CN114854632B - 一株海藻来源的共生盐孢菌hz014及其应用 - Google Patents

一株海藻来源的共生盐孢菌hz014及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株海藻来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)HZ014及包括所述盐孢菌(Salinispora sp.)HZ014的防治水产养殖动物及芒果病害的生防制品，该海藻来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)HZ014及防治病原菌的生防制品对多种病原菌具有抑制效果。本发明还公开了上述海藻来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)HZ014或包括所述共生盐孢菌(Salinispora sp.)HZ014的防治水产养殖动物及芒果病害的生防制品在制备具有防治病原菌效果的药物方面的应用。

Description

一株海藻来源的共生盐孢菌HZ014及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株海藻来源的共生盐孢菌HZ014及其应用。
背景技术
海藻(Algae)是一类具有重要价值的海洋植物，是海洋生物资源的重要组成部分。因长期生存在潮间带和深海中，海藻体内附生了大量共生菌群。这些共生微生物与海藻相互依存，通过产生活性代谢产物构建化学防御体系，帮助海藻抵抗捕食者和致病微生物、抵抗外界致病菌和病毒的侵害，以及其他海洋生物的攻击。因此海藻共生微生物菌群具有重要的生态和药用价值，而放线菌是这些菌群中一个重要的类群。放线菌能够产生最广为人知的具有药用和农用价值的代谢产物，约有70％的天然抗生素来源于放线菌。海洋放线菌因其特殊的生存环境形成了独特的代谢途径、生存繁殖方式和适应机制，从而产生结构独特的次级代谢产物，目前关于海藻来源的共生放线菌及其抗菌活性报道很少，是筛选发现具有农用、药用放线菌资源的潜在来源。
弧菌(Vibrio spp.)和链球菌(Streptococcus spp.)病害是水产养殖业中影响严重的细菌型病害，它可以感染多种水产养殖动物。近年来，随着我国水产养殖业规模的扩大，弧菌和链球菌引起的病害对水产养殖动物的影响日益严重，而治疗这些病原菌导致的疾病主要依赖于多种药物的混合使用，但随着病原菌耐药性增强、药残、食品安全及环境污染等问题日益突出，能选用的病害防治药剂越来越少，亟需寻找新型抗生素替代物和微生物菌剂来解决水产养殖业绿色健康发展面临的问题。因此，挖掘海藻来源的活性共生放线菌资源对于研发适用于我国海水养殖业中弧菌病害的绿色防治菌剂具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一株海藻来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)HZ014及包括所述盐孢菌(Salinispora sp.)HZ014的防治水产养殖动物及芒果病害的生防制品，该海藻来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)HZ014及防治病原菌的生防制品对多种病原细菌具有抑制效果。
本发明的目的还在于提供上述海藻来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)HZ014或包括所述共生盐孢菌(Salinispora sp.)HZ014的防治水产养殖动物和/或芒果病害的生防制品在制备具有防治病原菌效果的药物方面的应用。
本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一株海藻来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)HZ014，其保藏编号为GDMCC No：62382，保藏日期为2022年04月14日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所。
本申请发明人通过采集中国南海西沙群岛的海藻，首次从海藻中分离纯化得到一株严格依赖海水生长的海洋放线菌菌株，它能够有效抑制多种病原细菌，在本发明实施例中将其编号为盐孢菌(Salinispora sp.)HZ014，简写为HZ014。
本发明还提供了一种用于防治水产养殖动物病原细菌和/或芒果病原细菌病害的生防制品，包括所述海藻来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)HZ014和/或所述海藻来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)HZ014的发酵提取物。
本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：上述海藻来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)HZ014或所述的生防制品在制备具有防治水产养殖动物病原细菌病害效果的药物方面的应用。
优选的，所述的病原细菌包括哈维氏弧菌、美人鱼发光杆菌、海豚链球菌和无乳链球菌中一种或几种的组合。
本发明还提供了上述海藻来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)HZ014或上述的生防制品在制备具有防治芒果病原细菌病害效果的药物方面的应用。
优选的，所述的病原细菌为芒果角斑病病原细菌。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明获得的盐孢菌(Salinispora sp.)HZ014是国际上首次从海藻中发现的专性海洋放线菌，其抗菌效果好、防治效果稳定、抑菌谱较广，具有较好的应用潜力和开发前景，其发酵提取物可用于弧菌病、链球菌病以及芒果角斑病的防治；
(2)本发明中的盐孢菌HZ014及其生防制品如发酵提取物等较化学农药比，具有无耐药性、无残留、低毒性、对环境友好等优点，更符合当下绿色环保理念。
附图说明
图1为实施例1中筛选获得的放线菌菌株HZ014的菌落形态图；
图2为实施例2中菌株HZ014及相关菌株的系统发育树；
图3为实施例4中菌株HZ014发酵提取物P3对无乳链球菌、哈维氏弧菌、芒果角斑病细菌的抑菌效果，其中平板上的w是指无乳链球菌，19-1是哈维氏弧菌编号，L3是芒果角斑病编号，左边的A14D是代指菌株HZ014的发酵提取物，卡是指阳性药物卡纳霉素；
图4为实施例5中菌株HZ014发酵提取物P3在40℃、50℃、60℃水浴处理1h后对无乳链球菌、哈维氏弧菌、芒果角斑病细菌的抑制效果。
具体实施方式
实施例1菌株分离
从中国海南西沙群岛海域采集海藻生物样品，选用高氏合成一号培养基，采用稀释涂布法分离，28℃恒温培养2个月，挑取放线菌菌株HZ014转移至添加全海盐的ISP2固体培养基，纯化后，于甘油管-20℃保存。
高氏合成一号培养基按以下按质量体积比例的组分配备：可溶性淀粉20g/L，NaCl0.5g/L，FeSO4 0.01g/L，KNO3 1g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4 0.5g/L，海盐17.5g/L，琼脂15g/L，最终pH 7.3±0.2(在1L水中配制而成，以下培养基相同)。
添加全海盐的ISP2培养基按以下按质量体积比例的组分配备：酵母浸粉4g/L，麦芽浸粉10g/L，葡萄糖4g/L，海盐35g/L，琼脂20g/L，pH7.2±0.2。
盐孢菌菌株HZ014在添加全海盐的ISP2培养基平板上生长良好，28℃培养2-3天时，菌落凸起，孢子堆颜色接近橙色，其菌落形态图如图1所示。
实施例2菌株HZ014的分子鉴定
将实施例1获得的菌株HZ014接种至添加全海盐的ISP2培养基上，28℃培养7天，挑取单菌落至添加全海盐的ISP2培养基上进行二次纯化培养14天，直接将该带菌平板交由北京擎科生物科技有限公司昆明分公司进行16S rDNA序列测定。
菌株HZ014的16S rDNA基因序列为(具体如SEQ ID NO：1所示)：
ggttaggccaccggcttcgggtgttgccgactttcgtgacgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcagcgttgctgatctgcgattactagcgactccgacttcacggggtcgagttgcagaccccgatccgaactgagaccggctttttgggattcgctccacctcacggtatcgcagcccactgtaccggccattgtagcatgcgtgaagccctggacataaggggcatgatgacttgacgtcatccccaccttcctccgagttgaccccggcagtcttcgatgagtccccgccataacgcgctggcaacatcgaacaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcaccacctgtcaccggccccgaaggaccccccatctctgaaggatttccggcgatgtcaaacccaggtaaggttcttcgcgttgcatcgaattaatccgcatgctccgccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagttttagccttgcggccgtactccccaggcggggcgcttaatgcgttagctgcggcacagagaaccggagaggccccccacacctagcgcccaacgtttacagcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagtatcggcccagagacccgccttcgccaccggtgttcctcctgatatctgcgcatttcaccgctacaccaggaattccagtctcccctaccgaactctagcctgcccgtatcgactgcaagcccgcagttgagccacgggttttcacagtcgacgcgacaagccgcctacgagctctttacgcccaataaatccggacaacgcttgcgccctacgtcttaccgcggctgctggcacgtagttggccggcgcttcttctgcaggtaccgtcacaaacgcttcgtccctgctgaaagaggtttacaacccgaaggccgtcatccctcacgcggcgtcgctgcatcaggcttccgcccattgtgcaagattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccggtcgccctctcaggccggctacccgtcgccgccttggtaggccatcaccccaccaacaagctgataggccgcgagcccatcccaagccaaaaaatctttccaccacccaccatgcgacagatggtcatatccggtattagccccggtttcccggggttatcccaaagcctggggcaggttactcacgtgttactcacccgttcgccgctcgagtaccccgaagggcctttccgctcgac 1362。
在NCBI网站上对上述序列进行BLAST比对，选择相似度大于98％的菌株的16SrDNA基因序列作为参比对象，在MEGA-X软件中进行多序列比对，通过邻接法进行聚类分析和构建系统发育树(如图2所示)，得出菌株HZ014与Salinispora arenicola的不同菌株在同一进化支上，因此将该菌株鉴定为盐孢菌属(Salinispora sp.)，保藏号：GDMCC No：62382，保藏日期：2022年04月14日，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广东省越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所。
实施例3菌株HZ014的发酵及其发酵提取物的制备
利用全海盐的ISP2培养基平板活化实施例1中获得的菌株HZ014，接种于TSB液体培养基中，28℃、160rpm振荡培养3d；按照10％(体积百分含量)接种量分别接种到0.6L液体发酵培养基(分别接种到培养基P1、培养基P2、培养基P3和培养基P4)中，28℃、160rpm振荡培养10d，得到发酵液；用等体积的乙酸乙酯(0.6L)萃取发酵液，反复萃取3遍，合并3次乙酸乙酯萃取液，并在50℃下减压浓缩至干品，得到提取物，即为菌株HZ014的发酵提取物P1、发酵提取物P2、发酵提取物P3和发酵提取物P4。
培养基P1(TSB液体培养基)按以下按重量体积比例的组分配备：胰酪胨17g/L、大豆木瓜蛋白酶水解物3g/L、氯化钠5g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、海盐35g/L、葡萄糖2.5g/L，pH7.3±0.2。
培养基P2按以下按重量体积比例的组分配备：可溶性淀粉20g/L、蛋白胨5g/L、麦芽提取物3g/L、酵母提取物3g/L、葡萄糖10g/L、CaCO31 g/L、海盐35g/L、pH7.0。
培养基P3按以下按重量体积比例的组分配备：麦芽提取物物20g/L、蛋白胨5g/L、葡萄糖15g/L、碳酸钙1g/L、海盐35g/L、pH7.0。
培养基P4(ISP2液体培养基)按以下按重量体积比例的组分配备：麦芽提取物10g/L、酵母提取物4g/L、葡萄糖4g/L、海盐35g/L、pH7.0。
实施例4菌株HZ014对病原细菌的抗菌活性测定
以影响严重的两种罗非鱼病原细菌海豚链球菌(Streptococcus iniae)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)，2种严重致病性的海水养殖动物病原细菌哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)以及严重影响芒果品质的芒果角斑病细菌(Xanthomanas campestrispv.mangiferaeindicae)作为抗菌谱测定的指示菌。
通过平板打孔法测定发酵提取物的抑菌活性：实施例3获得的发酵提取物用二甲基亚砜(DMSO)溶解为浓度10mg/mL的溶液，DMSO作阴性对照，卡那霉素(10mg/mL)作为阳性对照，每个孔里加入20μL溶液，每个处理重复3次，28℃恒温培养24～48h后，采用十字交叉法测量透明抑菌圈直径大小。部分抑菌效果如图3所示，结果如下表1所示。
表1菌株HZ014对病原细菌的抗菌谱测定
Figure BDA0003641117320000051
备注：P1～P4分别代表4种不同培养基P1～P4培养获得的菌株HZ014的发酵提取物P1～P4。
从表1数据可以看出，菌株HZ014的4种发酵提取物P1～P4均对海豚链球菌、无乳链球菌、哈维氏弧菌、芒果细菌角斑病菌具有强抗菌活性，表明该菌对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有广谱的抗菌活性。其中，发酵提取物P1对海豚链球菌和芒果角斑病细菌的抗菌活性最强；发酵提取物P1对海豚链球菌的抗菌活性显著强于阳性对照药卡那霉素；发酵提取物P1～P4对无乳链球菌的抗菌活性均显著强于阳性对照药；发酵提取物P1、P3和P4对哈维氏弧菌的抗菌活性均与阳性对照药的活性相当；此外，发酵提取物P1和P3对美人鱼发光杆菌具有弱抑制活性，P2和P4对美人鱼发光杆菌没有抑制活性。因此，该菌在水产养殖业的绿色微生态制剂关键技术研发中具有应用潜力，其发酵产物在制备水产养殖动物的广谱抗菌药剂中具有重要开发价值。
测定发酵提取物P1和P3对哈维氏弧菌、海豚链球菌的最低抑菌浓度(MIC)：将发酵提取物配制为母液1.3mg/mL的溶液，选用96孔板，每行第一孔打入160μL培养基和40μL不同浓度样品，采用二倍稀释法依次稀释，最后加入100μL病原菌液，细菌菌液吸光值OD600＝0.6～0.8。放入28℃恒温培养24～48h后观察。结果如表2所示。
表2菌株HZ014的发酵提取物P1和P3对病原细菌的最低抑菌浓度(MIC)
Figure BDA0003641117320000061
从表2中可以看出，菌株HZ014的发酵提取物P1和P3均对哈维氏弧菌具有强抗菌作用，其最低抑菌浓度分别为4.06和2.03μg/mL，均显著强于阳性对照药卡那霉素；菌株HZ014的发酵提取物P1和P3的抗菌活性也都强于阳性对照药。菌株HZ014的发酵提取物P3对哈维氏弧菌的抗菌活性最强，菌株HZ014的发酵提取物P1对海豚链球菌的抗菌活性最强，在制备水产养殖动物的广谱抗菌药剂中具有重要开发价值。
本申请通过提取物筛选抗菌活性，来说明菌株HZ014能产生抗菌活性物质，菌株HZ014有活性正是因为其能产生抗菌活性物质，只要菌株发酵提取物有抗菌活性，就说明这个菌株有抗菌活性，因此可以通过直接测试菌株发酵提取物的抗菌活性，来说明菌株的抗菌活性，此外，也可以通过菌株在培养条件下分泌产生的物质具备的抗菌活性，来说明菌株的抗菌活性。
实施例5菌株HZ014的发酵提取物P3抗菌活性的热稳定性测试
由于菌株不耐高温，因此采用菌株的发酵提取物来测试热稳定性，将发酵提取物P3配制成浓度为10mg/mL的样品液，分别置于40℃、50℃、60℃下水浴处理1h。以无乳链球菌、哈维氏弧菌、芒果角斑病细菌为测试菌，通过打孔法测定抑菌活性：吸取200μL病原细菌稀释液于无菌培养皿中，倒入15mL未凝固的琼脂培养基，菌液与培养基充分混匀，待平板内培养基完全凝固后，采用打孔法，DMSO作阴性对照，不同温度处理过的卡那霉素(10mg/mL)作为阳性对照，每个孔里加入20μL溶液，每个处理重复3次，28℃恒温培养24～48h后，测量透明抑菌圈直径大小。抑菌直径如表3～表5所示。
表3不同温度处理的发酵提取物P3对哈维氏弧菌的抑菌直径
Figure BDA0003641117320000071
表4不同温度处理的发酵提取物P3对无乳链球菌的抑菌直径
Figure BDA0003641117320000072
表5不同温度处理的发酵提取物对芒果角斑病的抑菌直径
Figure BDA0003641117320000073
菌株HZ014的发酵提取物P3在40℃、50℃、60℃水浴处理1h后对无乳链球菌、哈维氏弧菌、芒果角斑病抑制效果如图4所示。从表3～表5可以看出，菌株HZ014的发酵提取物P3在室温条件下对哈维氏弧菌、无乳链球菌、芒果角斑病均具有最强的抑菌效果，其中对哈维氏弧菌、无乳链球菌的抗菌活性均强于阳性对照药卡那霉素；经3个温度处理过的发酵提取物P3对哈维氏弧菌、无乳链球菌、芒果角斑病细菌的抑菌效果均有一定程度的下降，但仍有较强的抑菌效果，其中各温度处理过的发酵提取物P3对哈维氏弧菌和无乳链球菌的抗菌活性仍然强于阳性对照药。因此该发酵提取物对哈维氏弧菌、无乳链球菌和芒果角斑病细菌的抗菌活性具有较好的热稳定性，在防治该类病原细菌病害中可发挥稳定防效。
需要指出的是，上述实施例仅是对本发明的进一步说明，而不是限制，本领域技术人员在与本发明技术方案的相当的含义和范围内的任何调整或改变，都应认为是包括在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所
<120> 一株海藻来源的共生盐孢菌HZ014及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1362
<212> DNA
<213> 盐孢菌(Salinispora sp.)
<400> 1
ggttaggcca ccggcttcgg gtgttgccga ctttcgtgac gtgacgggcg gtgtgtacaa 60
ggcccgggaa cgtattcacc gcagcgttgc tgatctgcga ttactagcga ctccgacttc 120
acggggtcga gttgcagacc ccgatccgaa ctgagaccgg ctttttggga ttcgctccac 180
ctcacggtat cgcagcccac tgtaccggcc attgtagcat gcgtgaagcc ctggacataa 240
ggggcatgat gacttgacgt catccccacc ttcctccgag ttgaccccgg cagtcttcga 300
tgagtccccg ccataacgcg ctggcaacat cgaacaaggg ttgcgctcgt tgcgggactt 360
aacccaacat ctcacgacac gagctgacga cagccatgca ccacctgtca ccggccccga 420
aggacccccc atctctgaag gatttccggc gatgtcaaac ccaggtaagg ttcttcgcgt 480
tgcatcgaat taatccgcat gctccgccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat tcctttgagt 540
tttagccttg cggccgtact ccccaggcgg ggcgcttaat gcgttagctg cggcacagag 600
aaccggagag gccccccaca cctagcgccc aacgtttaca gcgtggacta ccagggtatc 660
taatcctgtt cgctccccac gctttcgctc ctcagcgtca gtatcggccc agagacccgc 720
cttcgccacc ggtgttcctc ctgatatctg cgcatttcac cgctacacca ggaattccag 780
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aggtaccgtc acaaacgctt cgtccctgct gaaagaggtt tacaacccga aggccgtcat 1020
ccctcacgcg gcgtcgctgc atcaggcttc cgcccattgt gcaagattcc ccactgctgc 1080
ctcccgtagg agtctgggcc gtgtctcagt cccagtgtgg ccggtcgccc tctcaggccg 1140
gctacccgtc gccgccttgg taggccatca ccccaccaac aagctgatag gccgcgagcc 1200
catcccaagc caaaaaatct ttccaccacc caccatgcga cagatggtca tatccggtat 1260
tagccccggt ttcccggggt tatcccaaag cctggggcag gttactcacg tgttactcac 1320
ccgttcgccg ctcgagtacc ccgaagggcc tttccgctcg ac 1362

Claims (5)

1.一株海藻来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)HZ014，其特征是：其保藏编号为GDMCC No：62382，保藏日期为2022年04月14日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所。
2.一种用于防治水产养殖动物病原细菌和/或芒果病原细菌病害的生防制品，其特征是：包括权利要求1所述海藻来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)HZ014和/或权利要求1所述海藻来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)HZ014的发酵提取物；所述发酵提取物是将海藻来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)HZ014的发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取，反复萃取3遍，合并3次乙酸乙酯萃取液，并在50℃下减压浓缩至干品得到。
3.权利要求1所述海藻来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)HZ014或权利要求2所述的生防制品在制备具有防治水产养殖动物病原细菌病害效果的药物方面的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征是：所述水产养殖动物病原细菌包括哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)中一种或几种的组合。
5.权利要求1所述海藻来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)HZ014或权利要求2所述的生防制品在制备具有防治芒果病原细菌病害效果的药物方面的应用；所述芒果病原细菌为芒果角斑病病原细菌Xanthomanas campestrispv.mangiferaeindicae。
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