CN116656579B - 一株海洋产酶细菌新种菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株海洋产酶细菌新种菌株，所述新种菌株为菌株24931，所述菌株24931的分类学名称为Bacillus sp.，保藏编号为GDMCC NO：63580，保藏日期为2023年06月21日。还公开了含有菌株24931或所述菌株24931的发酵物的海水鱼养殖饲料添加剂，以及所述菌株24931在制备海水鱼养殖饲料添加剂中的应用或所述饲料添加剂在制备海水鱼养殖饲料中的应用。该菌株24931具有产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和褐藻胶降解酶能力。含有菌株24931或菌株24931发酵物的饲料添加剂对海水鱼生长具有促进作用。
Description
技术领域
本发明属于海洋微生物技术领域，具体涉及一株海洋产酶细菌新种菌株及其应用。
背景技术
众所周知，我国是世界第一大渔业生产国，水产养殖业是我国渔业的顶梁柱，随着经济的快速发展和生活水平的提高，人们对水产品的需求量日益增加，促进我国水产养殖规模不断扩大，水产养殖已经成为我国主要的食品供给来源之一。益生菌因其独特的生理功能，无抗且安全，不仅克服抗生素和其他药物的负面影响及其局限性，而且提高产量，益生菌已成为水产养殖中抗生素、化学药物的替代物，给养殖业带来重大利益，因此，近年来益生菌在水产养殖中被广泛应用。
根据世界卫生组织目前所采用的定义：益生菌是活的微生物，足够数量的益生菌有利于宿主的健康。益生菌在水产养殖业的应用前景较其他农业生产更为广泛。从商业角度来说，益生菌（单一菌种或混合菌种）都可以用于水产养殖生产活动中，且市场前景非常广泛。研究表明，益生菌在促进水产动物生长、增强机体免疫力和抗病力、拮抗致病菌、提高饲料转化率和改善水质等方面均有显著效果。益生菌自身代谢产生大量营养物质可直接被水产动物吸收和利用，促进水产动物生长；益生菌能够产生水产动物代谢所需的酶类，促其有效消化和吸收饲料中的营养物质，提高饲料利用率。例如，芽孢杆菌作为营养性添加剂投放于水产养殖，可产生多种有机酸、消化酶类及其他营养物质，能够参与水生动物机体的新陈代谢。此外，益生菌在生长繁殖中可分泌多种抑菌物质，抑制病原菌的生长和外来病原菌的入侵，维持动物肠道的微生态平衡；益生菌还能够通过提高水产养殖动物的免疫力，增强其对病原微生物的抵抗能力，加强水生动物机体免疫力和抗病力，有效减少疾病的发生。益生菌为人和鱼类在提高健康管理策略上开辟了一个新的领域，益生菌的应用为水产养殖业健康可持续发展提供了新的途径。
红树林生境特殊，具有高湿度、高盐度、强还原性、强酸性、营养成分丰富等特点，因此微生物具有极高的多样性和独特性，蕴藏着丰富的微生物资源。
因此，本发明拟从红树林沉积物中分离筛选具有多种高产酶活性的可用于水产饲料添加剂的海洋细菌，将为水产养殖益生菌剂开发提供新的菌种资源。
发明内容
本发明的目的在于提供一株海洋产酶细菌新种菌株及包括所述海洋产酶细菌新种菌株的海水鱼养殖饲料添加剂，该海洋产酶细菌新种菌株及含有该菌株的添加剂具有产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和褐藻胶降解酶能力。
本发明的目的还在于提供上述海洋产酶细菌新种菌株在制备海水鱼养殖饲料添加剂中的应用以及含有所述海洋产酶细菌新种菌株的添加剂在制备海水鱼养殖饲料中的应用，含有海洋产酶细菌新种菌株的饲料添加剂对海水鱼生长具有促进作用。
本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一株海洋产酶细菌新种菌株，所述新种菌株为菌株24931，所述菌株24931的分类学名称为Bacillus sp.，保藏编号为GDMCC NO：63580，保藏日期为2023年06月21日。
所述菌株24931的保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心（简称GDMCC），保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院实验大楼5楼，广东省科学院微生物研究所。
菌株24931属于Bacillaceae科Bacillus属新种，名称为Bacillus sp. 24931。
本发明所述菌株24931具有产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和褐藻胶降解酶能力。
本申请发明人通过实验证实本发明的菌株24931具有产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、褐藻胶降解酶的能力，因此可以将其用于海水鱼养殖饲料添加剂，具有广泛的应用前景。
因此，本发明还提供了一种海水鱼养殖饲料添加剂，含有所述菌株24931或所述菌株24931的发酵物。
本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：上述海洋产酶细菌新种菌株在制备海水鱼养殖饲料添加剂中的应用。
本发明可以将菌株24931或其发酵物作为唯一活性成分或与其它菌株合用，制成含有菌株24931的水产养殖益生菌剂。
本发明还进一步提供了上述饲料添加剂在制备海水鱼养殖饲料中的应用。
本发明进一步通过实验证实了含有菌株24931或菌株24931发酵物的饲料添加剂对海水鱼生长具有促进作用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
（1）本发明中的菌株24931具有产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、褐藻胶降解酶的多酶活能力，将其用于海水鱼养殖饲料添加剂，具有广泛的应用前景；
（2）本发明中的含有菌株24931和/或菌株24931发酵物的饲料添加剂对海水鱼生长具有促进作用。
附图说明
图1为实施例2中温度对产酶菌株蛋白酶活力的影响；
图2为实施例2中温度对产酶菌株淀粉酶活力的影响；
图3为实施例2中温度对产酶菌株脂肪酶活力的影响；
图4为实施例2中温度对产酶菌株纤维素酶活力的影响；
图5为实施例2中温度对产酶菌株褐藻胶降解酶活力的影响；
图6为实施例3中菌株对石斑鱼增重率的影响；
图7为实施例3中菌株对石斑鱼饲料效率的影响。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买获得的常规产品。
实施例1
1、细菌的分离与培养
从海南八门湾红树林取5~30 cm深的黑褐色泥质土壤样品。土壤在室温下自然风干，然后研磨成粉末。将5 g沉淀物粉末悬浮在10 mL林格氏液中，并将水加热至55℃。将沉淀物悬浮液在28℃摇床(180 r/min转速)摇动30 min。利用稀释涂布平板法，将土壤悬浮液涂布在琼脂分离培养基上分离菌株。
分离培养基为海水麦芽汁营养琼脂培养基和腐殖酸培养基，将平板置于28℃恒温培养箱中倒置培养2~4天，挑取符合条件的单菌落划线于2216E培养基（海博生物，货号HB0132）上直至菌株纯化。
其中海水麦芽汁营养琼脂培养基包括：
蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，麦芽汁 10 g，75%陈海水1000 mL，琼脂15~20 g，pH 7.2，将海水麦芽汁琼脂培养基与海水营养琼脂培养基分别灭菌，待冷却至55 ℃时将两种培养基以1:1的比例混合倒板。
腐殖酸培养基包括：
腐植酸 1.0 g，Na2HPO40.5 g， KCl 1.7 g，MgSO4·7H2O0.5 g，FeSO4.7H2O 0.01g，CaCl20.02 g，硫胺素 0.5 mg，核黄素0.5 mg，肌醇0.5 mg，泛酸0.5 mg，对氨基苯酸0.5mg，生物素0.25 mg，维生素B6 0.5 mg，烟酸0.5 mg，琼脂15 g, 75%海水1000 mL，pH7.2，其中腐殖酸使用1%稀盐酸煮沸 10 min过滤。
2、产酶菌株的筛选
将纯化的菌株制备菌悬液，用0.85%的灭菌的生理盐水将其稀释至10-8并震荡混匀。取50 μL菌悬液均匀涂布于各消化酶筛选培养基上，每个样品三个平行平板。平板倒置于28℃恒温培养箱中。
蛋白酶筛选培养基：干酪素 8.0 g，Na2HPO42.0 g，MgSO40.5 g, NaCl5.0 g, 牛肉浸出粉3.0 g，琼脂粉 15 g，0.4%溴麝香草酚蓝溶液 12.5 mL，75%陈海水1000 mL，pH 7.4。培养24 h后看是否有透明菌圈产生。产酶多少以透明圈直径比菌圈直径，即R/r（R表示透明圈，r表示菌圈）。下同。
淀粉酶筛选培养基：淀粉 20 g，酵母浸出粉5.0 g, 胰酪蛋白胨10 g，MgSO40.1g，Na2HPO45.0 g ，NaCl 5.0 g，琼脂 20 g ，75%陈海水1000 mL，pH7.0~7.4。培养24 h后，加入碘液，看是否有透明圈产生。碘液：I20.5 g，KI 5.0 g，定容至100 mL，取1 mL再定容至100 mL。
脂肪酶筛选培养基：橄榄油 25 mL，牛肉浸出粉5.0 g，胰酪蛋白胨 10 g，葡萄糖3.0 g，PVA 10 g，NaCl 5.0 g，吐温80 5 mL，K2HPO41.0 g，MgSO40.5 g，琼脂15 g，中性红0.05 g，75%陈海水 1000 mL，pH 7.5。培养24 h后观察菌圈附近是否有橙黄色变为紫红色。
纤维素酶筛选培养基：NaCl 5 g，MgSO40.5 g，CaCl20.1g，KH2PO40.5 g，K2HPO42.0g，羧甲基纤维素钠 15 g， (NH4)2SO42.0 g，酵母浸出粉 1.0 g，胰酪蛋白胨 5.0 g，75%陈海水 1000 mL，琼脂粉 15 g，pH 7.0，培养24 h后加入0.5%刚果红染色50 min，而后倒掉刚果红，用5%NaCl浸泡1h，1 h后弃去NaCl观察是否有透明圈产生。
褐藻胶降解酶筛选培养基：海藻酸钠5.0 g，酵母浸粉1.0 g，蛋白胨5.0 g，琼脂20.0 g，75%陈海水 1000 mL，pH7.0~7.4。
一共筛选到11株可产酶菌株，其中82%产蛋白酶，55%产淀粉酶，18%产脂肪酶，27%产纤维素酶，18%产褐藻胶降解酶（表1）。其中产四种酶的菌有1株，产三种酶的菌有1株，产2种酶的菌株有6株，产1种酶的菌株有3株。
表1分离到的产酶菌株
3、产酶菌株鉴定
取2μL菌液于1.5 mL的离心管中，添加30 μL无菌水，混匀后快速离心，防止液体挂壁，将离心管置于100 ℃金属浴中孵育10 min。12000 rpm离心1 min，取2 μL上清作为模板DNA对待测菌株16S rRNA进行扩增测序。纯化菌株的16S rDNA序列使用细菌通用引物PCR扩增，引物为27f (5′-AGAGTTTGAT CMTGCCTCAG-3′) 和1492r (5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)，16S rDNA序列提交至EzBioCloud (http://www.ezbiocloud.net/)进行系统发育相似性比对。
将菌株24931和菌株20830的16S rRNA的基因序列在NCBI GenBank数据库中进行BLAST分析。结果分析表明，菌株24931和菌株20830分别与菌株Bacillus pseudomycoidesDSM 12442T和MicrobacteriumthalassiumIFO 16060T亲缘关系最近，16SrDNA同源性为98.36%和99.85%。
由于菌株24931可同时产4种酶，并且作为饲料添加剂对提高石斑鱼生长性能更显著；其与模式菌株的相似性小于98.5%（基于16S rDNA序列的新种界定标准），基于以上结果，对菌株24931进一步做生理生化测定。
菌株24931在API 20 NE（Biomerieux，货号20050）)的12种碳源中，D-葡萄糖、麦芽糖、葡萄糖酸盐、N-乙酰-葡萄糖胺、柠檬酸、甘露醇可以被利用，但L-阿拉伯糖、D-甘露糖、葵酸、己二酸、苹果酸和苯乙酸不能被利用，产生细胞色素氧化酶、β-葡萄糖甙酶、β-半乳糖甙酶、色氨酸水解酶、精氨酸双水解酶、脲酶和蛋白酶，无硝酸盐还原酶活性，具体见表2。不能降解明胶，不产H2S和黑色素。
在2216E培养基上检测菌株生长pH（4–12，增量为1个单位）范围，以及对NaCl的耐受性（在0–12%，增量为1%（w/v））。结果表明菌株适宜生长的pH为4-9，NaCl浓度生长适应范围为0.5%-4%。
表2菌株24931的生理生化特征
结合表2中的生理生化实验结果进一步表明，菌株24931属于Bacillus属的一个具有产酶活性的新种，命名为Bacillus multienzymei（保藏证明上的Bacillus sp.是保藏中心建议的与本申请比较接近的暂时的分类命名）。
所得菌株24931于2023年6月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（简称GDMCC），保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院实验大楼5楼，保藏编号为GDMCC NO：63580。
实施例2
温度对产酶菌株酶活性的影响
按照每隔3℃设置温度梯度，温度分别为25℃、28℃、31℃、34℃、37℃和40℃。按照2 %（体积百分含量）的接种量将实施例1中的菌株24931以及菌株20830接种于盛有100 mL培养基的250 mL锥形瓶中，180 r/min摇床培养48 h。取一定量的培养液，5000 r/min离心10 min，收集上清液用于测定酶活力。
测定酶活力所用发酵培养基配制如下：
蛋白酶发酵培养基：蛋白胨5 g；牛肉膏 5g；酵母膏3 g；MgSO4·7H2O 0.5 g；KH2PO41 g；NaCl 5 g；75%陈海水1000 mL；pH为7.0~7.2。
淀粉酶培养基：淀粉 20 g，蛋白胨10 g，MgSO40.5 g，K2HPO41.0 g， NaCl 5.0 g，75%陈海水1000 mL，pH7.0~7.4。
脂肪酶发酵培养基：蛋白胨4.0%，葡萄糖0.5%，MgSO4·7H2O 0.1 g，(NH4)2SO40.1g，KH2PO40.1 g，橄榄油乳化液4 mL，75%陈海水1000 mL，pH为7.0。
淀粉酶发酵培养基：蛋白胨10 g，可溶性淀粉20 g，MgSO40.5 g，K2HPO41 g，FeSO40.05 g，CaCl20.5 g，NaCl 5 g，蒸馏水1000 mL，pH为自然值。
纤维素酶发酵培养基：蛋白胨 10 g，羧甲基纤维素钠10 g，酵母粉10 g，KH2PO41g，NaCl 5 g，水1000 mL，pH为自然值。
褐藻胶降解酶培养基：海藻酸钠5.0 g，酵母浸粉1.0 g，蛋白胨5.0 g，75%陈海水1000 mL，pH7.0~7.4。
蛋白酶活力采用福林酚法测定。蛋白酶单位定义：pH 7.2，40℃条件下，每分钟产生1 μg酪氨酸所需要的酶量为一个酶活力单位，以U/mL表示。
淀粉酶的活力大小采用淀粉酶试剂盒（上海酶联）测定，具体方法参见说明书。淀粉酶活力单位定义：100 mL酶液，在37℃于底物作用30 min，水解10mg淀粉为一个酶活力单位，以U/mL表示。
纤维素酶活力大小采用DNS法测定。纤维素酶活力定义：50℃条件下，每分钟水解CMC产生相当于1 μg葡萄糖所需的酶量，作为一个酶活力单位，以U/mL表示。
脂肪酶活力采用脂肪酶试剂盒（上海酶联）测定。具体方法参见说明书。脂肪酶单位定义：37℃条件下，在反应体系中与底物反应1分钟，每消耗1 μmol底物为一个酶活力单位，以U/mL表示。
褐藻胶裂解酶的酶活力测定采用３,５-二硝基水杨酸（DNS）法测定。取50 μL上清液与50 μL底物溶液（1%褐藻胶溶液），于35℃水浴中30 min后迅速加入150 μL DNS溶液，混合均匀后置于沸水中煮沸5min。取150 μL混合液在540 nm下测定吸光度。根据葡萄糖标准曲线计算还原糖的含量并计算出酶活。酶活力定义单位（U）：每分钟释放1μg还原糖所需的酶量为一个酶活力单位（U）。
温度对产酶菌株不同酶活力的影响如图1-5所示：
菌株24931蛋白酶活力在各温度梯度下均高于菌株20830，在37℃时，酶活力最高86.26±1.27 U/mL。
对于淀粉酶活性，菌株24931淀粉酶活力低于菌株20830，酶活力随温度升高而升高，在37℃时，酶活力达到最高（69.73±5.33 U/mL）。
对于菌株24931脂肪酶活力随温度升高先上升后降低，在31℃时，酶活力达到最高（161.33±5.03U/mL）。
对于菌株20830纤维素酶活力在31℃时达到最高（8.63±0.47 U/mL）。
菌株24931褐藻胶降解酶活力在28℃时，酶活力最高（55.53±3.31 U/mL）。
实施例3
产酶菌作为饲料添加剂对石斑鱼生长性能的影响评价
将菌株24931和20830在2216E培养基中进行发酵培养，各发酵10升，发酵3天后，5000 r/min心10 min收集菌体。用1L无菌水配置菌悬液溶液，喷洒在5千克商品饲料（福州海马饲料有限公司）上，边喷洒边搅拌，自然风干。
制备的四种饲料分别为：喷洒无菌水的对照组饲料、含菌株24931菌剂饲料、含菌株20830菌剂饲料，含菌株24931菌剂和菌株20830菌剂（菌数比为1:1）饲料，储存于４℃冰箱中用于实验，每隔两周制备一次饲料。
选取珍珠龙胆石斑鱼，在实验室水族箱内进行养殖。每天投喂2次，分别在早上8点和下午5点，日投喂量为体重的2％。
将珍珠龙胆石斑鱼随机分成四组（1组对照组和3组实验组），每组设三个平行，每个平行20尾鱼。在实验开始和结束（４周）时，对各组石斑鱼称重，按照如下公式计算其增重率和饲料效率。
增重率（％）＝（终体重－初体重）／初体重×100%；
饲料效率（％）＝（终体重－初体重）／消耗饲料重量×100%。
养殖实验结束后，三个实验组和对照组石斑鱼的增重率和饲料效率如图6-7所示。
结果表明：
从增重量和饲料效率来看，投喂含菌株24931菌剂饲料、含菌株20830菌剂饲料以及含菌株24931菌剂和菌株20830菌剂的饲料与对照组之间都有显著差异，其中，投喂含菌株24931菌剂饲料的实验组的增重量和饲料效率最高，与对照组相比，分别提高31.73%和14.33%。
投喂含菌株24931菌剂饲料的实验组，增重率与含菌株20830菌剂饲料实验组之间无显著差异，但是与含菌株24931菌剂和菌株20830菌剂的饲料之间有显著差异。
但是，从饲料效率来看，含菌株24931菌剂的饲料效率最高，与含菌株20830菌剂饲料以及含菌株24931菌剂和菌株20830菌剂的饲料之间皆有显著差异。
需要指出的是，上述实施例仅是对本发明的进一步说明，而不是限制，本领域技术人员在与本发明技术方案的相当的含义和范围内的任何调整或改变，都应认为是包括在本发明的保护范围内。
Claims (6)
1.一株海洋产酶细菌新种菌株，其特征是：所述新种菌株为菌株24931，所述菌株24931的分类学名称为Bacillus sp.，保藏编号为GDMCC NO：63580，保藏日期为2023年06月21日。
2.根据权利要求1所述的海洋产酶细菌新种菌株，其特征是：所述菌株24931具有产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和褐藻胶降解酶能力。
3.一种海水鱼养殖饲料添加剂，其特征是：含有权利要求1所述菌株24931。
4.权利要求1或2所述海洋产酶细菌新种菌株在制备海水鱼养殖饲料添加剂中的应用，所述海水鱼为石斑鱼。
5.权利要求3所述饲料添加剂在制备海水鱼养殖饲料中的应用，所述海水鱼为石斑鱼。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征是：含有菌株24931的饲料添加剂对海水鱼生长具有促进作用。
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