CN114395506B - 一种耐高温产纤维素酶枯草芽胞杆菌及其培养方法和应用 - Google Patents
一种耐高温产纤维素酶枯草芽胞杆菌及其培养方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种耐高温产纤维素酶枯草芽胞杆菌及其培养方法和应用，所述枯草芽孢杆菌命名为(Bacillus subtilis)FJAT‑5561，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FJAT‑5561，于2021年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.24100。本发明菌株高温环境下具有较高的产纤维素酶的能力，对青霉、真菌具有抑制效果，用其高温固态发酵豆粕，不需对豆粕预先灭菌，还降低了豆粕中难降解的粗纤维含量，提升了豆粕中的粗蛋白含量。
Description
【技术领域】
本发明涉及一种耐高温产纤维素酶枯草芽胞杆菌及其培养方法和应用。
【背景技术】
豆粕是大豆加工后的副产物，是畜禽饲料中重要的蛋白质原料。豆粕中的粗纤维难以消化吸收，增加畜禽肠道负担，降低营养转化率。微生物降解纤维素具有反应条件温和、污染较小的特点，是目前研究最广泛的利用方式，难以降解吸收的纤维素可通过微生物的充分发酵，提高饲料的利用率，改善饲料营养价值，降低饲料成本，提高经济效益，具有广阔的开发前景。因此，筛选获得高产纤维素酶的菌种，应用于豆粕发酵中，可将饲料中难消化的粗纤维降解为小分子糖类，同时产生微生物活性益生菌、复合酶等，提高发酵饲料的营养价值。
豆粕发酵过程产生的高温能够抑制大多数微生物的生长，导致菌株无法完成对豆粕的发酵。枯草芽孢杆菌能够产生具有抗逆性的芽胞，对高温、干燥和盐碱等都有很强的抗性，适应发酵产生的高温环境。
随着畜禽养殖的高速发展，抗生素大量使用所带来的资源浪费、药物残留、抗药性、环境污染以及威胁人体健康等多种问题逐渐显现。发酵饲料被认为是饲料中抗生素的潜在替代品。芽胞杆菌能够产生抗菌物质抑制病原微生物，所产生的抗菌物质对畜禽也具有促生长、保健和治疗疾病的作用，属无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性的一类环保型制剂，有效避免饲料污染，减少抗生素在饲料中的应用。
因此，针对畜禽饲料中纤维素难以降解，分解转化率低的问题，筛选耐受发酵高温的芽孢杆菌，利用其产酶特性，解决豆粕纤维素难以降解的问题，利用其抑菌特性解决豆粕发酵的杂菌污染问题，提高发酵饲料的营养价值和安全性，促进发酵饲料的发展与应用。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题，在于提供一种耐高温产纤维素酶枯草芽胞杆菌及其培养方法和应用，该菌株高温环境下具有较高的产纤维素酶的能力，对青霉、真菌具有抑制效果，用其高温固态发酵豆粕，不需对豆粕预先灭菌，还降低了豆粕中难降解的粗纤维含量，提升了豆粕中的粗蛋白含量。
本发明是这样实现的：
一种耐高温产纤维素酶枯草芽胞杆菌，所述枯草芽孢杆菌命名为(Bac illussubtilis)FJAT-5561，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FJAT-5561，于2021年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.24100。
进一步地，所述的一种耐高温产纤维素酶枯草芽胞杆菌的培养方法，步骤如下：
(1)将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FJAT-5561划线接种于LB固体培养基，45℃-55℃活化培养24-30h，制得活化菌株；
(2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于LB液体培养基中，45℃-55℃、160-220rpm振荡培养18-20h，制得种子液；
(3)将步骤(2)制得的种子液按体积百分比3％-5％的接种量接种至液体培养基中，45℃-55℃培养8h，制得接种菌剂。
进一步地，所述的一种耐高温产纤维素酶枯草芽胞杆菌制备发酵豆粕，发酵步骤如下：
(1)发酵豆粕培养基配比如下：往豆粕中添加其重量量8％-12％麸皮，调整含水量至45-50％；
(2)按8-12％的接种量(V/V)加入活化后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FJAT-5561菌液，30-35℃发酵7d，完成发酵。
本发明具有如下优点：
本发明的枯草芽孢杆菌FJAT-5561具有耐高温的性能，其在30～55℃的高温环境下具有较高的产纤维素酶的能力，在碱性环境中，酶活性最高达0.90U/ml，适应于发酵饲料的生产。
本发明的枯草芽孢杆菌FJAT-5561该对青霉具有抑制效果，抑菌率达87.78％，且上清液稀释8倍后依然具有抑菌效果。扫描电镜观察结果同样证明FJAT-5561对青霉具有良好的抑制效果。
本发明的枯草芽孢杆菌FJAT-5561能够抑制真菌生长，添加枯草芽孢杆菌发酵豆粕的发酵产物未检出黄曲霉素、赭曲霉毒、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镶刀菌烯醇等真菌毒素，同时未分离出黄曲霉，因此，可保障发酵饲料生物安全；同时，发酵产物中的粗纤维含量为4.2％(干重)，低于对照组的4.6％，降低了豆粕中难以利用的粗纤维含量，提升了豆粕中的粗蛋白含量，增加了豆粕的营养价值。
【附图说明】
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
图1为本发明实施例1中pH对枯草芽胞杆菌FJAT-5561纤维素酶活性的影响柱状图。
图2为本发明实施例1中温度对枯草芽胞杆菌FJAT-5561纤维素酶活性的影响柱状图。
图3为本发明实施例2中枯草芽孢杆菌FJAT-5561对青霉抑制作用的电镜图。
【具体实施方式】
本发明涉及一种耐高温产纤维素酶枯草芽胞杆菌，所述枯草芽孢杆菌命名为(Bacillus subtilis)FJAT-5561，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FJAT-5561，于2021年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.24100。
所述的一种耐高温产纤维素酶枯草芽胞杆菌的培养方法，步骤如下：
(1)将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FJAT-5561划线接种于LB固体培养基，45℃-55℃活化培养24-30h，制得活化菌株；
(2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于LB液体培养基中，45℃-55℃、160-220rpm振荡培养18-20h，制得种子液；
(3)将步骤(2)制得的种子液按体积百分比3％-5％的接种量接种至液体培养基中，45℃-55℃培养8h，制得接种菌剂。
所述的一种耐高温产纤维素酶枯草芽胞杆菌制备发酵豆粕，发酵步骤如下：
(1)发酵豆粕培养基配比如下：往豆粕中添加其重量量8％-12％麸皮，调整含水量至45-50％；
(2)按8-12％的接种量(V/V)加入活化后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FJAT-5561菌液，30-35℃发酵7d，完成发酵。
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：菌株FJAT-5561的分离和鉴定
1)菌株分离自福建莆田江口镇葡萄园葡萄根系土壤。取葡萄根系土壤10g于90mL无菌水中，充分振荡后吸取1mL进行梯度稀释，选用稀释度为10-1，10-2，10-3；
2)将步骤(1)获得的土壤稀释液涂布于细菌培养基平板上，于30℃下培养2-3d；
3)将步骤(2)培养获得的菌落采用连续划线法接种于细菌培养基平板上，并在温度30℃、培养2-3d，获得纯菌株，命名为FJAT-5561。
4)菌株FJAT-5561的16S rRNA鉴定:
a、DNA提取
①1mL的细胞悬液在6000g下离心2min。弃去上清液以后，用400μLSTE Buffer(100mMNaCl，10mM Tris/HCl，1mM EDTA，pH 8.0)冲洗细胞两次。然后在6000g下离心2min，弃去上清。
②用200μLTE Buffer(10mM Tris-HCl,1mM EDTA，pH 8.0)悬浮细胞，然后用100μL的Tris-saturatedphenol(pH 8.0)加到离心管中，涡旋混合60s。
③接着在4℃下用13000g离心5min以从有机相中分离出水相，然后取160μL上清液转移到干净的1.5mLEP管中。
④加40μL的TE Buffer到EP管中，然后用100μL氯仿混合，在4℃，13000g离心5min。用氯仿提取的方法纯化裂解液直到没有白色的界面出现；这个过程要重复两到三遍。
⑤取160μL上清液到干净的1.5mLEP管中，再加40μLTE和5μL的RNase(10mg/ml)并在37℃下放置10min，以分解RNA。
⑥接着将100μL的氯仿加到离心管中，混合后，在4℃下13000g离心5min。
⑦再将100μL的上清液转移到干净的1.5mLEP管中。
b、PCR扩增反应体系与测序
①PCR反应体系(25μL)：2.5μL 10×Buffer、0.5μL 10mM dNTP、引物各1μL、0.3μL(5U/μL)的Taq酶和1μLDNA模板。
②PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min30s，35个循环，最后72℃延伸10min。
③PCR产物的检测：取2μLPCR产物，点样于1.5％的琼脂糖凝胶中，以100bp Marker作为标准分子量，100V电压，电泳40min，EB染色，用凝胶成像系统观察结果。
④PCR产物送至上海铂尚生物技术有限公司进行测序。
c、16S rRNA序列比对分析
通过一对16S rRNA通用引物27F和1492R进行PCR扩增所筛选的菌株的rRNA序列，然后测序分析得到16S rRNA序列(如SEQ ID NO.1所示)，将16S rRNA序列(如SEQ ID NO.1所示)进行BLSAT比对分析，显示该菌为枯草芽胞杆菌，因此，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FJAT-5561
5)该菌株FJAT-5561产纤维素酶活性筛选：
a、枯草芽胞杆菌接种于LB培养基中，30-55℃活化培养24h，再接种至LB-CMC固体培养基(LB-CMC培养基：羧甲基纤维素钠1％+LB培养基)，30-55℃培养48h。采用碘化钾染色法对菌株进行检测，菌落周围均有透明圈产生，再测定水解透明圈直径(H)和菌落直径(D)大小，菌株FJAT-5561在30℃和55℃环境下培养，H/D分别为为3.27和3.29；因此根据H/D比值可初步判定在30-55℃高温环境下菌株FJAT-5561可存活且具有产纤维素酶的能力。
b、将活化后的枯草芽胞杆菌FJAT-5561按2％的接种量转移至LB-CMC液体培养基，采用3，5-二硝基水杨酸显色法进行酶活性复筛。每分钟每毫升水解淀粉释放1μmol葡萄糖所需酶量定义为一个酶活力单位(U)。
结果如图1和图2所示，图1为枯草芽胞杆菌FJAT-5561在温度为30℃的条件下，pH对其纤维素酶活性的影响；图2为枯草芽胞杆菌FJAT-5561在pH为8的条件下，温度对其纤维素酶活性的影响。从图中可知所述枯草芽孢杆菌在温度为30℃的条件下，pH为6、7和8其酶活性分别为为0.31U/mL、0.52U/ml和0.69U/ml；在pH为8的条件下，35℃、45℃和55℃其酶活性分别为为0.75U/mL、0.90U/ml和0.59U/ml。枯草芽胞杆菌FJAT-5561最适产酶温度为45℃，最适pH为8，酶活为0.90U/ml。在高温碱性条件产酶活性最高，适应于发酵饲料的生产。
实施例2：菌株FJAT-5561的抑菌谱测定
制备马铃薯蔗糖双层板培养基，下层为固体马铃薯蔗糖培养基，上层为半固体马铃薯蔗糖培养基(琼脂含量减半)。所述培养基配方：马铃薯蔗糖固体培养基：马铃薯200.0g，蔗糖20.0g，琼脂18.0g,蒸馏水定容至1L，pH为7.2；半固体马铃薯蔗糖培养基：马铃薯200.0g，蔗糖20.0g，琼脂9g，蒸馏水定容至1L；马铃薯蔗糖液体培养基：马铃薯200.0g，蔗糖20.0g，蒸馏水定容至1L，pH为7.2。
菌株的活化和菌悬液制备：枯草芽孢杆菌FJAT-5561接种于100mL LB培养液中55℃、170r/min摇床振荡培养2d，0.22μm滤膜过滤，获得菌株发酵上清液。将青霉FJAT-110在PDA培养基上30℃、170r/min摇床振荡培养5d，取孢子用无菌水稀释，制备106cfu/mL的孢悬液，4℃保存备用。
抑菌圈法检测抑菌效果：将1mL病原真菌的菌悬液与9mL 50℃的半固体马铃薯蔗糖培养基混合后，倒入已制备好的马铃薯蔗糖固体培养基中，制成含病原真菌的双层培养基；待培养基凝固后，用1mL枪头在平板上打孔，在孔内加入100μL过0.22μm滤膜的枯草芽孢杆菌FJAT-5561发酵上清液，以无菌水为阴性对照，0.1mg/mL潮霉素为阳性对照。30℃生物培养箱培养培养3-5d。观察抑菌透明圈的产生，拍照并测量透明圈直径(抑菌圈直径越大说明抑菌效果越好。)。同时，将发酵上清液原液稀释1、2、4、8倍，观察不同浓度的上清液对青霉的抑制效果，透明抑菌圈直径如下表1所示；并按下式计算抑菌率：
抑菌率(％)＝(菌落直径-打孔直径0.8cm)/(阳性对照直径-打孔直径0.8cm)·100％。
表1不同浓度芽胞杆菌上清液对青霉的抑菌圈直径
由此可知，所述枯草芽孢杆菌FJAT-5561对青霉具有抑制效果，抑菌率最高为87.78％。FJAT-5561上清液稀释8倍后依然具有抑菌效果。
取抑菌圈附近的菌块，电镜观察芽胞杆菌对青霉菌丝生长及结构形态的影响，如图3所示，图中的a、b为未添加发酵上清液时的青霉菌丝形态；c、d为添加枯草芽孢杆菌FJAT-5561发酵上清液的青霉菌丝形态。从图3中可知，枯草芽孢杆菌FJAT-5561发酵上清液使青霉菌丝变形和萎缩，其可抑制菌丝生长，对青霉具有良好的抑制效果。
实施例3：利用枯草芽孢杆菌FJAT-5561进行豆粕高温固态发酵
A、所述枯草芽孢杆菌FJAT-5561的培养方法，步骤如下：
(1)将枯草芽孢杆菌FJAT-5561划线接种于LB固体培养基，45℃-55℃活化培养24-30h，制得活化菌株；
(2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于LB液体培养基中，45℃-55℃、160-220rpm振荡培养18-20h，制得种子液；
(3)将步骤(2)制得的种子液按体积百分比3％-5％的接种量接种至液体培养基中，45℃-55℃培养8h，制得接种菌剂。
B、所述枯草芽孢杆菌FJAT-5561制备发酵豆粕，步骤如下：
(1)发酵豆粕豆粕培养基配比如下：2500g豆粕培养基中添加250g的麸皮，调整含水量至50％，豆粕不需要灭菌；
(2)按10％的接种量(V/V)加入活化后的菌液，30℃-35℃发酵7d，完成发酵。添加枯草芽孢杆菌FJAT-5561发酵豆粕，发酵至第2天时，温度高达50℃。发酵7天后，豆粕中仍能分离到枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌是优势菌。
C、对照试验
以添加枯草芽孢杆菌FJAT-5561制备发酵豆粕为实验组，另设添加地衣芽孢杆菌FJAT-41343发酵豆粕为对照组，于发酵起始(0d)和发酵结束(7d)取样，分别进行粗纤维和真菌毒素的检测。饲料中粗纤维采用GB/T6434-2006标准检测，饲料中的黄曲霉素和玉米赤霉烯酮采用标准NY/T 2071-2011要求检测，脱氧雪腐镰刀菌烯醇和赭曲霉毒素按照GB/T30956-2014要求检测。
经对两组发酵豆粕的营养物质、真菌毒素和微生物分离鉴定的分析，结果发现添加枯草芽孢杆菌FJAT-5561发酵豆粕，发酵后物料中的粗纤维含量为4.2％(干重)，低于对照组的4.6％，降低了豆粕中难以利用的粗纤维含量。同时，添加枯草芽孢杆菌FJAT-5561发酵豆粕的发酵产物未检出黄曲霉素、赭曲霉毒、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镶刀菌烯醇等真菌毒素，也未分离出黄曲霉，而对照组检出赭曲霉毒素，添加枯草芽孢杆菌FJAT-5561发酵豆粕保障发酵饲料生物安全。
综上可知，本发明的枯草芽孢杆菌FJAT-5561具有耐高温的性能，其在30～55℃的高温环境下具有较高的产纤维素酶的能力，在碱性环境中，酶活性最高达0.90U/ml，适应于发酵饲料的生产。
本发明的枯草芽孢杆菌FJAT-5561该对青霉具有抑制效果，抑菌率达87.78％，且上清液稀释8倍后依然具有抑菌效果。扫描电镜观察结果同样证明FJAT-5561对青霉具有良好的抑制效果。
本发明的枯草芽孢杆菌FJAT-5561能够抑制真菌生长，添加枯草芽孢杆菌发酵豆粕的发酵产物未检出黄曲霉素、赭曲霉毒、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镶刀菌烯醇等真菌毒素，同时未分离出黄曲霉，因此，可保障发酵饲料生物安全；同时，发酵产物中的粗纤维含量为4.2％(干重)，低于对照组的4.6％，降低了豆粕中难以利用的粗纤维含量，提升了豆粕中的粗蛋白含量，增加了豆粕的营养价值。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。
序列表
<110> 福建省农业科学院农业生物资源研究所
<120> 一种耐高温产纤维素酶枯草芽胞杆菌及其培养方法和应用
<130> 100
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 680
<212> DNA
<213> （Bacillus subtilis）
<400> 1
gttacctcac cgacttcggg tgttacaaac tctcgtggtg tgacgggcgg tgtgtacaag 60
gcccgggaac gtattcaccg cggcatgctg atccgcgatt actagcgatt ccagcttcac 120
gcagtcgagt tgcagactgc gatccgaact gagaacagat ttgtgggatt ggcttagcct 180
cgcggcttcg ctgccctttg ttctgcccat tgtagcacgt gtgtagccca ggtcataagg 240
ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt cctccggttt gtcaccggca gtcaccttag 300
agtgcccaac tgaatgctgg caactaagat caagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc 360
caacatctca cgacacgagc tgacgacaac catgcaccac ctgtcactct gcccccgaag 420
gggaagccct atctctaggg ttgtcagagg atgtcaagac ctggtaaggt tcttcgcgtt 480
gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct tgtgcgggcc cccgtcaatt cctttgagtt 540
tcagtcttgc gaccgtactc cccaggcgga gtgcttaatg cgtttgctgc agcactaaag 600
ggcggaaacc ctctaacact tagcactcat cgtttacggc gtggactacc agggtatcta 660
atcctgttcg ctccccacgc 680
Claims (3)
1.一种耐高温产纤维素酶枯草芽胞杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)FJAT-5561，所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)FJAT-5561，于2021年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.24100。
2.根据权利要求1所述的一种耐高温产纤维素酶枯草芽胞杆菌的培养方法，其特征在于：所述方法步骤如下：
(1)将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)FJAT-5561划线接种于LB固体培养基，45℃-55℃活化培养24-30h，制得活化菌株；
(2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于LB液体培养基中，45℃-55℃、160-220rpm振荡培养18-20h，制得种子液；
(3)将步骤(2)制得的种子液按体积百分比3％-5％的接种量接种至液体培养基中，45℃-55℃培养8h，制得接种菌剂。
3.根据权利要求1所述的一种耐高温产纤维素酶枯草芽胞杆菌制备发酵豆粕的方法，其特征在于：发酵步骤如下：
(1)发酵豆粕培养基配比如下：往豆粕中添加其重量量8％-12％麸皮，调整含水量至45-50％；
(2)按8-12％的接种量(V/V)加入活化后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FJAT-5561菌液，30-35℃发酵7d，完成发酵。
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