CN105192308A

CN105192308A - 一种提高银鲳幼鱼生长性能的微生态制剂及其应用

Info

Publication number: CN105192308A
Application number: CN201510581448.1A
Authority: CN
Inventors: 高权新; 施兆鸿; 彭士明; 张晨捷
Original assignee: East China Sea Fishery Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: East China Sea Fishery Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2015-09-14
Filing date: 2015-09-14
Publication date: 2015-12-30

Abstract

本发明涉及一种适用于银鲳幼鱼的微生态制剂及其应用，属于海水鱼类饲料添加剂应用技术。本发明的目的是选择一种适用于银鲳幼鱼的益生菌，从而提高银鲳幼鱼的生长性能。本发明通过对比、分析枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、丁酸梭菌的安全性和益生功能，发现枯草芽孢杆菌对银鲳幼鱼没有任何危害，且具有最佳的益生效果。枯草芽孢杆菌显著提高了银鲳幼鱼的生长性能和免疫功能，所以本发明推荐其在银鲳的人工养殖中使用。

Description

一种提高银鲳幼鱼生长性能的微生态制剂及其应用

技术领域

本发明涉及一种提高银鲳幼鱼生长性能的微生态制剂及其应用，属于海水鱼类规模化养殖技术，特别是鲳属鱼类人工养殖技术。

背景技术

益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，其能够定植于肠道内，可通过改善肠道微生态平衡而发挥强大的益生作用。迄今为止，益生菌已在医药保健、食品、饲料、水产及畜禽养殖等领域广为应用。在水产养殖领域，益生菌能够提高水生鱼类的产量，降低生产成本，减少疾病的发生，治疗肠道炎症，从而提高经济效益，所以得到了普遍的认可。在国内，众多专家学者陆续开展了对鱼类益生菌的筛选、特性鉴定、应用及机理研究，并取得了丰硕的成果，这对益生菌在国内的推广应用提供了重要的理论基础和技术指导。

具备益生特性的细菌可用于制备新型、有效、安全的微生态制剂，但是这些细菌必须具备某些特性，这些特性包括：对寄主没有任何危害；易被寄主“接纳”，通过动物采食进入肠道内，与寄主建立“互利共生”的关系；能够到达肠道特定的位点，并发挥有效的益生作用；不具有抗毒基因。益生菌的选择是非常重要的，因为不合适的“益生菌”会在动物的肠道内对寄主造成意想不到的损害，所以大量使用前，首先需要对选择使用的益生菌的安全性和危害进行分析和坚定。作为益生菌，不管源于何地，都必须在动物的肠道内定植，这是首要条件。现在大部分用于水产养殖中的益生菌，最初是用于陆生动物养殖的。许多商用的益生菌在水产养殖方面的益生效果较差，可能是由于这些益生菌不是源于水生动物或者不适应水生动物的肠道，在肠道内不能维持菌群的规模所致。此外，由于鱼类种类繁多，其生理结构、机能以及生活的环境皆存在着较大的差异，所以不同的鱼类往往需要不同的益生菌。所以为鱼类选择一种合适的益生菌，需要对鱼类益生菌的安全性和益生特性展开探索。

目前，益生菌在海水、淡水鱼类养殖中的应用已较为广泛，例如专利号为CN200710057106.5，公开号为CN101054550A的中国专利申请促进淡水鱼生长发育的益生菌组合物，公开了一种促进淡水鱼生长的益生菌组合物，其特征是：含有益生菌组合物及载体，载体为沸石粉与寡糖的混合物，益生菌组合物包含有效成分按重量份数计：酵母菌1-10份、枯草芽孢杆菌1-8份、乳酸杆菌1-6份，将上述益生菌与载体均匀混合，其配比为1∶1。由于海水鱼类与淡水鱼类在生理结构、肠道微生态结构等方面存在着较大的差异，所以这种益生菌组合可能不适合海水鱼类。目前尚未见到益生菌在银鲳养殖方面的报道。本实验重点针对银鲳展开探索，随机选取最常用的三种益生菌，旨在寻找一种适合银鲳的最佳益生菌。为银鲳选择一种合适的益生菌，对于改善和丰富银鲳人工养殖技术具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种银鲳幼鱼的微生态制剂，能改善银鲳幼鱼的生长性能。

本发明的主要技术方案是，通过对比、分析枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、丁酸梭菌的安全性和益生功能，发现枯草芽孢杆菌对银鲳幼鱼没有任何危害，且具有最佳的益生效果。

一种银鲳幼鱼的微生态制剂，所述的微生态制剂为在银鲳饲料添加枯草芽孢杆菌，且枯草芽孢杆菌的浓度在1×10⁸CFUg^-1左右。

其制备方法按照下述步骤进行：1)首先将枯草芽孢杆菌(ACCC01170)放入MRS培养基，在无氧、37℃条件下培养36小时；2)将MRS培养基3000转离心5分钟，弃上清，用无菌水进行洗涤，然后再次离心，使用无菌水进行重悬，使细菌的浓度在1×10¹⁰CFUml^-1左右，得枯草芽孢杆菌溶液；3)将枯草芽孢杆菌溶液轻轻的喷洒到银鲳饲料中，搅拌、混匀，使银鲳饲料中枯草芽孢杆菌的浓度在1×10⁸CFUg^-1左右，得到银鲳幼鱼的微生态制剂。

银鲳幼鱼是指外形与成鱼无异，只是个体尚未达到成鱼规格。本实验选用的银鲳幼鱼体重4.84±1.05g。

其中步骤2所述的MRS培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵[(NH4)2HC6H5O7]2.0g，葡萄糖(C6H12O6·H2O)20.0g，吐温801.0mL，乙酸钠(CH3COONa·3H2O)5.0g，磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)2.0g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.58g，硫酸锰(MnSO4·H2O)0.25g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，pH6.2～6.6。

其中步骤3所述的银鲳幼鱼饲料购自日本林兼产业株式会社，鱼宝6号料。

本发明的另一目的在于提供上述银鲳幼鱼的微生态制剂银鲳幼鱼饲养中的应用，具体步骤如下：

将含有枯草芽孢杆菌的银鲳饲料加无菌水润湿，再加入粘合剂(α淀粉等)搅拌(粘合剂与含有枯草芽孢杆菌的银鲳饲料的质量比为1：10)，而后将鱼类饲料涂抹于银鲳饲料台(一种银鲳饲料台，专利号：201020033157.1，公开号：201591072U)上面，最后将涂有饲料的饲料台放入水体中，供银鲳幼鱼采食。

所述含有枯草芽孢杆菌的银鲳饲料具体的喂养方式为：分别在上午(08:30-09:30)和下午(14:00-15:00)，分两次进行喂食，每天喂食时间共2小时；根据剩料量调整喂食量，收集剩料，并晾干，并估算银鲳幼鱼的采食量(饲喂量-剩料量)；每天换水三分之一；温度控制在19±3℃，盐度千分之28-30、pH7.4-7.9，溶解氧保持在5mg/L以上；每天捞出死鱼；实验为期60天。

有益效果

用枯草芽孢杆菌作为益生菌制备的微生态制剂可以显著的提高银鲳幼鱼的增重、特定生长率，并能够显著的降低料重比。

附图说明

图1益生菌对银鲳幼鱼血清溶菌酶、SOD活力、IgM含量以及肠道食糜内蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活力的影响。其中A：血清溶菌酶；B：SOD(超氧化物歧化酶)；C：IgM(免疫球蛋白M)；D：蛋白酶；E：脂肪酶；F：淀粉酶。

具体实施方式

下面通过实施例详细叙述本发明的技术内容。

实施例

1、本实施例主要是选取益生菌效果最佳的益生菌。选用目前常用的益生菌(枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌、植物乳杆菌)，首先观察这些益生菌对银鲳幼鱼有无危害，并通过对比分析这些益生菌对银鲳幼鱼生长性能的影响，找出益生效果最佳的益生菌。

2、本实验共分为4个组：枯草芽孢杆菌组，丁酸梭菌组，植物乳杆菌组，对照组。每个组3个重复。使用1.5m³的圆形水桶，每个水桶放入20尾银鲳幼鱼。共使用12个水桶，240尾银鲳幼鱼(4.84±1.05g)，随机分为4个组。

3、首先将益生菌(枯草芽孢杆菌，丁酸梭菌，植物乳杆菌)分别放入MRS培养基，在无氧、37℃条件下培养36小时；将MRS培养基3000转离心5分钟，弃上清，用无菌水进行洗涤，然后再次离心，使用无菌水进行重悬，使益生菌的浓度在1×10¹⁰CFUml^-1左右；将益生菌溶液轻轻的喷洒到银鲳饲料中，搅拌、混匀，使银鲳饲料(银鲳幼鱼饲料购自日本林兼产业株式会社，即鱼宝6号料)中益生菌的浓度在1×10⁸CFUg^-1左右；将含有益生菌的银鲳饲料加无菌水润湿，再加入粘合剂(α淀粉等)(粘合剂与含有枯草芽孢杆菌的银鲳饲料的质量比为1：10)搅拌，而后将鱼类饲料涂抹于银鲳饲料台(一种银鲳饲料台，专利号：201020033157.1，公开号：201591072U)上面，最后将涂有饲料的喂料筐放入水体中，供银鲳幼鱼采食。

对照组处理：将不含有益生菌的银鲳饲料(与上述含有益生菌的银鲳饲料同等重量)加无菌水润湿，再加入粘合剂(α淀粉等)(添加量与上述含有益生菌的银鲳饲料中粘合剂的添加量相同)搅拌，而后将鱼类饲料涂抹于喂料筐上面，最后将涂有饲料的喂料筐放入水体中，供银鲳幼鱼采食。

4、本实验为期60天。分别在上午(08:30-09:30)和下午(14:00-15:00)，分两次进行喂食，每天喂食时间共2小时。根据剩料量调整喂食量，收集剩料，并晾干，估算银鲳幼鱼的采食量(饲喂量-剩料量)。每天换水三分之一。温度控制在19±3℃，盐度千分之28-30、pH7.4-7.9，溶解氧保持在5mg/L以上。每天捞出死鱼，并记录，最后统计成活率。

5、本实验在30天、60天进行采样。每个水桶随机选取3尾鱼进行采样。采样前，对鱼进行麻醉。首先称重，然后采集血样，并收集肠中段。收集的血样在室温放置30分钟，而后5000转离心10分钟，取上清，-70℃保存。测定血清中溶菌酶、超氧化物歧化酶(SOD)的活力，并分析免疫球蛋白M(IgM)的含量。测定、分析中肠段食糜中的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活力。

注：以上试剂盒皆购自南京建成生物工程研究所。

溶菌酶活力：溶菌酶检测试剂盒(比浊法)，货号：A050-1。

SOD活力：南京建成生物工程研究所的SOD测试盒(羟胺法)，货号：A001-1。

IgM含量：免疫球蛋白IgM测定试剂盒(免疫比浊法)，货号：E025。

蛋白酶活力：蛋白酶测定试剂盒(紫外比色法)，货号：A080-2。

脂肪酶活力：脂肪酶(LPS)测定试剂盒(比色法)，货号：A054。

淀粉酶活力：淀粉酶(AMS)测试盒(淀粉-碘比色法)，货号：C016-1。

上述指标测定方法按照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书进行。

6、通过为期60天的实验，研究发现选用的益生菌(枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌、植物乳杆菌)对银鲳幼鱼都没有危害；表1中可以看出，与对照组相比，本实验选用的益生菌都提高了银鲳幼鱼的生长性能(末重(实验结束时体重)、增重(实验结束时体重-实验开始时体重)、特定生长率(100×(ln(实验末体质量)-ln(实验初体质量))/实验天数)、料重比(采食量/增重))。这些益生菌还可以提高血清溶菌酶、SOD的活力，增加IgM的含量，提高肠道食糜内蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活力(如图1)。综合分析实验结果发现，枯草芽孢杆菌的益生效果优于丁酸梭菌和植物乳杆菌，所以枯草芽孢杆菌被推荐应用于银鲳养殖。

表1益生菌对银鲳幼鱼末重、增重、特定生长率、料重比和成活率的影响

注：同一行中数据中具有不同字母的表示差异显著(p<0.05)。

Claims

1.一种银鲳幼鱼的微生态制剂，其特征在于，所述的微生态制剂为在银鲳饲料添加枯草芽孢杆菌，且枯草芽孢杆菌的浓度在1×10⁸CFUg^-1。

2.权利要求1所述的一种银鲳幼鱼的微生态制剂的制备方法，按照下述步骤进行：

A.首先将枯草芽孢杆菌ACCC01170放入MRS培养基，在无氧、37℃条件下培养36小时；

B.将MRS培养基3000转离心5分钟，弃上清，用无菌水进行洗涤，然后再次离心，使用无菌水进行重悬，使细菌的浓度在1×10¹⁰CFUml^-1左右，得枯草芽孢杆菌溶液；

C.将枯草芽孢杆菌溶液轻轻的喷洒到银鲳饲料中，搅拌、混匀，使银鲳饲料中枯草芽孢杆菌的浓度在1×10⁸CFUg^-1左右，得到银鲳幼鱼的微生态制剂。

3.根据权利要求2所述的一种银鲳幼鱼的微生态制剂的制备方法，其特征在于，其中步骤B所述的MRS培养基配方为：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，pH6.2～6.6。

4.根据权利要求2所述的一种银鲳幼鱼的微生态制剂的制备方法，其特征在于，其中步骤C所述的银鲳饲料购自日本林兼产业株式会社，鱼宝6号料。

5.权利要求1所述的一种银鲳幼鱼的微生态制剂在银鲳幼鱼饲养中的应用，具体步骤如下：

将含有枯草芽孢杆菌的银鲳饲料加无菌水润湿，再加入粘合剂搅拌，粘合剂与含有枯草芽孢杆菌的银鲳饲料的质量比为1：10，而后将鱼类饲料涂抹于银鲳饲料台上面，最后将涂有饲料的饲料台放入水体中，供银鲳幼鱼采食。

6.根据权利要求5所述的种银鲳幼鱼的微生态制剂在银鲳幼鱼饲养中的应用，其特征在于，所述的粘合剂为α淀粉。

7.根据权利要求5所述的种银鲳幼鱼的微生态制剂在银鲳幼鱼饲养中的应用，其特征在于，所述含有枯草芽孢杆菌的银鲳饲料具体的喂养方式为：分别在上午08:30-09:30和下午14:00-15:00，分两次进行喂食，每天喂食时间共2小时；根据剩料量调整喂食量，收集剩料，并晾干，并估算银鲳幼鱼的采食量；每天换水三分之一；温度控制在19±3℃，盐度千分之28-30、pH7.4-7.9，溶解氧保持在5mg/L以上；每天捞出死鱼；为期60天。