CN105420159B - 一种热凝胶多糖菌株及其应用 - Google Patents

一种热凝胶多糖菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种热凝胶多糖菌株及其应用，热凝胶多糖菌株为土壤杆菌(Agrobacterium sp.)DH‑2，保藏编号为CGMCC No.11546，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。将土壤杆菌(Agrobacterium sp.)DH‑2经种子培养和液体深层发酵，即得。本发明提供的热凝胶多糖产生菌株高产、稳定，所得热凝胶多糖的凝胶强度高、口感好，可用于食品工业。

Description

一种热凝胶多糖菌株及其应用
技术领域
本发明属于菌株及其应用领域，特别涉及一种热凝胶多糖菌株及其应用。
背景技术
热凝胶多糖是一种由微生物产生的胞外多糖，由葡萄糖残基通过β-1,3糖苷键连接而成的葡聚糖，具有受热形成凝胶的特性。热凝胶多糖形成的胶不仅具有很强的热稳定性，而且具有冻融稳定性，能耐受多轮冻融处理仍保持稳定的结构，可作为食品固型剂、增稠剂、可食性膜等，也可作为功能性物质改善食品的粘弹性和适口性等品质。作为一种安全的多糖，热凝胶多糖已被美国食品和药品管理局(FDA)批准可用作食品添加剂，在食品工业有着广阔的应用前景。热凝胶多糖还具有重要的药理性能，磺酸化的热凝胶多糖具有抗HIV病毒的活性，在制药工业具有巨大的市场潜力。
目前热凝胶多糖工业化生产在日本已获得成功，我国相关生产和研究尚处于起步阶段。我国近些年虽在热凝胶多糖产生菌种和发酵工艺方面取得了一些进展，提高了热凝胶多糖的产量，但所生产的热凝胶多糖凝胶强度仍较低，产品性能差，在市场上缺乏竞争力。目前我国所需热凝胶多糖主要从日本进口。
热凝胶多糖产生菌种主要有土壤杆菌属、根瘤菌属和纤维单胞菌属等属的细菌,产生菌种类较少。菌种产热凝胶多糖的量和多糖的凝胶强度间无相关性。有的菌种热凝胶多糖产量高，但凝胶性差，凝胶强度低；有的菌种产热凝胶多糖凝胶强度高，但产量低。目前的研究注重通过菌种选育和工艺优化提高产量，而很少结合凝胶特性进行选育菌种和优化工艺，使得产品的性能不能满足应用需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种热凝胶多糖菌株及其应用，本发明提供的热凝胶多糖产生菌株高产、稳定，所得热凝胶多糖的凝胶强度高、口感好，可用于食品工业。
本发明的一种热凝胶多糖菌株，所述热凝胶多糖菌株为土壤杆菌(Agrobacteriumsp.)DH-2，保藏编号为CGMCC No.11546，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的一种如权利要求1所述的热凝胶多糖菌株的应用，包括：
将土壤杆菌(Agrobacterium sp.)DH-2为出发菌株，经种子培养和液体深层发酵，得到发酵液，分离提纯，干燥，得热凝胶多糖；
其中种子培养的条件为，在种子培养基中培养，温度为28-30℃，摇床转速180-200rpm，培养时间16-20h；液体深层发酵的条件为：在发酵培养基中培养，温度为28℃-30℃，接 种量3％-10％(v/v)，摇床转速200-240rpm，培养时间3d-5d。
所述种子培养基的组分为：蔗糖20g/L、(NH)2HPO43g/L、KH2PO41g/L、MgSO4.7H2O0.5g/L、酵母提取物1g/L、CaCO33g/L，pH＝6.8-7.2。
所述发酵培养基的组分为：碳源60g/L、(NH)2HPO42.3g/L、KH2PO41g/L、有机氮源1g/L、MgSO4.7H2O 0.5g/L、CaCO33g/L，pH＝6.8-7.2。
所述碳源为葡萄糖和/或蔗糖；有机氮源为酵母提取物和/或玉米浆。
所述分离提纯具体为：将发酵液于4000-5000rpm离心3-5min，去除上清液，再加水补充至原体积，然后按体积比1:1加入0.6M NaOH溶液，搅拌均匀，静止放置0.5-1h，然后于9000-10000rpm离心5-10min，取上清液，加入0.1-0.3M HCl调pH值为中性；然后用80目滤布进行过滤，所得固形物中再加入1-2倍体积的水，再过滤，过滤得到的固形物中加入2-3倍体积的95％乙醇，搅匀后于7000-9000rpm离心5-10min。
所述干燥温度为50-60℃。
所述热凝胶多糖的纯度为88-92％(w/w)，分子量为1.8×106-2.0×106Da。
2％(w/v)热凝胶多糖95℃加热10min的凝胶强度是680-860g/cm2。
土壤杆菌的筛选方法是从土壤中采用平板菌落特征初筛，摇瓶发酵复筛，经测定热凝胶多糖产量和凝胶强度而得到。
筛选平板培养基(g/L)：10g葡萄糖，5g酵母提取物，0.05g苯胺蓝，20g琼脂，pH7.2.30℃培养2～3d。
挑选筛选平板上蓝色的菌落，接种于发酵培养基中，30℃培养4d后，取发酵液95℃加热10分钟，观察能否形成凝胶。对能形成凝胶的发酵液提取其热凝胶多糖。
热凝胶多糖产量的测定方法：取一定量发酵液于5000rpm离心5min，去除上清液，再加水补充至原体积。然后按体积比1:1加入0.6M NaOH溶液，搅拌均匀，静止放置1h。然后于9000rpm离心10min，取上清液，加入0.3M HCl调pH值为中性。然后用80目滤布进行过滤，所得固形物中再加入2倍体积的水，再过滤，过滤得到的固形物中加入3倍体积的95％乙醇，搅匀后于9000rpm离心10min，取沉淀放入烘箱中60℃干燥。
凝胶强度测定方法：取0.3g样品于15mL水中，用高速搅拌机使样品在水中分散均匀，制成悬浮液，将悬浮液转移至18mm×180mm的试管中，在真空状态下抽气3min，然后将试管放入95℃水中加热10min，取出后在冷水中冷却30min。从试管中取出凝胶，取离底部20mm和30mm处的一段10mm的凝胶，用质构仪进行测定(探头：P5，直径0.5cm不锈钢活塞式圆柱体。探头移动速度：250mm/min)。
本发明的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)DH-2，已于2015年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所），菌种保藏号为CGMCC No.11546。
有益效果
本发明提供了一株热凝胶多糖高产菌，该菌种摇瓶发酵4d，热凝胶多糖产量可达29.5g/L。热凝聚多糖纯度为88-92％(w/w)，分子量为1.8×106-2.0×106Da。95℃加热10min，2％(w/v)热凝胶多糖的凝胶强度为680～860g/cm2。本发明提供的热凝胶多糖产生菌株高产、稳定，所得热凝胶多糖的凝胶强度高、口感好，可用于食品工业。
附图说明
图1热凝胶多糖的1H NMR图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
菌株的筛选
(1)称取土样10g放入三角瓶中，加入90mL无菌水和少量玻璃珠，摇床振荡10min，制成土壤悬浊液。
(2)土壤悬浊液静置10min后，取0.1mL加入到0.9mL无菌生理盐水中，经系列梯度稀释至10-4、10-5、10-6三个梯度，分别取0.1mL涂筛选平板。
(3)将平板置于30℃培养箱倒置培养2-3d后观察。
(4)挑选菌落变蓝且颜色较深的菌落在平板上划线，取单菌落保藏。将平板上挑取的菌株接种到发酵培养基中进行摇瓶发酵复筛，培养条件为30℃、240rpm、4d。
(5)取发酵液于95℃水浴加热10min，观察能否形成凝胶。对能形成凝胶的发酵液提取其凝胶多糖，测定热凝胶多糖含量和凝胶强度。最终得到一株产量高、凝胶强度大、性能稳定的菌株DH-2。
筛选平板培养基组成(g/L)：10g葡萄糖，5g酵母提取物，0.05g苯胺蓝，20g琼脂，pH7.2.
发酵培养基组成(g/L)：蔗糖60、(NH)2HPO42.3、KH2PO41、MgSO4.7H2O 0.5、酵母提取物1、CaCO33、pH＝7.0。
实施例2
分离菌株DH-2的鉴定
⑴形态鉴定
在LB平板培养1d，菌落灰白色，圆形凸起，φ1mm,表面光滑，边缘整齐。显微镜下菌体呈细杆状，革兰氏染色阴性。
⑵生理生化鉴定
菌株DH-2的生理生化特征见表1.
表1菌株DH-2生理生化特征
项目 特征 项目 特征 项目 特征
葡萄糖发酵 + 利用淀粉 － 吲哚 －
蔗糖发酵 － 苯丙氨酸 － H<sub>2</sub>S －
麦芽糖发酵 + 鸟氨酸 － 明胶液化 +
木糖发酵 + 赖氨酸 － 硝酸盐还原 －
乳糖发酵 － 精氨酸 + 葡萄糖产气 －
甘露醇发酵 － 七叶苷 － 尿素 －
半乳糖发酵 － 西蒙氏柠檬酸盐 － 运动性 +
果糖发酵 － β-半乳糖苷酶 － 氧化酶 +
其中，“+”表示呈阳性反应，“-”表示呈阴性反应。
⑶16SrDNA序列鉴定
提取菌株DH-2的总基因组DNA，并以此为模板，扩增该菌株的16S rDNA序列，其引物序列为SEQ ID No.1，F:5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'，SEQ ID No.2，R:5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'SEQ ID No.3。将测得的16S rDNA序列在NCBI数据库中进行相似性比对，发现DH-2菌株与土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)的细菌最为接近。
结合该菌株的形态、生理生化特征及16S rDNA序列，最终判定菌株DH-2应属于土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)的一种，命名为Agrobacterium sp.DH-2。此菌株于2015年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNo.11546。
实施例3
从斜面上刮取一环菌种(土壤杆菌(Agrobacterium sp.)DH-2)，接种于装有30ml种子培养基的250ml三角瓶中，30℃，200r/min，摇床培养20h，得到种子液。取种子液以10％的接种量接入装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶中，于30℃、240r/min摇床培养4d。
种子培养基(g/L)：蔗糖20、(NH)2HPO43、KH2PO41、MgSO4.7H2O 0.5、酵母提取物1、CaCO33、pH＝7.0。
发酵培养基(g/L)：蔗糖60、(NH)2HPO42.3、KH2PO41、MgSO4.7H2O 0.5、酵母提取物1、CaCO33、pH＝7.0。
取发酵液于5000rpm离心5min，去除上清液，再加水补充至原体积。然后按体积比1:1加入0.6M NaOH溶液，搅拌均匀，静止放置1h。然后于9000rpm离心10min，取上清液，加入0.3M HCl调pH值为中性。然后用80目滤布进行过滤，所得固形物中再加入2倍体积的水，再过滤，过滤得到的固形物中加入3倍体积的95％乙醇，搅匀后于9000rpm离心10min，取沉淀放入烘箱中60℃干燥。热凝胶多糖产量为29.5g/L。
实施例4
从斜面上刮取一环菌种(土壤杆菌(Agrobacterium sp.)DH-2)，接种于装有30ml种子培养基的250ml三角瓶中，28℃，200r/min，摇床培养16h，得到种子液。取种子液以5％的接种量接入装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶中，于28℃、200r/min摇床培养5d。
种子培养基(g/L)：蔗糖20、(NH)2HPO43、KH2PO41、MgSO4.7H2O 0.5、酵母提取物1、CaCO33、pH＝7.0。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖60、(NH)2HPO42.3、KH2PO41、MgSO4.7H2O 0.5、玉米浆1、CaCO33、pH＝7.0。
取发酵液于5000rpm离心5min，去除上清液，再加水补充至原体积。然后按体积比1:1加入0.6M NaOH溶液，搅拌均匀，静止放置1h。然后于10000rpm离心10min，取上清液，加入0.1M HCl调pH值为中性。然后用80目滤布进行过滤，所得固形物中再加入2倍体积的水，再过滤，过滤得到的固形物中加入3倍体积的95％乙醇，搅匀后于7000rpm离心10min，取沉淀放入烘箱中60℃干燥。热凝胶多糖产量为24.5g/L。
实施例5
从斜面上刮取一环菌种(土壤杆菌(Agrobacterium sp.)DH-2)，接种于装有30ml种子培养基的250ml三角瓶中，30℃，190r/min，摇床培养18h，得到种子液。取种子液以3％的接种量接入装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶中，于30℃、240r/min摇床培养3d。
种子培养基(g/L)：蔗糖20、(NH)2HPO43、KH2PO41、MgSO4.7H2O 0.5、酵母提取物1、CaCO33、pH＝7.0。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖60、(NH)2HPO42.3、KH2PO41、MgSO4.7H2O 0.5、玉米浆0.2、酵母提取物0.8、CaCO33、pH＝7.0。
取发酵液于5000rpm离心5min，去除上清液，再加水补充至原体积。然后按体积比1:1加入0.6M NaOH溶液，搅拌均匀，静止放置1h。然后于10000rpm离心5min，取上清液，加入0.3M HCl调pH值为中性。然后用80目滤布进行过滤，所得固形物中再加入2倍体积的水，再过滤，过滤得到的固形物中加入3倍体积的95％乙醇，搅匀后于9000rpm离心5min，取沉淀放入烘箱中60℃干燥。热凝胶多糖产量为18.6g/L。
实施例6
从斜面上刮取一环菌种(土壤杆菌(Agrobacterium sp.)DH-2)，接种于装有30ml种子培养基的250ml三角瓶中，28℃，180r/min，摇床培养20h，得到种子液。取种子液以8％的接种量接入装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶中，于30℃、220r/min摇床培养4d。
种子培养基(g/L)：蔗糖20、(NH)2HPO43、KH2PO41、MgSO4.7H2O 0.5、酵母提取物1、CaCO33、pH＝7.0。
发酵培养基(g/L)：蔗糖3、葡萄糖3、(NH)2HPO42.3、KH2PO41、MgSO4.7H2O 0.5、酵母提取物1、CaCO33、pH＝7.0。
取发酵液于5000rpm离心5min，去除上清液，再加水补充至原体积。然后按体积比1:1加入0.6M NaOH溶液，搅拌均匀，静止放置1h。然后于9000rpm离心10min，取上清液，加入0.2M HCl调pH值为中性。然后用80目滤布进行过滤，所得固形物中再加入2倍体积的水，再过滤，过滤得到的固形物中加入3倍体积的95％乙醇，搅匀后于7000rpm离心10min，取沉淀放入烘箱中60℃干燥。热凝胶多糖产量为27.8g/L。
实施例7
热凝胶多糖的性质：
用苯酚-硫酸法测定热凝胶多糖的纯度为88～92％，用乌式粘度计测定该多糖的分子量为1.8×106～2.0×106Da。热凝胶多糖的1H NMR图谱见图1，表明该多糖是由葡萄糖通过β-1,3糖苷键连接聚合而成。95℃加热10min，2％(w/v)热凝胶多糖的凝胶强度为680～860g/cm2。6％(w/v)热凝胶多糖形成的凝胶TPA分析结果见表2，与市售进口产品相比， 该菌株产生的热凝胶多糖略好于市售产品，形成的凝胶咀嚼性较好。
表2 6％凝胶的TPA分析

Claims (9)

1.一种热凝胶多糖菌株，其特征在于：所述热凝胶多糖菌株为土壤杆菌(Agrobacterium sp.)DH-2，保藏编号为CGMCC No.11546，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其中所述热凝胶多糖菌株产热凝胶多糖的纯度为88-92％(w/w)，分子量为1.8×106-2.0×106Da，2％(w/v)热凝胶多糖95℃加热10min的凝胶强度是680-860g/cm2。
2.一种如权利要求1所述的热凝胶多糖菌株的应用，包括：
将土壤杆菌(Agrobacterium sp.)DH-2经种子培养和液体深层发酵，得到发酵液，分离提纯，干燥，得到热凝胶多糖；
其中种子培养的条件为，在种子培养基中培养，温度为28-30℃，摇床转速180-200rpm，培养时间16-20h；液体深层发酵的条件为：在发酵培养基中培养，温度为28℃-30℃，接种量3％-10％(v/v)，摇床转速200-240rpm，培养时间3d-5d。
3.根据权利要求2所述的一种热凝胶多糖菌株的应用，其特征在于：所述种子培养基的组分为：蔗糖20g/L、(NH)2HPO4 3g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4.7H2O 0.5g/L、酵母提取物1g/L、CaCO3 3g/L，pH＝6.8-7.2。
4.根据权利要求2所述的一种热凝胶多糖菌株的应用，其特征在于：所述发酵培养基的组分为：碳源60g/L、(NH)2HPO4 2.3g/L、KH2PO4 1g/L、有机氮源1g/L、MgSO4.7H2O 0.5g/L、CaCO3 3g/L，pH＝6.8-7.2。
5.根据权利要求4所述的一种热凝胶多糖菌株的应用，其特征在于：所述碳源为葡萄糖和/或蔗糖；有机氮源为酵母提取物和/或玉米浆。
6.根据权利要求2所述的一种热凝胶多糖菌株的应用，其特征在于：所述分离提纯具体为：将发酵液于4000-5000rpm离心3-5min，去除上清液，再加水补充至原体积，然后按体积比1:1加入0.6M NaOH溶液，搅拌均匀，静止放置0.5-1h，然后于9000-10000rpm离心5-10min，取上清液，加入0.1-0.3M HCl调pH值为中性；然后用80目滤布进行过滤，所得固形物中再加入1-2倍体积的水，再过滤，过滤得到的固形物中加入2-3倍体积的95％乙醇，搅匀后于7000-9000rpm离心5-10min。
7.根据权利要求2所述的一种热凝胶多糖菌株的应用，其特征在于：所述干燥温度为50-60℃。
8.根据权利要求2所述的一种热凝胶多糖菌株的应用，其特征在于：所述热凝胶多糖的纯度为88-92％(w/w)，分子量为1.8×106-2.0×106Da。
9.根据权利要求2所述的一种热凝胶多糖菌株的应用，其特征在于：2％(w/v)热凝胶多糖95℃加热10min的凝胶强度是680-860g/cm2。
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