pKp383处理组的培养液浑浊，表明该6株噬菌体不能裂解宿主菌C10；而pKp11处理组的培养液澄清，表明pKp11可裂解宿主菌C10。

应当指出的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种克雷伯氏菌噬菌体(Klebsiella phage)，其保藏编号为CGMCC No.45097。

2.根据权利要求1所述的噬菌体，其在温度4-50℃和pH 6-10的条件下保持稳定效价。

3.一种噬菌体制剂，其包括：保藏编号为CGMCC No.45097的噬菌体，以及辅料。

4.根据权利要求3所述的噬菌体制剂，其中，所述辅料包括用于维持菌体活性的营养组分。

5.根据权利要求3所述的噬菌体制剂，其中，所述辅料为LB培养基。

6.根据权利要求3所述的噬菌体制剂，其为药物。

7.根据权利要求3所述的噬菌体制剂，其为清洁剂或消毒剂。

8.保藏编号为CGMCC No.45097的噬菌体用于体外裂解多重耐药序列11型肺炎克雷伯氏菌的应用。

9.保藏编号为CGMCC No.45097的噬菌体在制备用于裂解多重耐药序列11型肺炎克雷伯氏菌的制剂中的应用。

10.保藏编号为CGMCC No.45097的噬菌体在制备用于防治由多重耐药序列11型肺炎克雷伯氏菌引起的肺炎的药物中的应用。