CN108004145B - 一种黑木耳破壁方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物及农产品加工领域，具体而言，涉及一种黑木耳破壁方法，包括：将黑木耳与暹罗芽孢杆菌酶液共孵育，酶解破壁；所述暹罗芽孢杆菌菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.12903；保藏时间为：2016年8月24日。本发明利用筛选到的暹罗芽孢杆菌对黑木耳子实体进行破壁，促使多糖等有效成分从细胞内溶出，提高黑木耳生物吸收利用率。

Description

一种黑木耳破壁方法

技术领域

本发明涉及微生物及农产品加工领域，具体而言，涉及一种黑木耳破壁方法。

背景技术

黑木耳(Auricularia auricula-judae)又称木耳、耳子、光木耳，属真菌门担子菌纲，营养极为丰富，被誉为“人体清道夫”和“食品阿司匹林”。是我国珍贵的药食胶质真菌，在我国多数地区都有生产，年产量占世界总产量90％以上。

现代医学已经证实黑木耳具有抗凝血、抗肿瘤、抗炎症等细胞保护作用，还具有降低血脂、血糖、血液粘稠、胆固醇以及抗糖尿病、抗衰老、抗辐射、抗疲劳等多种生理功能，同时还能促进核酸、蛋白质的生物合成并预防多种老年性疾病。近年来已经成为食品、医疗、保健等领域研究和开发应用的热点。但是，由于黑木耳子实体细胞壁较厚，其关键组分几丁质及少量葡聚糖结构复杂，使其质地异常坚韧，破壁难度远远大于植物细胞、细菌细胞等，人体消化吸收效果较差。有研究表明，通常情况下，食用木耳的吸收利用率只有40％左右，只有通过破壁，才可以大幅度提高黑木耳在人体内的吸收率及生物利用度。

目前木耳破壁的方法主要有：机械法、酸碱法、酶解技术等。采用机械法、酸碱法破壁，设备投资大，对环境污染严重，运行成本高，破壁不完全。而采用酶解破壁的方法，由于黑木耳细胞壁结构非常复杂，尚缺乏专一性的酶。如需要破壁完全，常需要使用多种酶：如溶菌酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、果胶酶和纤维素酶等，导致成本高、工艺复杂。因此，寻找一种更简单、更有效、成本更低的黑木耳破壁的方法，是很有意义的。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

为了克服黑木耳子实体细胞壁坚固，食用后吸收利用率低的不足，本发明的目的是提供一株具有分泌几丁质酶能力的暹罗芽孢杆菌及其在黑木耳破壁方面的应用，从而促使黑木耳子实体中的营养成分充分溶出，大幅度提高黑木耳的生物利用率。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

本发明涉及一种黑木耳破壁方法，包括：

将黑木耳与暹罗芽孢杆菌酶液共孵育，酶解破壁；

所述暹罗芽孢杆菌菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.12903；保藏时间为：2016年8月24日。

该菌种拉丁学名为Bacillus siamensis，中文学名为暹罗芽孢杆菌，菌株名为JAASHD，从吉林省水稻主产区健康仔猪的新鲜粪样中分离获得。

上述的经过分离纯化的暹罗芽孢杆菌，采用LB培养基，恒温37℃培养时间24小时，镜检菌体呈杆状，直径大约为0.5～0.6μm×1.3～2.9μm；平板生长出菌落呈奶白色，圆形，微凸，湿润光滑，边缘整齐。

另外，对于该菌株，经过纯化后测序，其16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

优选的，如上所述的黑木耳破壁方法，所述暹罗芽孢杆菌酶液的制备方法包括：

将暹罗芽孢杆菌发酵液离心，取上清液即得。

优选的，如上所述的黑木耳破壁方法，所述暹罗芽孢杆菌发酵液为将所述暹罗芽孢杆菌接种于发酵培养基培养得到，所述发酵培养基为LB培养基；

优选的，如上所述的黑木耳破壁方法，所述LB培养基的成分包括：蛋白胨8～12g/L、酵母粉2～4g/L、氯化钠4～6g/L、葡萄糖2～4g/L；pH＝6.2～7.0。

优选的，如上所述的黑木耳破壁方法，将所述暹罗芽孢杆菌接种于发酵培养基培养的培养条件为：

35℃～42℃，摇床150～240rpm，OD₆₀₀值0.8～1.0时终止培养。

优选的，如上所述的黑木耳破壁方法，所述暹罗芽孢杆菌酶液的制备方法还包括，将所述上清液过滤除菌。

优选的，如上所述的黑木耳破壁方法，所述黑木耳磨成粉后再与所述暹罗芽孢杆菌酶液共孵育。

优选的，如上所述的黑木耳破壁方法，所述暹罗芽孢杆菌发酵液中活菌数≥2亿/mL。

优选的，如上所述的黑木耳破壁方法，所述黑木耳与所述暹罗芽孢杆菌酶液的添加比例为10～30g：100mL。

优选的，如上所述的黑木耳破壁方法，所述酶解的条件为36℃～38℃酶解24h～48h。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

该暹罗芽孢杆菌菌株对于黑木耳子实体具有很好的破壁效果，同时，具有操作简单、成本低、工艺稳定、设备投入少等优势，有利于工业化生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为暹罗芽孢杆菌JAASHD系统发育树。

本申请提供的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)，菌株名为JAASHD，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏时间为：2016年8月24日，保藏编号CGMCC NO.12903。经保藏中心于2016年8月24日检测为存活菌株。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

1、菌株初筛

采集吉林省各地健康仔猪新鲜粪样10份，分别称取10g样品，加入90mL无菌生理盐水，制备成样品悬液，经80℃水浴处理后，取100μL10^-2、10^-3、10^-4稀释液涂布于LB培养基平板上，每个梯度涂布三个平行，恒温37℃培养48小时，然后采用平板划线法，纯化芽孢杆菌菌株，分别编号保存。获得122株芽孢杆菌。

2、产几丁质酶芽孢杆菌初步筛选

将分离得到的菌株点种到上述以几丁质粉为唯一碳源的分离平板上，37℃培养16～48小时，如果生长出的菌落周边出现透明水解圈，说明培养基中几丁质已经被菌株分泌的酶水解，进而证明菌株具有分泌几丁质酶的能力。

经过初步筛选，得到4株具有几丁质酶分泌能力的菌株，对其进行进一步筛选分析。

3、黑木耳破壁菌的进一步筛选

将上述分离得到4株具有几丁质酶分泌能力的菌株点种到上述以黑木耳粉为唯一碳源的分离平板上，37℃培养16～48小时，如果生长出的菌落周边出现透明水解圈，说明培养基中黑木耳粉已经被菌株分泌的酶水解，进而证明菌株具有黑木耳破壁的能力。

4、黑木耳破壁能力检测

采用上述菌株的菌悬液或发酵液粗提物处理黑木耳粉，以可溶性物质含量作为破壁效果的评价指标，筛选出破壁能力强的菌株。

经过进一步筛选及破壁能力检测，得到1株具有较好黑木耳破壁能力的菌株，命名为JAASHD，并对其进行进一步鉴定。

5、菌株鉴定

按照“伯杰细菌鉴定手册”(第八版)和“常见细菌系统鉴定手册”(东秀珠，蔡妙英等编著，北京：科学出版社，2001.2)中描述菌种分类鉴定的方法，对菌株JAASHD进行形态特征、培养特性和生理生化特性鉴定，具体结果如下：

采用LB培养基，恒温37℃培养时间24小时，镜检菌体呈杆状，直径大约为0.5～0.6μm×1.3～2.9μm；平板生长出菌落呈奶白色，圆形，微凸，边缘整齐。生理生化特征：结果如表1、2所示。

表1暹罗芽孢杆菌JAASHD生理生化试验

特性指标	结果	特性指标	结果
				氧化酶	+	三丁酸甘油脂水解	-
精氨酸双水解酶	-	硝酸盐还原	-
				明胶水解	+	七叶灵水解	+
淀粉水解	+	酪素水解	+
				过氧化氢酶	+	Tween80水解	-
吲哚实验	-	柠檬酸利用	-
				脲酶	-	H<sub>2</sub>S生成	-
VP实验	+	厌氧生长	+
				10％NaCl	+	50℃生长	+
14％NaCl	+	pH4.5生长	-
				55℃生长	+

备注：-表示阴性反应；+表示阳性反应，+-表示弱阳性反应。

表2暹罗芽孢杆菌JAASHD糖发酵试验

检测项目	结果	检测项目	结果
				甘油	+	七叶灵	+
D-阿拉伯糖	-	水杨苷	+
				D-核糖	+	D-纤维二糖	+
D-木糖	+	D-麦芽糖	+
				D-葡萄糖	+	D-乳糖	+
D-果糖	+	D-蜜二糖	-
				肌醇	+	D-蔗糖	+
甘露醇	+	D-松三糖	+
				山梨醇	+	D-棉籽糖	+
α-甲基-D-葡萄糖苷	+	淀粉	+
				N-乙酰葡糖胺	+	糖原	+
苦杏仁苷	+	D-龙胆二糖	+
				海藻糖	-	松二糖	-
熊果苷	+	L-阿拉伯醇	+-

备注：-表示阴性反应；+表示阳性反应，+-表示弱阳性反应。

6、分子生物学特性

提取JAASHD的总DNA，以其为模板，利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，得到长度约为1.5kb的扩增产物，将扩增产物回收，委托上海生工生物工程技术服务有限公司测序公司进行测序。测得的序列如SEQ ID NO:1所示。

将测序结果与Gen-Bank序列同源性比较，然后用软件MEGA5.0构建系统发育树(如图1所示)，以确定菌株的种属关系。同源性分析结果表明，菌株JAASHD与Bacillusssiamensis strain PD-A10(GenBank登录号NR_117274.1)同源性为99％，并处于系统发育树同一分支。

基于菌体形态特征、生长条件、生理生化、16S rDNA鉴定结果特征，将菌株JAASHD鉴定为Bacilluss siamensis。建议的分类命名为暹罗芽孢杆菌；该菌株已于2016年8月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.12903。

实施例2暹罗芽孢杆菌JAASHD破壁黑木耳粉的制备

粗酶液制备：

将菌株JAASHD接种于LB液体发酵培养基，置于35℃摇床，240rpm，摇到OD₆₀₀值0.8取出。在6000rpm条件下离心20min，弃沉淀，上清液在0.22um条件下过滤，即得粗酶液。

所述LB液体发酵培养基的成分为：蛋白胨12g/L、酵母粉2g/L、氯化钠4g/L、葡萄糖2g/L，去离子水1000mL；pH＝6.2。121℃高压灭菌20min。

对黑木耳子实体破壁：

将黑木耳粉按10％(w/v)加入粗酶液，轻轻摇匀后，36℃～38℃静止酶解24h后烘干，制得破壁的黑木耳粉。

实施例3暹罗芽孢杆菌JAASHD破壁黑木耳粉的制备

粗酶液制备：

将菌株JAASHD接种于LB液体发酵培养基，置于42℃摇床，150rpm，摇到OD₆₀₀值1.0取出。在10000rpm条件下离心15min，弃沉淀，上清液在0.22um条件下过滤，即得粗酶液。

所述LB液体发酵培养基的成分为：蛋白胨8g/L、酵母粉4g/L、氯化钠6g/L、葡萄糖4g/L，去离子水1000mL；pH＝7.0。121℃高压灭菌20min。

对黑木耳子实体破壁：

将黑木耳粉按30％(w/v)加入粗酶液，轻轻摇匀后，36℃～38℃静止酶解48h后烘干，制得破壁的黑木耳粉。

实施例4暹罗芽孢杆菌JAASHD破壁黑木耳粉的制备

粗酶液制备：

将菌株JAASHD接种于LB液体发酵培养基，置于37℃摇床，200rpm，摇到OD₆₀₀值0.9取出。在8000rpm条件下离心20min，弃沉淀，上清液在0.22um条件下过滤，即得粗酶液。

所述LB液体发酵培养基的成分为：蛋白胨10g/L、酵母粉3g/L、氯化钠5g/L、葡萄糖3g/L，去离子水1000mL；pH＝6.8。121℃高压灭菌20min。

对黑木耳子实体破壁：

将黑木耳粉按20％(w/v)加入粗酶液，轻轻摇匀后，36℃～38℃静止酶解36h后烘干，制得破壁的黑木耳粉。

实验例暹罗芽孢杆菌JAASHD对黑木耳破壁能力的检测

1)按实施例4的方法制备得到粗酶液。准确称取1.00g黑木耳粉两份，一份加入100ml粗酶液摇匀，另一份加入100ml实施例4中的LB发酵培养基作为空白对照，37℃条件下保温60min，然后分别在8000rpm条件下离心20min。各取滤液20ml，分别在50～80℃烘干至恒重，以可溶性物质含量作为黑木耳破壁效果的评价标准。

计算方法为：可溶性物质含量(％)＝干重×5×100/黑木耳粉重量。

通过测定，加入空白培养基的对照可溶性物质含量为0.98％，而加入JAASHD菌株发酵滤液的可溶性物质含量达到62.83％，证明该菌株的代谢产物对黑木耳有很好的破壁效果。

2)准确称取1.00g黑木耳粉两份，一份加入100ml实施例4中的LB发酵培养基，并接入菌株JAASHD。另一份加入100ml实施例4中的LB发酵培养基做为空白对照。置于35～42℃摇床，150～240rpm，摇至OD600值0.8～1.0取出。分别在8000rpm条件下离心20min。各取滤液20ml，分别在50～80℃烘干至恒重，以可溶性物质含量作为黑木耳破壁效果的评价标准。

计算方法为：可溶性物质含量(％)＝干重×5×100/黑木耳粉重量。

通过测定，空白对照的可溶性物质含量为0.91％，而加入JAASHD菌株的样品可溶性物质含量达到60.76％，证明该菌株对黑木耳有很好的破壁效果。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 吉林省农业科学院

<120> 一种黑木耳破壁方法

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1508

<212> DNA

<213> Bacillus siamensis

<400> 1

agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60

ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120

cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga 180

accgcatggt tcagacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg 240

cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag 300

ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360

gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 420

cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt 480

gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540

gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct 600

gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca 660

gaagaggagg gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc 720

agtggcgaag gcgactctct ggtcggtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg 780

aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg 840

tttccgcccc ttagtgcggc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc 900

aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaac cggtggagca tgtggtttaa 960

ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatgc tctgccaatc ctagagatag 1020

gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc ccgtgtcgtg 1080

agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt 1140

tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc 1200

atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat gggcagaaca aagggcagcg 1260

aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac 1320

tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgctgcg gtgaatacgt 1380

tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt 1440

gaggtaatct ttatggagcc agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tgaagtcgta 1500

acaaggta 1508

Claims (10)

1.一种黑木耳破壁方法，其特征在于，包括：

将黑木耳与暹罗芽孢杆菌酶液共孵育，酶解破壁；

所述暹罗芽孢杆菌菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.12903；保藏时间为：2016年8月24日。

2.根据权利要求1所述的黑木耳破壁方法，其特征在于，所述暹罗芽孢杆菌酶液的制备方法包括：

将暹罗芽孢杆菌发酵液离心，取上清液即得。

3.根据权利要求2所述的黑木耳破壁方法，其特征在于，所述暹罗芽孢杆菌发酵液为将所述暹罗芽孢杆菌接种于发酵培养基培养得到，所述发酵培养基为LB培养基。

4.根据权利要求3所述的黑木耳破壁方法，其特征在于，所述LB培养基的成分包括：蛋白胨8～12g/L、酵母粉2～4g/L、氯化钠4～6g/L、葡萄糖2～4g/L；pH＝6.2～7.0。

5.根据权利要求3或4所述的黑木耳破壁方法，其特征在于，将所述暹罗芽孢杆菌接种于发酵培养基培养的培养条件为：

35℃～42℃，摇床150rpm～240rpm，OD₆₀₀值0.8～1.0时终止培养。

6.根据权利要求2所述的黑木耳破壁方法，其特征在于，所述暹罗芽孢杆菌酶液的制备方法还包括，将所述上清液过滤除菌。

7.根据权利要求1所述的黑木耳破壁方法，其特征在于，所述黑木耳磨成粉后再与所述暹罗芽孢杆菌酶液共孵育。

8.根据权利要求2所述的黑木耳破壁方法，其特征在于，所述暹罗芽孢杆菌发酵液中活菌数≥2亿/mL。

9.根据权利要求8所述的黑木耳破壁方法，其特征在于，所述黑木耳与所述暹罗芽孢杆菌酶液的添加比例为10～30g：100mL。

10.根据权利要求9所述的黑木耳破壁方法，其特征在于，所述酶解的条件为36℃～38℃酶解24h～48h。

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