CN117511820A - 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在制备发酵饲料中的应用 - Google Patents

一株贝莱斯芽孢杆菌及其在制备发酵饲料中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株贝莱斯芽孢杆菌及其在制备发酵饲料中的应用，属于微生物技术领域。本发明分离筛选获得一株贝莱斯芽胞杆菌DLWHY‑3，于2023年10月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.28645；将所得的贝莱斯芽孢杆菌DLWHY‑3用于发酵含有玉米淀粉、豆粕的饲料，发酵36h时，其水解液的多肽含量和还原糖含量相比空白对照分别提高了1.9倍和2.3倍。本发明显著提高了饲料的利用率，明显改善了养殖的效益，且具有生产工艺简单环保、产品稳定，绿色，无毒等优点。

Description

一株贝莱斯芽孢杆菌及其在制备发酵饲料中的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其在制备发酵饲料中的应用。
背景技术
市场上较为常见的饲料中主要包含有玉米淀粉、豆粕等成分，将这些饲料直接喂养牛、羊、猪等牲畜，通常会存在饲料的利用率较低、养殖的效益较差等问题，为了改进饲料的利用价值，现有技术通过使用酵母菌、乳酸菌等菌种对饲料进行发酵处理，将饲料中的大分子成分降解为小分子，进而提高饲料的利用，然而，目前现有的用于发酵饲料的菌种存在菌种培养条件苛刻、发酵效率较低、发酵成本较高等缺陷。因此，研究开发新可应用于发酵饲料的易培养、繁殖速率快、产酶活高的菌种成为当前亟待研究的重要课题。
发明内容
鉴于此，本发明的目的是提供了一株贝莱斯芽孢杆菌及其在制备发酵含玉米淀粉、豆粕的精饲料中的应用。利用本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌在其发酵最优条件下，将精饲料中的玉米淀粉、豆粕等成分适度水解成小分子成分，能够提高精饲料的利用率和养殖效益等。
本发明目的是通过以下方式实现：
本发明提供一株贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)DLWHY-3，于2023年10月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.28645；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
一种用于发酵饲料的菌剂，所述的菌剂为通过发酵上述的贝莱斯芽胞杆菌DLWHY-3制备得到。
基于上述技术方案，进一步地，所述的菌剂的制备过程包括以下步骤：将所述的贝莱斯芽胞杆菌DLWHY-3接种于发酵培养基中，25～45℃、pH 6～8，100～300rpm下摇床培养10～48h，即得。
基于上述技术方案，进一步地，所述发酵培养基中的碳源包括酵母浸粉、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉和果糖，氮源包括豆粕、蛋白胨、硝酸钾、硫酸铵和尿素。
基于上述技术方案，进一步地，所述的发酵培养基包括：豆粕0.5～3％，乳糖0.5～3％，氯化钠0.5～1.5％。
基于上述技术方案，进一步地，所述的贝莱斯芽胞杆菌DLWHY-3的接种量为1～5％v/v。
本发明另一方面提供上述的贝莱斯芽胞杆菌DLWHY-3、上述的菌剂在制备发酵饲料中的应用。
基于上述技术方案，进一步地，发酵饲料的原料中包含有玉米淀粉、豆粕中的一种或两种。
本发明还提供一种利用上述的贝莱斯芽胞杆菌DLWHY-3制备发酵饲料的方法，包括以下步骤：
(1)将所述的贝莱斯芽胞杆菌DLWHY-3接入至种子培养基中培养5～24h；
(2)将步骤(1)得到的菌培养液按接种体积比1～10％接种到发酵培养基中培养6～48h；
(3)将步骤(2)获得的发酵液按照质量百分比2～10％的加入量加入到饲料原料中，按照料水质量比1：0.2～1：1加水，混合均匀后，在25～45℃下发酵24～72h，即得。
基于上述技术方案，进一步地，所述的发酵饲料的原料中包含有玉米淀粉、豆粕，豆粕与玉米淀粉的质量比为1：1～1：8。
基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中所述的种子培养基包括：蛋白胨0.5～2％、酵母浸粉0.2～1.0％、NaCl 0.5～1.5％。
基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中的培养条件为：pH 6～8，25～45℃下100～300rpm摇床培养。
基于上述技术方案，进一步地，步骤(2)中的培养条件为：pH 6～8，25～45℃下100～300rpm摇床培养。
本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：
本发明以蛋白质和淀粉的水解率为检测标准，筛选获得了一株能够高效将精饲料中的玉米淀粉、豆粕等成分适度水解成小分子成分的贝莱斯芽胞杆菌DLWHY-3，经过贝莱斯芽胞杆菌DLWHY-3水解的含淀粉、豆粕的精饲料与现在采用的精饲料直接喂养比较，具有饲料的利用率显著提高，养殖的效益明显改善等特点，且生产工艺简单环保、产品稳定，绿色，无毒。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。
图1为菌株DLWHY-3的平板培养的菌落图片。
图2为菌株DLWHY-3的显微镜下的形态特征图片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。
下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。其中“pH自然”是指培养基配制时不调pH值。
1.培养基
①种子培养基：蛋白胨1％、酵母浸粉0.5％、NaCl 1％、pH7.5，121℃灭菌20～30min。
②LB培养基：1％蛋白胨、1％NaCl、0.5％酵母浸粉、pH自然，121℃灭菌20～30min。
③LB固体培养基：1％蛋白胨、1％NaCl、0.5％酵母浸粉、2％琼脂、pH自然，121℃灭菌20～30min。
④初筛培养基：牛肉膏1％，蛋白胨0.5％，氯化钠0.5％，干酪素1％，琼脂2％，pH7，121℃灭菌20～30min；
1.5g蛋白胨，0.75g氯化钠，0.75g牛肉膏，0.3g可溶性淀粉，3g琼脂，去离子水150mL，pH 7.2，121℃灭菌20～30min。
⑤产酶发酵培养基：蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，NaCl 1％，pH7.5，121℃灭菌20～30min。
⑥固体发酵培养基：将玉米淀粉和豆粕按6：1比例混合，并按1：0.6料液比加去离子水，玻璃棒搅拌均匀后装入三角瓶中，121℃灭菌20～30min，备用。
2.蛋白酶活力的测定
采用Folin-酚法，即酪蛋白为底物，以酪氨酸为标准物，具体过程如下：
样品的准备：取1mL用蒸馏水稀释10倍的酶液放入试管中，加入1mL 2％酪蛋白溶液，混均，在40℃水浴中准确反应10min后，立即加入2mL、0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液终止反应，继续保温20min使残余的蛋白质沉淀，过滤，取1mL滤液，用Folin-酚法测定滤液中的酪氨酸含量(μg/mL)。每一样品设3次重复，结果取平均数。酪氨酸标准曲线的回归方程式为：y＝0.7659x-0.0128，R2＝0.9963。
对照品的准备：与样品的准备方法相同，区别在于试管中的酶液先加入TCA溶液使酶失活后，再加入酪蛋白溶液。
其中，酶液和酪蛋白溶液混合之前，两种溶液均在40℃水浴中预热2min以上；所述酶液为菌种培养液的离心上清液。
蛋白酶活力公式：
酶活力(U/mL)＝(CL×V1×4×n1)/(m1×10)；
公式中CL为酪氨酸浓度(mg/mL)；V1为配制的酪蛋白溶液的体积(mL)；4为发生反应过程中所需溶液的总体积；n1为稀释倍数；m1为酪蛋白的质量，g；10为反应时间(min)。
蛋白酶活力定义：在一定条件下，在单位时间内(1min)蛋白酶将酪蛋白水解成1mg酪氨酸所消耗的酶量。
相对酶活(％)＝酶活力值/酶活力最高值×100％。
3.淀粉酶活力的测定
采用3,5-二硝基水杨酸法(DNS法)，可溶性淀粉为底物，以葡萄糖为标准物，具体过程如下：
样品的准备：取1mL用蒸馏水稀释10倍的酶液放入25mL比色管中，加入1.5mL2％的淀粉溶液，混均，在40℃水浴准确反应30min后，立即加入1.5mL DNS溶液终止反应，沸水浴5min，用蒸馏水定容至25mL，于540nm波长处测定OD值。每一样品设3次重复，结果取平均数。
对照品的准备：与样品的准备方法相同，区别在于将试管中的酶液换成蒸馏水。
其中，酶液需在40℃水浴中预热2min以上；所述酶液为菌种培养液的离心上清液。
淀粉酶活力公式：
酶活力(U/mL)＝(CP×V2×n2)/(VΜ×t×m2)；
公式中CP为葡萄糖浓度(mg/mL)；V2为配制的淀粉溶液的体积(mL)；n2为稀释倍数；VM粗酶液的体积(mL)；t为淀粉酶反应时间(min)；m2为可溶性淀粉的质量(g)。
淀粉酶活力定义：在一定条件下，在单位时间内(1min)淀粉酶将淀粉水解成1mg葡萄糖所消耗的酶量。
相对酶活(％)＝酶活力值/酶活力最高值×100％。
4.还原糖含量测定
将0.5g样品和25mL蒸馏水混合，煮沸10～15min；4000r/min离心5min，取0.5mL上清液与0.5mL DNS溶液反应，沸水浴5min，冷却后，加入4mL蒸馏水，540nm处测OD值，代入葡萄糖标准曲线(y＝0.4707x+0.0022，R2＝0.9964)得出还原糖含量。
5.多肽含量测定
将1g样品加入10mL 15％TCA溶液中，混匀后在200r/min条件下摇床提取10min，6000r/min条件下离心10min；将上清液稀释至一定倍数，取1mL稀释液，用Folin-酚法测定其多肽含量。
实施例1菌株DLWHY-3的筛选、分离与鉴定
一、菌株DLWHY-3的分离、筛选
本发明从海参肠道菌群中分离、筛选菌株。所述海参为大连产刺参(Apostichopusjaponicus)活体，购自大连长兴水产品批发市场。
①海参肠道混合菌液的制备
用无菌水将海参活体洗净，于无菌室中解剖取肠。取部分肠段混合于一定体积的无菌水中，充分震荡，离心后吸取上清液接种于10倍的LB养基中，在30℃、200rpm摇瓶培养48h，获得海参肠道混合菌液。
②初筛
将步骤①获得的海参肠道混合菌液，用无菌水稀释至10-6、10-7、10-8倍；分别取200μL稀释液均匀涂布在LB固体培养基的平板上，30℃培养48h，获得不同单菌落。将每一不同单菌落菌体稀释后，分别涂布接种于含有干酪素的初筛培养基平板和含有可溶性淀粉的初筛培养基平板上，在30℃条件下倒置培养至形成单菌落，并观察透明圈的产生情况。将具有蛋白质水解透明圈和淀粉水解透明圈，且水解透明圈最大的原始菌体挑取，备用。
③复筛
将步骤②获得的具有双透明圈的菌体，接种于种子培养基中，在30℃、200rpm条件下摇瓶培养24h；将种子液按1％(v/v)比例接种于发酵培养基中，在30℃、200rpm条件下摇瓶培养48h；离心(5000r/min，10min)获得发酵上清液。测定上清液中的蛋白酶活力和淀粉酶活力，筛选出一株产蛋白酶活力、淀粉酶活力均高的菌株，命名为DLWHY-3。
④菌种保存
将步骤③得到的菌株DLWHY-3在种子培养基中培养，并将培养物制成30％甘油管，在-80℃冰箱保存，备用。
二、菌株DLWHY-3的鉴定
(1)形态特征
菌落形态观察结果如图1～2所示，菌落呈圆形，半透明，表面皱褶，有凸起。革兰氏染色呈阳性，1000倍显微镜下观察为杆状。
(2)生理生化特征
该菌株可在有氧条件下能利用蔗糖、D-葡萄糖、D-麦芽糖、D-果糖产酸，不能利用D-半乳糖产酸，淀粉水解，液化明胶、可利用柠檬酸盐、过氧化氢酶呈阳性，能在2％、5％、10％浓度的盐溶液中生长。
(3)分子鉴定结果
进行16S rDNA序列测定，结果表明16S rDNA序列长度1484bp(具体序列见序列表)，BLAST结果表明其与芽孢杆菌属的贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)相似度最高，达到99％以上，因此该菌株为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)。
三、菌株DLWHY-3的保藏
通过以上分离、筛选与菌株鉴定结果，确认菌株DLWHY-3为来自于芽孢杆菌属(Bacillus)的新菌，将其命名为DLWHY-3，于2023年10月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.28645。
实施例2菌株DLWHY-3的发酵条件的优化
1)培养基成分优化
(1)培养基的氮、碳源的选择
将菌株DLWHY-3以2×106个/mL培养基的接菌浓度分别接种于碳源、氮源种类和含量不同的发酵培养基中，30℃、pH 6.5，好氧培养20h，按上述方法测定菌培养液中的酶活，结果见表1～4。
表1培养基氮源种类对酶活的影响
表2培养基碳源种类对酶活的影响
(2)培养基的氮源、碳源的添加量的选择
表3氮源添加量对酶活的影响
表4碳源添加量对酶活的影响
本发明所述的菌株DLWHY-3在产酶培养基成分为：豆粕1％，乳糖1％，氯化钠1％时蛋白酶活力和淀粉酶活力均最高，说明菌株DLWHY-3的最适培养基成分为此。
2)发酵条件的优化
(1)发酵最适pH值的确定
将菌株DLWHY-3以2×106个/mL培养基的接种量接种于初始pH分别为5、6、6.5、7、7.5、8的发酵培养基中，在30℃、200rpm摇瓶培养20h后，测定菌培养液中的酶活，结果见表5。
表5发酵初始pH值对酶活的影响
由表5可知，pH为5～6时，随pH增大，培养液中的蛋白酶活力、淀粉酶活力均缓慢上升，在pH为6.5～8时，该菌株产蛋白酶和淀粉酶活性开始下降，尤其pH 8时相对酶活下降明显，综上以上特点，初始pH应控制在6～8，优选为pH 6.5。
(2)发酵最适温度的确定
将菌株DLWHY-3以2×106个/mL培养基的浓度分别接种于发酵培养基中，分别在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃条件下，200rpm摇瓶培养20h，比较测定菌培养液离心上清液中的蛋白酶活力、淀粉酶活力，结果见表6。
表6发酵温度对酶活的影响
从表6可知，25℃到30℃之间，蛋白酶和淀粉酶活力变化不大，25℃之后酶活开始上升，蛋白酶活力在40℃时达到最高，45℃开始下降，淀粉酶活力在35℃时最高，40℃开始下降，考虑到两种酶活在两种温度中存在的变化量，选择差值更小的35℃最佳。从这一结果确定菌株DLWHY-3的最适培养温度为30～45℃，优选为35℃。
(3)发酵最适接种量的确定
将菌株DLWHY-3以接菌量1％、2％、3％、4％、5％、6％接种于发酵培养基中，35℃条件下摇瓶培养24h后，比较测定菌培养液离心上清液中的蛋白酶活力、淀粉酶活力，结果见表7。
表7发酵接种量对酶活的影响
从表7可知，接菌量为3％、4％时，培养液两种酶活力分别达到最高，且在4％时，两种相对酶活间的差值更小，从以上结果确定菌株DLWHY-3的最适接菌量为2～5％，优选3～4％。
实施例3菌株DLWHY-3在精饲料淀粉、豆粕的适度发酵中应用
(1)将-80℃保存的DLWHY-3，在室温放置2h后，以2×106个/mL培养基的浓度接入至100mL种子培养基中，在30℃、pH 6.5、200rpm摇床培养20h；
(2)将步骤(1)培养的菌培养液40mL，接入至1L产酶发酵培养基中，35℃、pH6.5、200rpm摇床培养24h；
(3)将步骤(2)的发酵培养液按质量百分比6％的加入量加入到豆粕和玉米淀粉按照1：6比例混合的料内，并按料水比1：0.6加水；搅拌均匀后在30℃条件下发酵36h，测定多肽和还原糖含量，对照组不加菌液。
将菌株DLWHY-3在玉米淀粉和豆粕1：6混合精饲料的发酵结果表明，在料水比1：0.6、接菌量6％、30℃条件下发酵36h时，发酵饲料中的蛋白质水解多肽的含量能够达到2.89g/mL(空白对照为1.51g/mL)，比对照组提高了1.91倍；淀粉水解还原糖的含量能够达到1.89g/mL(空白对照为0.82g/mL)，比对照组提高了2.31倍。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一株贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)DLWHY-3，其特征在于，于2023年10月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.28645；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2.一种用于发酵饲料的菌剂，其特征在于，所述的菌剂为通过发酵权利要求1所述的贝莱斯芽胞杆菌DLWHY-3制备得到。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述的菌剂的制备过程包括以下步骤：将所述的贝莱斯芽胞杆菌DLWHY-3接种于发酵培养基中，25～45℃、pH 6～8，100～300rpm下摇床培养10～48h，即得。
4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述发酵培养基中的碳源包括酵母浸粉、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉和果糖，氮源包括豆粕、蛋白胨、硝酸钾、硫酸铵和尿素。
5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述的发酵培养基包括：豆粕0.5～3％，乳糖0.5～3％，氯化钠0.5～1.5％。
6.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述的贝莱斯芽胞杆菌DLWHY-3的接种量为1～5％v/v。
7.权利要求1所述的贝莱斯芽胞杆菌DLWHY-3、权利要求2～6任一项所述的菌剂在制备发酵饲料中的应用，发酵饲料的原料中包含有玉米淀粉、豆粕中的一种或两种。
8.一种利用权利要求1所述的贝莱斯芽胞杆菌DLWHY-3制备发酵饲料的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将所述的贝莱斯芽胞杆菌DLWHY-3接入至种子培养基中培养5～24h；
(2)将步骤(1)得到的菌培养液按接种体积比1～10％接种到发酵培养基中培养6～48h；
(3)将步骤(2)获得的发酵液按照质量百分比2～10％的加入量加入到饲料原料中，按照料水质量比1：0.2～1：1加水，混合均匀后，在25～45℃下发酵24～72h，即得。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的发酵饲料的原料中包含有玉米淀粉、豆粕，豆粕与玉米淀粉的质量比为1：1～1：8；步骤(1)中所述的种子培养基包括：蛋白胨0.5～2％、酵母浸粉0.2～1.0％、NaCl 0.5～1.5％；培养条件为：pH 6～8，25～45℃下100～300rpm摇床培养。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)中的培养条件为：pH 6～8，25～45℃下100～300rpm摇床培养。
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