CN114921382B - 一株珊瑚来源的共生盐孢菌sh098及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株珊瑚来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)SH098及包括所述共生盐孢菌(Salinispora sp.)SH098的防治水产病原菌的生防制品，该珊瑚来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)SH098以及防治水产病原菌的生防制品对多种水产病原菌具有抑菌效果。本发明还公开了上述珊瑚来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)SH098或包括所述共生盐孢菌(Salinispora sp.)SH098的防治水产病原菌的生防制品在制备具有防治水产病原菌效果的药物方面的应用。

Description

一株珊瑚来源的共生盐孢菌SH098及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株珊瑚来源的共生盐孢菌SH098及其应用。
背景技术
频繁发生的水产养殖动物病害是制约水产养殖业健康发展的关键问题，然而随着养殖规模的扩大，大量抗生素药物的滥用，导致水产动物致病菌耐药性增强、药物残留、食品安全以及环境污染等问题日益突出，能选用的病害防治药剂越来越少，亟需寻找新型抗生素替代物和微生态菌剂来解决水产养殖业绿色健康发展面临的问题。海洋放线菌能够产生大量抗细菌活性的代谢产物，它们在应对抗生素耐药菌方面具有巨大的应用潜力，因此是寻找抗生素替代物的重要目标。海洋生物共附生放线菌因其与宿主共存的特殊生境，参与宿主的防御体系，抵抗外界致病菌和病毒的侵害，能够产生结构新颖且活性多样的化学分子而备受关注。
独特的高盐、高压、低温、低光或无光、寡营养的海洋环境孕育了种类繁多的海洋微生物，它们拥有丰富的化学多样性。目前关于珊瑚共附生放线菌资源的研究较少，预示着该类资源的深入挖掘与评价将为抗菌药物研发和新型微生态制剂提供新的资源，为水产养殖动物细菌病害防治方案提供新选择。以南海西沙群岛石珊瑚为研究对象，分离筛选致病性细菌的拮抗放线菌资源，为水产养殖业的绿色健康发展提供替抗物质和微生态菌剂菌种资源，也为海南海洋药物资源的深入挖掘和开发利用提供科学依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一株珊瑚来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)SH098及包括所述共生盐孢菌(Salinispora sp.)SH098的防治水产病原菌的生防制品，该珊瑚来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)SH098以及防治水产病原菌的生防制品对多种水产病原菌具有抑菌效果。
本发明的第二个目的在于提供上述珊瑚来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)SH098或包括所述共生盐孢菌(Salinispora sp.)SH098的防治水产病原菌的生防制品在制备具有防治水产病原菌效果的药物方面的应用。
本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一株珊瑚来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)SH098，保藏编号为GDMCC No：62381，保藏日期为2022年04月14日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所。
本申请发明人通过采集海南省三沙市西沙群岛海域的石珊瑚，首次从中分离获得1株专性海洋放线菌，它能够有效抑制多种水产病原细菌，在本发明实施例中将其编号为共生盐孢菌(Salinispora sp.)SH098。
本发明还提供了一种防治水产病原细菌的生防制品，包括所述珊瑚来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)SH098和/或所述珊瑚来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)SH098的发酵提取物。
优选的，所述珊瑚来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)SH098的发酵提取物通过以下方法制备获得：
(1)将所述共生盐孢菌(Salinispora sp.)SH098经平板活化后接种至TSB培养基中，在28℃以160r/min转速振荡培养5～7d；
(2)再分别以10％(体积百分含量)的接种量接种到对应的液体发酵培养基中，28℃，160r/min转速振荡培养12～15d，得到发酵液；
(3)用与发酵液同体积的乙酸乙酯萃取发酵液，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩至干，得到粗提取物，即为发酵提取物。
优选的，步骤(1)中所述的TSB培养基按照以下比例配备：胰酪胨17～19g/L,大豆木瓜蛋白酶水解物(市售)3～4g/L，氯化钠4～5g/L,磷酸氢二钾2～3g/L,葡萄糖2～3g/L，海盐17.5～35.0g/L，pH 7.0～7.3(以1L水为基准配制，下同)。
更佳的，步骤(1)中所述的菌株SH098的TSB培养基按照以下比例配备：胰酪胨17g/L，大豆木瓜蛋白酶水解物(市售)3g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，海盐35.0g/L，pH 7.3。
优选的，步骤(2)中所述菌株SH098液体发酵培养基按照以下比例配备：麦芽提取物19～21.0g/L，蛋白胨0.8～1.2g/L，葡萄糖14.0～16.0g/L，CaCO30.4～0.6g/L,海盐34.0～36.0g/L,pH 7.0±0.2。
更佳的，步骤(2)中所述菌株SH098液体发酵培养基按照以下比例配备：麦芽提取物20.0g/L，蛋白胨1.0g/L，葡萄糖15.0g/L，CaCO3 0.5g/L,海盐35.0g/L,pH 7.0±0.2。
本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：上述珊瑚来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)SH098和/或所述的生防制品在制备具有防治水产病原细菌效果的药物方面的应用。
优选的，所述水产病原细菌包括溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)、欧文氏弧菌(Vibrioowensii)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)中的一种或几种。
本发明还提供了一种生物防治方法，采用所述共生盐孢菌(Salinispora sp.)SH098和/或所述共生盐孢菌(Salinispora sp.)SH098的发酵提取物对水产养殖动物病害进行生物防治。
其中所述水产养殖动物病害是由水产病原细菌包括溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)、欧文氏弧菌(Vibrioowensii)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)中的一种或几种等引起的。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明获得的共生盐孢菌(Salinispora sp.)SH098是首次从石珊瑚中发现的专性海洋放线菌，对水产养殖业中极难防治的弧菌和链球菌病害的抗菌效果好，防治效果稳定，具有极好的应用潜力和开发前景；
(2)本发明中的共生盐孢菌(Salinispora sp.)SH098及其生防制品如发酵提取物等较已有抗生素药物比，具有无耐药性、无公害、低毒性、对环境友好等优点，符合当下绿色环保理念。
附图说明
图1为实施例1中分离获得的菌株SH098的菌落形态图(培养30天)；
图2为实施例2中菌株SH098及相关菌株的系统发育树；
图3为实施例4中菌株SH098发酵提取物对海豚链球菌的抑制效果；
图4为实施例5中菌株SH098发酵提取物经不同时间的紫外光处理后对无乳链球菌的抑制效果。
具体实施方法
实施例1菌株分离
从中国海南省三沙市西沙海域采集珊瑚样品，选用高氏合成一号培养基进行分离，培养2个月，挑取放线菌菌株SH098至ISP2培养基，纯化后于甘油管-20℃保存。
高氏合成一号培养基按以下按质量体积比例的组分配备：可溶性淀粉20.0g/L，NaCl0.5 g/L，FeSO40.01 g/L，KNO31 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO40.5 g/L，琼脂15.0g/L，重铬酸钾0.05g/L，海盐17.5g/L，最终pH 7.3±0.2。
ISP2培养基按以下按质量体积比例的组分配备：酵母浸粉4g/L，麦芽浸粉10g/L，葡萄糖4g/L，琼脂20g/L，海盐17.5g/L，pH7.2±0.2。
菌株SH098在ISP2培养基上，28℃培养14d时，菌落形态从平到高，表面从光滑到起皱，有色素沉着，菌丝呈现橘红色，其菌落形态图如图1所示。
实施例2菌株SH098的分子鉴定
将实施例1中获得的菌株SH098接种至ISP2培养基平板上，28℃培养14d，挑取单菌落至ISP2培养基上进行纯化，直接交由北京擎科生物科技有限公司昆明分公司测序鉴定。
菌株SH098的16S rRNA基因序列为(具体如SEQ ID NO：1所示)：
Figure BDA0003690331580000041
Figure BDA0003690331580000051
将上述序列在NCBI网站进行BLAST相似性比对，选择相似度大于98％的菌株的16SrRNA基因序列作为参比对象，在MEGA-X软件中进行多序列比对，通过邻接法进行聚类分析和构建系统发育树(如图2所示)，鉴定为盐孢属(Salinisporasp.)，保藏号为GDMCC No：62381，保藏日期为2022年04月14日，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广东省越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。
实施例3菌株SH098的发酵及其发酵提取物的制备
实施例1中获得的菌株SH098经平板活化后，接种于TSB培养基中，28℃、160r/min振荡培养7d；按照15％(体积百分含量)接种量接种到1L液体发酵培养基中，28℃、160r/min振荡培养10d，得到发酵液；用等体积的乙酸乙酯(1L)萃取发酵液，反复萃取3遍，合并3次乙酸乙酯萃取液，并在50℃下将其减压浓缩至干品，得到提取物(0.92g)，即为菌株SH098的发酵提取物。
TSB培养基按以下按重量体积比例的组分配备：胰酪胨17.0g/L，大豆木瓜蛋白酶水解物3.0g/L，氯化钠5.0g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，海盐35.0g/L，pH 7.3±0.2。
液体发酵培养基按以下按重量体积比例的组分配备：麦芽提取物20.0g/L，蛋白胨1.0g/L，葡萄糖15.0g/L，CaCO3 0.5g/L，海盐35.0g/L，pH 7.0±0.2。
实施例4菌株SH098发酵提取物的抗菌活性测定
以溶藻弧菌、哈维氏弧菌、欧文氏弧菌、海豚链球菌、无乳链球菌等影响严重的水产养殖动物病原细菌作为测试对象，分别接种于LB液体培养基中，于恒温震荡箱中160r/min，28℃培养1d后，调整菌体浓度至OD600nm＝0.6～0.8，制成菌悬液。
LB液体培养基按以下按质量体积比例的组分配备：胰蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，氯化钠5.0g/L，海盐35.0g/L，pH7.2±0.2。
用二甲基亚砜(DMSO)溶剂将实施例3获得的发酵提取物制成10mg/mL的待测样品。取0.5mL病原菌菌悬液与15mL冷却至55℃的LB培养基倾注于无菌平皿中充分混合，制备带菌平板。待平板凝固后，用1mL的灭菌枪头(直径7mm)在带菌平板上打3个孔，在3个孔内用移液枪分别滴加20μL的发酵提取物，20μL的阳性对照卡那霉素(10mg/mL)和20μL的阴性对照DMSO，28℃恒温培养12h后，采用十字交叉法测量透明抑菌圈直径大小。部分抑菌效果如图3所示，结果如下表1所示。
表1菌株SH098发酵提取物的抗菌谱测定
Figure BDA0003690331580000061
从表1数据可以看出，菌株SH098的发酵提取物对供试的5种病原细菌均具有一定程度的抗菌活性，表明它对革兰氏阴性菌(弧菌)和革兰氏阳性菌(链球菌)均有抑菌效果。其中，在对革兰氏阳性菌的抗菌活性中，对无乳链球菌的抑制作用最强，抑制直径达到31.33±0.94mm，显著强于阳性对照药物。在对革兰氏阴性菌株的抗菌活性中，对哈维氏弧菌的抑制作用最强，抑制直径达到17.16±0.23mm，略高于阳性对照药物卡那霉素。因此该菌在制备用于海水水产养殖水体净化的新型微生态制剂和抗菌药剂研发中具有重要潜力和开发前景，为上述病原细菌引起的病害防治提供了新潜力资源。
测定菌株SH098发酵提取物对无乳链球菌，海豚链球菌，溶藻弧菌，哈维氏弧菌和欧文氏弧菌的最低抑菌浓度(MIC)。将菌株SH098发酵提取物配置为1.3mg/mL的样品溶液，选用96孔板，每行第一孔均加入160μLLB液体培养基和40μL待测样品溶液，其余孔加入100μL液体培养基。采用二倍稀释法依次稀释，最后每孔加入100μL病原菌菌液。放入恒温培养箱28℃培养24～48h后观察记录。结果如下表2所示。
表2菌株SH098发酵提取物的最低抑菌浓度测定(MIC值)
Figure BDA0003690331580000071
从表2数据可以看出，菌株SH098发酵提取物对哈维氏弧菌的抗菌活性最强，其最低抑菌浓度低于阳性对照药，表明它的活性要强于阳性药物。由于哈维氏弧菌病害严重影响石斑鱼、南美白对虾等海水水产养殖产业，因此该菌在制备海水水产养殖动物健康饲料、抗菌药剂以及水产养殖水体改良用微生态制剂上具有重要潜力和应用前景。此外菌株SH098发酵提取物对另外两株革兰氏阴性菌株(溶藻弧菌和欧文氏弧菌)的最低抑菌浓度是阳性对照药的两倍，其活性弱于阳性对照药物，但差别不大。菌株SH098发酵提取物对两种链球菌均有抗菌活性，其中对无乳链球菌的抗菌活性最强，并且对两种链球菌的抗菌活性与阳性对照药物的活性相当。虽然该结果显示该发酵提取物对部分菌株的活性弱于阳性对照，但随着实际生产中相关病原菌对卡那霉素和其他药物的抗药性越来越强，水产养殖动物病害的防治越来越困难，利用独特的新菌株资源研发新抗菌药剂为水产养殖产业的绿色健康发展提供了新机遇。
实施例5菌株SH098发酵提取物抗菌活性的光稳定性
用DMSO溶剂将SH098发酵提取物制成10mg/mL的待测样品，置于紫外灯下照射0h，1h，3h，5h，10h，24h，48h，时间达到后取出放进冰箱-20℃保存，直至7组全部照射完毕后进行活性测试。
以无乳链球菌为测试菌，取0.5mL菌悬液与15mL冷却至55℃的LB培养基倾注于无菌培养皿中充分混合，制备带菌平板。待平板凝固后，用100μL的灭菌枪头在带菌平板上打3个孔，用移液枪分别滴加20μL的待测样品、20μL阳性对照卡那霉素(10mg/mL)和20μL阴性对照DMSO，每个处理3个重复。恒温培养箱中28℃培养12h，采用十字交叉法测量透明抑菌圈直径，求出菌株对病原细菌的抑菌圈大小。抑菌效果如图4所示，结果如下表3所示。
表3不同时间的紫外处理后的菌株SH098发酵提取物对无乳链球菌的抑制效果
Figure BDA0003690331580000081
从表3和图4可以看出，不同紫外处理时间后的菌株SH098发酵提取物和阳性对照药卡那霉素对无乳链球菌的活性均随着紫外照射时间的增加而降低，紫外照射24h内的影响不明显，说明SH098发酵提取物的抗菌活性比较稳定。但连续照射48h后，发酵提取物的抗菌活性明显下降，但仍然强于阳性对照药物的活性。因此该发酵提取物对无乳链球菌病菌的活性具有较好的光稳定性，在室外用于微生态制剂治理水产养殖水体和防治水产养殖动物病原细菌病害中可发挥稳定防效。
需要指出的是，上述实施例仅是对本发明的进一步说明，而不是限制，本领域技术人员在与本发明技术方案的相当的含义和范围内的任何调整或改变，都应认为是包括在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所
<120> 一株珊瑚来源的共生盐孢菌SH098及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1416
<212> DNA
<213> 盐孢菌(Salinispora sp.)
<400> 1
cggggggggg tcttaccatg caagtcgagc ggaaggccct tcggggtact cgagcggcga 60
acgggtgagt aacacgtgag taacctgccc caggctttgg gataaccccg ggaaaccggg 120
gctaataccg gatatgacca tctgtcgcat ggtgggtggt ggaaagattt tttggcttgg 180
gatgggctcg cggcctatca gcttgttggt ggggtgatgg cctaccaagg cggcgacggg 240
tagccggcct gagagggcga ccggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg 300
ggaggcagca gtggggaatc ttgcacaatg ggcggaagcc tgatgcagcg acgccgcgtg 360
agggatgacg gccttcgggt tgtaaacctc tttcagcagg gacgaagcgt ttgtgacggt 420
acctgcagaa gaagcgccgg ccaactacgt gccagcagcc gcggtaagac gtagggcgca 480
agcgttgtcc ggatttattg ggcgtaaaga gctcgtaggc ggcttgtcgc gtcgactgtg 540
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gagactggaa ttcctggtgt agcggtgaaa tgcgcagata tcaggaggaa caccggtggc 660
gaaggcgggt ctctgggccg atactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg 720
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ggttctctgt gccgcagcta acgcattaag cgccccgcct ggggagtacg gccgcaaggc 840
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tccttcgggg ccggtgacag gtggtgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg 1020
ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg ttcgatgttg ccagcgcgtt atggcgggga 1080
ctcatcgaag actgccgggg tcaactcgga ggaaggtggg gatgacgtca agtcatcatg 1140
ccccttatgt ccagggcttc acgcatgcta caatggccgg tacagtgggc tgcgataccg 1200
tgaggtggag cgaatcccaa aaagccggtc tcagttcgga tcggggtctg caactcgacc 1260
ccgtgaagtc ggagtcgcta gtaatcgcag atcagcaacg ctgcggtgaa tacgttcccg 1320
ggccttgtac acaccgcccg tcacgtcacg aaagtcggca acacccgaag ccggtggcct 1380
aacccttgtg gggggagccg tcgaagttgg gccccg 1416

Claims (4)

1.一株珊瑚来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)SH098，其特征是：其保藏编号为GDMCC No：62381，保藏日期为2022年04月14日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所。
2.一种防治水产病原细菌的生防制品，其特征是：包括权利要求1中所述珊瑚来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)SH098和/或权利要求1中所述珊瑚来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)SH098的发酵提取物；发酵提取物是将所述珊瑚来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)SH098的发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取，反复萃取3遍，合并3次乙酸乙酯萃取液，并在50℃下将其减压浓缩至干品得到。
3.权利要求1所述的珊瑚来源的共生盐孢菌(Salinispora sp.)SH098或权利要求2所述的生防制品在制备具有防治水产病原细菌效果的药物方面的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征是：所述水产病原细菌包括溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)、欧文氏弧菌(Vibrioowensii)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)中的一种或几种。
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