CN114381436B - 一种高产乙醇肺炎克雷伯菌噬菌体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高产乙醇肺炎克雷伯菌噬菌体及其应用。具体而言，本发明提供了一种噬菌体，其保藏编号为CGMCC No.23085。本发明还提供了所述的噬菌体在制备特异高效地裂解高产乙醇肺炎克雷伯菌的试剂中的应用。本发明噬菌体可在短时间内大量增殖，并对温度和酸碱度具有良好的耐受性，可用于治疗由HiAlc Kpn引起的非酒精性脂肪肝。

Description

一种高产乙醇肺炎克雷伯菌噬菌体及其应用

技术领域

本发明是关于一种噬菌体及其应用，具体地说，是关于一种高产乙醇肺炎克雷伯菌噬菌体，以及该噬菌体在制备用于治疗由高产乙醇肺炎克雷伯菌(high alcohol-producing Klebsiella pneumoniae,HiAlc Kpn)引起的非酒精性脂肪肝的药物中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

肠道微生态菌群是一个复杂的环境，肠道菌群与机体的生理和代谢有着千丝万缕的联系。研究表明，当肠道菌群中存在高产乙醇的肺炎克雷伯菌时，其可在肠道中定植、持续产生乙醇，且产生的乙醇可在肝脏乙醇脱氢酶、过氧化氢酶和微粒体乙醇氧化系统等的作用下通过门静脉进入肝脏，从而引发非酒精性脂肪肝。非酒精性脂肪肝目前已成为引起全球慢性肝病的首要原因，若未对脂肪肝及时进行治疗，脂肪肝可逐渐发展为脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌。

肺炎克雷伯菌属于肠杆菌科克雷伯氏菌属，是一种重要的条件致病菌和医源性感染菌，常寄居于人体呼吸道和肠道中。因为近年来抗生素的不合理使用，肺炎克雷伯菌的耐药情况日益严峻，抗生素治疗的效果越来越不尽如人意。目前，肺炎克雷伯菌已被列入全球医院抗生素耐药危机的微生物名单，且其多重耐药率呈逐年上升趋势。

噬菌体治疗是一种20世纪新兴的利用噬菌体特异性抑制感染病原菌的方案。在耐药情况日益严峻的形势下，噬菌体治疗再次受到全球研究者的关注。噬菌体广泛分布于自然界中，是一种可以特异性侵染细菌的病毒，导致宿主菌代谢紊乱或者裂解死亡。噬菌体不仅可以在不破坏动植物细胞的情况下特异性杀伤细菌，还具有增殖快、易基因改造等特点。目前已有通过噬菌体治疗多重耐药细菌感染的多个成功案例。

尽管已有多种噬菌体制剂被用于预防控制细菌的感染，但目前尚未有针对HiAlcKpn的噬菌体的报道，治疗由HiAlc Kpn所致非酒精性脂肪肝的噬菌体治疗方法尚处空白。

因此，如果能提供一种可以特异性裂解HiAlc Kpn的噬菌体，将对于由HiAlc Kpn所致非酒精性脂肪肝的治疗具有重要意义。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种新的肺炎克雷伯菌噬菌体。

本发明的另一目的在于提供所述噬菌体的相关应用。

本案发明人在研究中发现一株裂解性高产乙醇肺炎克雷伯菌噬菌体，本发明中命名为phiTH1。本发明的噬菌体phiTH1已于2021年8月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，其保藏日期：2021年8月20日；分类命名为：克雷伯菌噬菌体，保藏编号为CGMCCNo.23085。本发明中亦称该菌为噬菌体phiTH1。

本发明的噬菌体phiTH1属有尾噬菌体，对温度和酸碱度的耐受性良好，可在温度4-40℃和pH 5-10的条件下保持稳定效价。噬菌体与细菌的最佳感染复数(multiplicityof infection,MOI)为0.001。并且，本发明的噬菌体phiTH1的潜伏期在0-20分钟，爆发期在20-80分钟，随后进入稳定期。本发明的噬菌体可以裂解HiAlc Kpn菌株，特别是对于HiAlcKpn菌株W14(保藏编号为CGMCC No.12540，Genebank号为GCA_001676825.1，为现有技术中的一株HiAlc Kpn菌株)。本发明的噬菌体phiTH1在感染复数为10到0.0001的范围内均可有效抑制高产乙醇肺炎克雷伯菌的生长，可为开发治疗由HiAlc Kpn所致非酒精性脂肪肝的抗生素替代疗法奠定基础。

具体而言，一方面，本发明提供了一种噬菌体，其保藏编号为CGMCC No.23085。

另一方面，本发明提供了一种噬菌体制剂，其包括：保藏编号为CGMCC No.23085的噬菌体，以及辅料。

根据本发明的具体实施方案，本发明的噬菌体制剂中，所述辅料包括用于维持菌体活性的营养组分。在一些具体实施方案中，所述辅料可以为LB培养基。在一些更具体实施方案中，所述的LB培养基中，胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠10g/L。

根据本发明的一些具体实施方案，本发明的噬菌体制剂为药物。

根据本发明的一些具体实施方案，本发明的噬菌体制剂为清洁剂或消毒剂。

另一方面，本发明提供了保藏编号为CGMCC No.23085的噬菌体用于体外裂解产乙醇肺炎克雷伯菌的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明对噬菌体phiTH1的宿主谱进行了测定，测定结果表明，噬菌体phiTH1可裂解多株HiAlc Kpn。

另一方面，本发明提供了保藏编号为CGMCC No.23085的噬菌体在制备用于裂解产乙醇肺炎克雷伯菌的制剂中的应用。

另一方面，本发明提供了保藏编号为CGMCC No.23085的噬菌体在制备用于防治由产乙醇肺炎克雷伯菌引起的非酒精性脂肪肝的药物中的应用。

根据本发明的具体实施方案，本发明的噬菌体的应用中，所述产乙醇肺炎克雷伯菌包括保藏编号为CGMCC No.12540的菌株W14。

综上所述，本发明提供了一种噬菌体phiTH1，其可以特异性裂解高产乙醇肺炎克雷伯菌，且具有裂解量大、宿主谱较宽、温度和酸碱度耐受良好的特点，对高产乙醇肺炎克雷伯菌具有很好的抑制效果，具有良好的应用前景。

附图说明

图1所示为噬菌体phiTH1的透射电镜图。

图2所示为噬菌体phiTH1的温度耐受性测试图。

图3所示为噬菌体phiTH1的酸碱度耐受性测试图。

图4所示为噬菌体phiTH1的一步生长曲线图。

图5所示为噬菌体phiTH1的对宿主菌W14的裂解曲线图。

用于专利程序的生物材料保存：

本发明的噬菌体phiTH1(因其对菌株W14具有裂解能力，提交保藏时以phiW14的自命名登记)：

保藏日期：2021年8月20日；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所保藏编号：CGMCC No.23085；

分类命名：克雷伯菌噬菌体。

具体实施方式

为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图与实施例对本发明作进一步地详细描述。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂，均可通过商购获得。

实施例1、噬菌体phiTH1的分离纯化与保藏

噬菌体分离液的制备：2016年10月，从北京地区下水道采集50mL污水，作为噬菌体分离的样品。将污水以转速4000rpm离心20分钟，使用0.22μm微孔滤器过滤离心后的上清液后，得到噬菌体分离液。

噬菌体的分离：在5mL LB培养基中加入50μL宿主菌W14悬液和200μL噬菌体分离液，于37℃摇床中以转速220rpm振荡培养。培养4小时后，将培养液以转速10000rpm离心2分钟，使用0.22μm微孔滤器过滤离心后的上清液。取100μL上清液，采用双层琼脂平板法进行噬菌斑筛选。

噬菌体的纯化：待双层琼脂平板在37℃孵箱中静置培养12-24小时后，用接种环挑取单个噬菌斑至LB培养基中，同时加入50μL宿主菌W14悬液，于37℃摇床中以转速220rpm振荡培养。培养4小时后，将培养液以转速10000rpm离心2分钟，使用0.22μm微孔滤器过滤离心后的上清液。取100μL上清液，采用双层琼脂平板法进行噬菌斑筛选。重复上述操作4-5次，直至出现形态均匀、一致的噬菌斑，即获得纯化的噬菌体。

本发明中，采用上述方法，获得一株噬菌体，本发明中命名为phiTH1。

噬菌体phiTH1的电镜下形态观察：在纯化后的噬菌体phiTH1培养液中加入1％的氯仿、DNase和RNase。离心上述溶液后收集上清，并加入10％的PEG8000，再次离心后以SM缓冲液重悬沉淀。在上述溶液中加入1％的氯仿，离心后取上层水相，获得噬菌体悬液。将噬菌体悬液稀释至适当浓度后，沉降于铜网表面，并对噬菌体进行复染。透射电镜观察，找到单个噬菌体完整形态的视野后拍照记录。如图1所示，噬菌体phiTH1为短尾噬菌体，直径约为50nm。

经检测，本发明的噬菌体phiTH1对温度和酸碱度的耐受性良好，可在温度4-40℃和pH 5-10的条件下保持稳定效价，噬菌体与细菌的最佳感染复数(multiplicity ofinfection,MOI)为0.001。噬菌体phiTH1的潜伏期在0-20分钟，爆发期在20-80分钟，随后进入稳定期。

噬菌体phiTH1可以裂解的HiAlc Kpn菌株W14(保藏编号为CGMCC No.12540，Genebank号为GCA_001676825.1)。HiAlc Kpn菌株W14已被证明是一名自酿酒综合征患者所患非酒精性脂肪肝的病原，在葡萄糖和果糖的诱导下具有很高的产乙醇能力。本发明的噬菌体phiTH1已于2021年8月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏日期：2021年8月20日，分类命名为：克雷伯菌噬菌体，保藏编号为CGMCC No.23085。本发明中亦称该菌为噬菌体phiTH1。

实施例2、噬菌体phiTH1的温度耐受性测试

分别取1mL噬菌体悬液(参照实施例1中所制备)phiTH1于4℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃条件下孵育1小时，使用双层琼脂平板法测定噬菌体活性。

测试结果如图2所示，噬菌体phiTH1对温度耐受性良好，在温度4-40℃的条件下均可保持稳定效价。

实施例3、噬菌体phiTH1的酸碱度耐受性测试

将噬菌体phiTH1分别接种于酸碱度pH值为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14的SM缓冲液中，37℃条件下孵育1小时，并使用双层琼脂平板法测定噬菌体活性。

测试结果如图3所示，噬菌体phiTH1对酸碱度耐受性良好，在酸碱度pH值为5-10的条件下均可保持稳定效价。

实施例4、噬菌体phiTH1的最佳感染复数和一步生长曲线测试

最佳感染复数的测定：分别以噬菌体phiTH1与宿主菌W14的比例即感染复数为10、1、0.1、0.01、0.001和0.0001混合振荡培养，培养4小时后以双层琼脂平板法测定噬菌体效价，效价最高者即为最佳感染复数。测试结果显示，当感染复数为0.001时，噬菌体phiTH1的效价最高，即最佳感染复数为0.001。

一步生长曲线的测定：将噬菌体phiTH1和宿主菌W14以最佳感染复数的比例混合振荡培养，培养2小时期间，每10分钟测定一次噬菌体效价。测试结果如图4所示，噬菌体phiTH1的潜伏期在0-20分钟，爆发期在20-80分钟，随后进入稳定期。

实施例5、噬菌体phiTH1对宿主菌W14的裂解能力及宿主谱测试

对宿主菌W14的裂解能力测定：分别以噬菌体phiTH1与宿主菌W14的比例即最佳感染复数为10、1、0.1、0.01、0.001和0.0001混合振荡培养，培养6小时期间，每1小时测定一次OD₆₀₀值。测定结果如图5所示，噬菌体phiTH1在感染复数为10到0.0001的范围内均可有效抑制高产乙醇肺炎克雷伯菌的生长，可作为治疗由HiAlc Kpn所致非酒精性脂肪肝的候选噬菌体制剂。

宿主谱测定：分别将噬菌体phiTH1和13株HiAlc Kpn以最佳感染复数的比例混合振荡培养，培养4小时后观察培养液。培养液澄清即为噬菌体phiTH1可裂解该HiAlc Kpn。测定结果显示，噬菌体phiTH1可裂解13株HiAlc Kpn，13株HiAlc Kpn的具体信息如表1所示。

表1

菌株编号	序列型(sequence type,ST)	产乙醇能力(mmol/L)
			Kp1	ST25	46.2
Kp2	ST25	38.2
			Kp3	ST65	36.4
Kp4	ST65	39.1
			Kp5	ST65	47.0
Kp6	ST86	42.9
			Kp7	ST86	44.3
Kp8	ST86	47.5
			Kp9	ST193	45.5
Kp10	ST375	35.6
			Kp11	ST375	39.8
Kp12	ST375	40.6
			Kp13	ST1536	55.2

应当指出的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1. 一种噬菌体，其保藏编号为CGMCC No.23085。

2. 根据权利要求1所述的噬菌体，其在温度4-40℃和pH 5-10的条件下保持稳定效价。

3. 一种噬菌体制剂，其包括：保藏编号为CGMCC No.23085的噬菌体，以及辅料。

4.根据权利要求3所述的噬菌体制剂，其中，所述辅料包括用于维持菌体活性的营养组分。

5.根据权利要求4所述的噬菌体制剂，其中，所述辅料为LB培养基。

6.根据权利要求3所述的噬菌体制剂，其为药物。

7.根据权利要求3所述的噬菌体制剂，其为清洁剂或消毒剂。

8. 保藏编号为CGMCC No.23085的噬菌体用于体外裂解产乙醇肺炎克雷伯菌的应用。

9. 保藏编号为CGMCC No.23085的噬菌体在制备用于裂解产乙醇肺炎克雷伯菌的制剂中的应用。

10. 保藏编号为CGMCC No.23085的噬菌体在制备用于防治由产乙醇肺炎克雷伯菌引起的非酒精性脂肪肝的药物中的应用。

11. 根据权利要求8-10任一项所述的应用，其中，所述产乙醇肺炎克雷伯菌包括保藏编号为CGMCC No.12540的菌株。

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