CN110358691B - 一株啤酒酵母及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物领域，具体涉及一株啤酒酵母及其应用，该菌命名为啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)190501，CCTCC NO：M 2019577；保藏地点为：中国，武汉，武汉大学；中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2019年07月24日，并提供了所述啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)190501在制备象草生物发酵料中的应用。本发明啤酒酵母相比出发菌具有高达耐铜600mg/L的铜浓度特性，且其作为象草生物发酵料，可以提高象草饲料中有机铜的含量，并且经过发酵后的象草生物饲料可替代部分基础日粮用于小猪喂养，可明显促进小猪的采食量，该象草生物发酵料喂养小猪，其料肉比为2.60。

Description

一株啤酒酵母及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株啤酒酵母及其应用。
背景技术
铜元素是动物生长必需的微量元素。铜是酶的必要组分和激活剂，是维持动物生命活动和生长发育的重要营养物质，在保证动物体健康生长和高效生产方面铜元素起着非常重要的作用。铜元素通常以无机盐的形式添加到饲料中，其中硫酸铜是使用最广泛的铜源添加剂。然在实际生产过程中，动物肠胃对进入动物体内的无机矿质元素吸收力比较低，为满足动物需求，无机铜往往添加过量，导致大量无机铜随粪便排出体外，粪便铜含量高，影响粪便的资源化应用，大量铜元素随粪便进入环境，造成环境污染。70年代末，美国首次研制出了稳定性和动物营养有效性显著优于无机盐的螯合型氨基酸矿物质盐，随后，我国也成功研制出了这类氨基酸螯合微量元素，并用于规模化生产。蛋白质铜，氨基酸螯合铜等有机态铜是其中的产品之一,但由于蛋白质铜，氨基酸螯合铜等有机形态的矿物质元素生产成本比较高，在实际生产中难以广泛使用。微生物可通过富集积累和生物作用，将无机态的矿质元素转化成便于动物吸收的形态，且成本比较低，是目前获得有机铜的优良形式。作为富集微量元素载体的微生物一般要求对人及动物无害的有益微生物，菌体本身除对微量元素有较强富集作用之外，其本身最好还富含有蛋白质，维生素等对动物有益的活性物质，在提供微量元素来源的同时还能够促进动物的营养吸收，增强动物的生长。酵母菌富含蛋白质、糖类、维生素和有益的活性物质，是能够直接添加到饲料中用于生产的菌种，且对铜具有一定的耐受能力，研究表明，酵母铜的生物利用率显著高于硫酸铜和乙酸铜，是富集铜的优良菌种。酵母铜可在为动物提供有机铜的同时丰富的营养元素，促进动物的生长，此外，酵母铜能更好的与其他饲料添加剂协同配合，避免饲料营养成分的流失，且酵母铜天然具有的芳香气味对动物胃肠无刺激作用，更有利于动物的生长。
随着畜牧业的不断发展，对饲料的要求也越来越高。新型饲料不仅要满足营养价值高的要求还要满足成本低，环境污染小的要求。生物发酵料是目前畜牧业可能同时满足高营养价值和低成本这一要求重要的研究方向之一。研究表明，将棉籽，豆粕，全价料，玉米秸秆，象草，果皮等经过微生物发酵后可用于畜禽养殖，在提高营养利用率的同时，降低营养成本。酵母菌是生物发酵的常用菌，以往添加是普通酵母菌，若添加富铜酵母菌，在满足生物发酵要求的同时还能提供有机铜，将会大大提高生物发酵料的营养价值和饲用价值。在实际生产中，南方生物发酵料的发酵及使用的条件通常为常温，偏酸，这种条件下的生物发酵料成本最低，使用范围最广。这就要求酵母菌在常温，偏酸的条件下仍具有富铜特性，但是目前适用的富铜酵母菌种较少，因此，本文主要探究常温，偏酸条件下，酵母对铜的富集的能力，寻找此条件下对铜具有高富集能力的酵母菌株，并通过驯化获得耐铜能力较高的菌株，为富铜生物发酵料的研发提供更多的选择性。
发明内容
本发明的目的是提供一株啤酒酵母及其应用。本发明人对酵母菌进行了大量充分的研究，通过本发明人的研究发现了一株具有耐铜能力达到600mg/L的啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)190501；并且通过本发明人研究发现，该菌株的最适繁殖富集菌体的环境，并为南方生物发酵料制备象草生物发酵料提供一条新的选择道路，应用在生物发酵料中提高象草饲料中有机铜的含量，且发酵后的象草生物饲料替代部分基础日粮用于小猪喂养，可明显促进小猪的采食量，使得小猪料肉比为2.60。
本发明的发明内容：
一株啤酒酵母，命名为啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)190501，CCTCC NO：M2019577；保藏地点为：中国，武汉，武汉大学；中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2019年07月24日。
如上所述的啤酒酵母的筛选方法，具体步骤如下：
S1.酵母菌种的筛选：将面包酵母菌、啤酒酵母和产朊假丝酵母分别接种于琼脂斜面培养基上，于28-30℃培养24h，如此反复两代，复苏菌种；接着将复苏菌种分别接种于50mL，pH 6.2±0.2的液体种子培养基，置于28℃恒温摇床，150r/min震荡培养24h，根据菌种的生长数量对3种菌分别选1株生长良好的菌株，将灭菌的硫酸铜配制成铜含量为0mg/L，50mg/L，100mg/L，200mg/L的液体培养基中，将1mL筛选出的生长良好的菌株接种到50mL液体培养基中，培养48h，以血球计数板统计各铜浓度液体培养基中酵母菌的数量；根据单位体积内的酵母菌个数和起始培养基中铜浓度作图，筛选出对铜适应能力较好的酵母菌和较好铜起始驯化浓度；
S2.酵母菌种的驯化：将S1初步筛选出来的对铜适应能力较好的酵母菌接种于筛选出的较好的铜起始驯化浓度的液体培养基中，置于28-32℃恒温摇床，150r/min震荡培养24h，然后从该培养物中取1mL培养液接种到不含铜的培养基中培养24h，如此反复培养N代，使酵母菌在此含铜量的培养基中生长稳定，当菌体数量不再增多时，以每次提高50mg/L起始铜浓度进行反复N代的培养，将起始铜浓度逐级提高50mg/L，直至铜浓度达到600mg/L，进行反复培养，最终筛选出酵母菌够适应含铜量为600mg/L的培养基环境，获得耐铜特性的酵母菌。
进一步说明，所述液体培养基的配方为：酵母提取物3g/L，麦芽糖提取物3g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，蒸馏水，pH 6.2±0.2。
所述琼脂斜面培养基为：酵母提取物3g/L，麦芽糖提取物3g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，琼脂20g/L，蒸馏水，pH 6.2±0.2。
进一步说明，在步骤S1中，初步筛选出来的对铜适应能力较好的酵母菌为啤酒酵母。
进一步说明，在步骤S1中，初步筛选出对铜适应能力较好的酵母菌的较好铜起始驯化浓度为100mg/L的液体培养基。
进一步说明，还包括了对耐铜酵母菌最适铜浓度的筛选和富铜酵母制备处理，具体操作如下：
耐铜酵母菌最适铜浓度的筛选：将培养24h的耐铜酵母菌菌种1mL接种到50mL硫酸铜添加量分别为100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L的培养基中，接种后立即取2mL培养基保存于4℃下备用，再置于28℃-30℃恒温摇床，150r/min震荡培养培养72h后取出，再将培养液在4000r/min离心5min，收集2mL上清液保存于4℃备用，离心得到的菌体用双蒸水冲洗，再离心，如此反复3次，在65℃将菌体干燥，备用；检测起始培养基铜浓度，上清液铜浓度，酵母菌粉含铜量；根据检测结果，确定耐铜酵母的最适生长铜浓度为200mg/L；
富铜酵母制备：将步骤S2驯化后的耐铜酵母菌株在筛选出最适生长的铜浓度下，在温度为28℃-30℃，pH 6.2±0.2的液体培养基中培养即可。
一种如上述所述方法制备得到的富铜酵母在制备象草生物发酵料中的应用。
与现有技术相比较，本发明具有的有益效果：
1、本发明的啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)190501能够耐受600mg/L的铜浓度，获得耐铜600mg/L的铜浓度特性。
2、本发明的啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)190501能够适应南方生物发酵料的发酵条件(偏酸、常温)进行发酵及使用，在温度为28℃-30℃，pH 6.2±0.2条件下的生物发酵料成本最低，使用范围最广。
3、另外本发明人通过研究发现，将本申请驯化得到的啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)190501接种于铜浓度为200mg/L，pH 6.2±0.2的培养液中，置于温度为28℃-30℃的培养箱中，150r/min震荡培养24h，获得的富铜酵母风干菌体铜含量为14.97g/kg。
4、本发明人通过研究发现，将本申请驯化得到的啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)190501作为象草生物发酵料的添加剂，可以提高象草饲料中有机铜的含量，并且经过发酵后的象草生物饲料可替代部分基础日粮用于小猪喂养，可明显促进小猪的采食量，使得小猪料肉比为2.60。
附图说明
图1为本发明一实施例的三种酵母菌种对起始铜适应能力对比图；
图2为本发明一实施例的耐铜酵母在不同铜浓度下酵母菌体铜含量的影响对比图；
图3为本发明一实施例的耐铜酵母在不同铜浓度下对铜的吸附量的影响对比图；
图4为本发明一实施例的耐铜酵母在不同铜浓度下酵母菌体产量的影响对比图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
实验1
1材料与方法
1.1材料与仪器
1.1.1菌种
经文献筛选之后，选定啤酒酵母，产朊假丝酵母，面包酵母3类酵母菌种为本次耐铜酵母菌株筛选和驯化的菌种。选定6株菌株为本次筛选和驯化的菌株，分别是啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，编号为：336058，336027)，产朊假丝酵母(Candidautilis(Henneberg)LodderetKreger-vanRij，编号为：336674，188871)，面包酵母(SaccharomycescerevisiaeHansen，编号为：336499，340638)。菌株由北京北纳创联生物技术研究院提供。
1.1.2培养基
琼脂斜面培养基为：酵母提取物3g/L，麦芽糖提取物3g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，琼脂20g/L，蒸馏水，pH 6.2±0.2。
液体培养基为：酵母提取物3g/L，麦芽糖提取物3g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，蒸馏水，pH 6.2±0.2。
1.1.3试剂
酵母提取物，麦芽糖提取物，葡萄糖，蛋白胨，琼脂，酒石酸，氢氧化钠，硫酸铜。所有试剂均为分析纯。
1.1.4仪器
SMART生物显微镜(重庆奥特光学仪器有限公司)，培英THZ-C恒温震荡器(苏州培英实验设备有限公司)，LD-5电动离心机(金坛市科析仪器有限公司)，立式灭菌锅D2S2-LC100(山东新华医疗器械股份有限公司)，电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械有限公司)，血球计数板(上海市求精生化试剂仪器有限公司)，电感耦合等离子体发射光谱。
1.2实验方法
1.2.1酵母菌种的筛选
将啤酒酵母，产朊假丝酵母，面包酵母菌种各两种菌种在无菌条件下，用接种环接种于琼脂斜面培养基上，于28-30℃的温室中培养24h，如此反复两代，复苏菌种。从斜面刮取己活化的酵母菌种，接种于50mL，pH 6.2±0.2的液体种子培养基，置于28℃恒温摇床，150r/min震荡培养24h。根据菌种在液体培养基的生长状况进行初筛，根据菌种的生长数量从中分别选3株生长良好的菌株进行铜适应性实验。将灭菌的硫酸铜溶液添加到50mL液体培养基中，配制成铜含量分别为0，50，100，200mg/L的液体培养基，将1mL酵母菌种子接种到液体培养基中，培养48h，以血球计数板统计各铜浓度液体培养基中酵母菌的数量。根据单位体积内的酵母菌个数和起始培养基中铜浓度作图，筛选出对铜适应能力较好的酵母菌和较好铜起始驯化浓度。
1.2.2酵母菌种的驯化
利用微生物能逐渐适应不利生长环境因素的能力，采用逐步提高培养基的中铜添加量的方式进行驯化。首先将初步筛选出来的耐铜酵母菌接种于筛选出的较好的铜起始驯化浓度的液体培养基中，本实验筛选出的较好的铜起始驯化浓度为100mg/L，置于28-32℃恒温摇床，150r/min震荡培养24h，然后从该培养物种取1mL培养液接种到不含铜的培养基中培养24h，如此反复培养几代，使酵母菌在此含铜量的培养基中生长稳定。当菌体数量不再增多时，以每次提高50mg/L起始铜浓度进行反复几代的培养。本实验将起始铜浓度逐级提高到150、200、250、300、350、400、450、500、550、600mg/L进行反复培养，最终使该酵母菌够适应含铜量为600mg/L的培养基环境，获得耐铜特性。
鉴定后发现该耐铜特性的菌株为一株啤酒酵母，命名为啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)190501，CCTCC NO：M 2019577；保藏地点为：中国，武汉，武汉大学；中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2019年07月24日。
1.2.3耐铜酵母菌最适铜浓度的筛选
将培养24h的耐铜酵母菌菌种1mL接种到50mL硫酸铜添加量分别为100、200、300、400mg/L的培养基中，接种后立即取2mL培养基保存于4℃下备用，再置于28℃-30℃恒温摇床，150r/min震荡培养培养72h后取出，再将培养液在4000r/min离心5min，收集2mL上清液保存于4℃备用，离心得到的菌体用双蒸水冲洗，再离心，如此反复3次，在65℃将菌体干燥，备用。检测起始培养基铜浓度，上清液铜浓度，酵母菌粉含铜量。用电感耦合等离子体发射光谱测铜的含量。根据检测结果，确定耐铜酵母的最适生长铜浓度。
1.2.4富铜酵母制备
将驯化后的啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)190501菌株在上述实验筛选出最佳富集铜浓度下，在温度为28℃-30℃，pH 6.2±0.2，的液体培养基中培养。
2结果
2.1三种酵母菌种对起始铜适应能力的比较
将血球计数板的计数结果及培养液铜浓度作图，由图1可知，啤酒酵母336058的菌体数量随培养液铜浓度的升高先升高后下降，在铜浓度为100mg/L的培养液中菌体数量为5.9×108个，达到最高值，对较高浓度的铜的耐受性较高。产朊假丝酵母336674的菌体数量随培养液铜浓度的升高波动增长，在0-50mg/L较低铜浓度下，产朊假丝酵母菌的菌体数量随培养液铜浓度的升高而下降，在50-100mg/L较高铜浓度下，产朊假丝酵母菌的菌体数量随培养液铜浓度的升高而上升，在铜浓度为100mg/L的培养液中菌体数量达到较高值3.7×108个，在100-200mg/L高铜浓度下，产朊假丝酵母菌的菌体数量随培养液铜浓度的升高而下降。面包酵母菌336499的菌数随培养液铜浓度的升高而剧烈下降。三种菌种在200mg/L铜浓度下几乎不生长，啤酒酵母336058在铜浓度为100mg/L的培养中菌体数量高于产朊假丝酵母336674。因此，选定啤酒酵母336058为对铜适应能力较好的菌株，100mg/L为最佳的铜起始驯化浓度。
2.2耐铜酵母菌的耐铜特性
通过不断提高铜浓度的反复驯化的方法，将耐铜性较好的啤酒酵母菌，以100mg/L为铜起始驯化浓度进行驯化。啤酒酵母菌在铜浓度提高到150-300mg/L之间时，菌体数量稳步增长，菌体较多，当铜浓度大于350mg/L时菌体数量逐渐下降，当铜浓度提高到600mg/L时，菌体数量明显减少，因此不再提高铜浓度进行驯化。最终本实验啤酒酵母336058获得的耐铜浓度为600mg/L。啤酒酵母菌未经驯化前，不能适应200mg/L的铜浓度，经过驯化之后能够适应600mg/L的铜浓度，获得耐铜特性的啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)190501。
2.3耐铜酵母的最适生长铜浓度
由图2可知，啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)190501风干菌体铜含量随培养液铜浓度的升高而升高，对不同铜浓度下风干菌体铜含量进行方差分析表明，100mg/L铜处理组与200mg/L，400mg/L，600mg/L铜处理组相比，风干菌体铜含量差异极显著(p<0.01)，200mg/L铜处理组与400mg/L铜处理组相比，风干菌体铜含量差异显著(p<0.05)。由图3可知，耐铜酵母菌啤酒酵母对铜的吸附量随培养液铜浓度的上高先升高后下降，耐铜酵母菌啤酒酵母在铜浓度为200mg/L的培养基中对铜的富集能力最强，且与其他铜浓度处理组相比达到显著差异(p<0.05)。由图4可知，耐铜酵母菌啤酒酵母菌体产生量随培养液铜浓度的升高而下降，各铜处理组之间菌体产量差异显著(p<0.05)。综合分析耐铜酵母啤酒酵母对铜的富集能力，对铜吸附能力及菌体产生量，其最适生长的铜浓度为200mg/L。
2.4富铜酵母产品的铜含量
将啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)190501接种于铜浓度为200mg/L，pH6.2±0.2的培养液中，置于温度为28℃-30℃的培养箱中，150r/min震荡培养24h，获得的富铜酵母风干菌体铜含量为14.97g/kg。
本研究根据南方发酵条件筛选生长条件相近的菌株，在不改变原始菌株最适生长pH值，温度，生长时间的条件下，进行耐铜酵母的驯化，获得了良好的效果。以往，对耐铜的酵母的筛选多是以耐铜性能最高，生长温度，pH最适宜为标准，其目的是富集更多浓度更高的铜，并以失活的酵母铜菌剂添加到饲料中，寻求的是有机铜这一营养元素。在本研究中，我们根据南方成本较低的生物发酵条件限定温度及pH值，模拟象草发酵的条件来筛选和驯化耐铜酵母，目的是获得具备有发酵特性的活性的富铜酵母。本研究在温度为28℃-30℃，pH 6.2±0.2的条件下，获得了菌体含铜量为14.97g/kg的活性富铜酵母菌株。
实验2
象草生物发酵料的制备：
1将生长高度为1m左右的成熟的象草收割，用切碎机粉碎成长度为3-5mm的细草丝，自然晾干至水分为40％～50％之间。
2将啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)190501在200mg/L的铜浓度中培养72h，收集富铜酵母菌体，添加液体培养基将富铜酵母配制成1mg/L的酵母菌种，按1kg草料添加7mL1mg/L的酵母菌种的比例，将酵母菌种与草料混合均匀，置于发酵袋中发酵20天。
3将发酵好后的象草按5％，10％，15％的比例与鱼露，木薯，矿物，CaHPO4，石粉，盐混合均匀，配制成象草生物发酵料。
动物实验：
1预喂实验
在为期两周的象草生物发酵料预喂实验中，将象草浓度为5％，10％，15％的象草生物发酵料以5％，10％，20％，40％，60％，80％，100％稳步提高的添加比例添加小猪料当中，观察小猪的采食情况及健康状况。发现，随着象草生物发酵料添加比例的不断升高，小猪的采食量先升高后下降，但象草生物发酵料添加比例越高，小猪健康度下降明显，当添加比例为100％的象草生物发酵料时，小猪在2天后出现严重的腹泻情况，粪便发黑，体型消瘦。因此，结合小猪的生长状况，健康状况及采食量，确定象草浓度为15％，象草生物发酵料添加比例为20％为最佳喂养方式并进行营养成分检测及正式实验。象草发酵饲料的饲喂比例及营养组成见表1。象草生物发酵料营养成分见表2。
表1象草发酵饲料的饲喂比例及营养组成
Figure GDA0003917615520000091
表2象草发酵饲料的营养成分
Figure GDA0003917615520000092
2象草生物发酵料对猪增重及采食量的研究
选取实验组及对照组各7头母猪，均重34±2.74kg，喂以象草浓度为15％，添加比例为20％的象草生物发酵料，驯养7天，喂养28天。由表3可知，浓度为15％添加比例为20％的象草生物发酵料可明显促进小猪的草食量，与全价料相比达到极显著差异，但对小猪的增重效果差于全价料，其料肉比为2.60。
表3象草生物发酵料猪增重及采食量
组别 每头平均增重(kg) 增重(kg) 采食量(kg) 料肉比
对照组 23.21 162.5 333 1.88
实验组 22.2 155.4 403* 2.60
注：*，P<0.01。
虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然其并非用以限制本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许的修改和完善，因此本发明的保护范围当以权利要求书所界定的为准。

Claims (2)

1.一株啤酒酵母，其特征在于：命名为啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）190501，保藏菌号为CCTCC NO：M 2019577；保藏地点为：中国，武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2019年07月24日。
2.如权利要求1所述的啤酒酵母在制备象草生物发酵料中的应用。
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