CN112662577A - 一组降解玉米秸秆产多糖的菌群及其微生物配比 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一组降解玉米秸秆(以下简称：秸秆)产多糖的菌群，属于固废处置技术领域。该混合菌群包括灰略红链霉菌、鲤链霉菌和娄彻氏链霉菌，接种量1∶1∶1。本发明的降解菌株分别命名为ye‑9、er‑72、se‑93，于中国微生物菌种保藏中心(CGMCC)保藏，保藏编号分别为是：18289、18290、18291，保藏日期：2019年7月24日。本发明从样品中初次筛选出单菌株，以纤维素全酶、内切酶、外切酶和β‑葡萄糖苷酶4种酶活性为指标，对初步筛选获得的单菌株进行复筛。对复筛得到的降解效果较好的菌株进行构建并测定酶活，挑选出高效的混合菌群。混合菌群降解秸秆的效果比单一菌株效果更好，优化发酵条件下多糖产量高达2159.23mg/L。为微生物降解秸秆提供基础并实现秸秆资源化利用。

Description

一组降解玉米秸秆产多糖的菌群及其微生物配比

技术领域

本发明属于固废处置技术领域，涉及一组菌群及其微生物配比，尤其是一组降解玉米秸秆(以下简称： 秸秆)产多糖的菌群及其微生物配比。

背景技术

我国玉米秸秆资源极其丰富，能够为人类提供大量糖原类物质，但由于其缺乏充分有效的利用而造成 资源的浪费，甚至导致环境污染。根据可持续发展战略，玉米秸秆资源的高效转化与利用是农业固体废弃 物处理与处置领域的一个重要内容。

玉米秸秆组分复杂，短时间内不易降解，利用物理化学法处理能耗高且污染环境，而生物降解相对于 物理化学方法来说，可以降低成本、减少污染。使用单一菌株降解秸秆相比混合菌群的降解效果较差，因 此构建一组高效稳定的降解秸秆的菌群对促进秸秆资源的转化和利用具有十分重要的意义。

秸秆降解产物主要是糖类物质，但是随着秸秆的降解，可溶性单糖同时被微生物消耗利用难以在发酵 液中积累，如何积累、收集秸秆降解产物是目前秸秆微生物降解领域的一个难题，多糖是微生物生长代谢 过程中的重要产物，也是重要的生命活性物质，除了具有很高的生命活性利用价值以外，还可以作为重要 的化工原料。更重要的是多糖在产生的同时不会马上被微生物消耗利用，可以在发酵液中积累。

发明内容

本发明的目的在于提供一组高效降解玉米秸秆产多糖的菌群。该菌群包括三株降解菌株，分类命名分 别为(Streptomyces carpaticus)ye-9、(Streptomycesgriseorubens)er-72、(Streptomyces rochei)se-93，于 中国微生物菌种保藏中心(CGMCC)保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号分别为是： CGMCCNO：18289、CGMCCNO：18290、CGMCCNO：18291，保藏日期：2019年7月24日。

本发明采用以下技术方案：

一组用于降解秸秆产多糖的混合菌群，包括灰略红链霉菌、鲤链霉菌和娄彻氏链霉菌，各种微生物的 含量比1∶1∶1。

上述用于高效降解秸秆产多糖菌群的制备方法，具体制备步骤如下：

(1)于天津理工大学采集土壤，置于4摄氏度冰箱保存。将秸秆烘干并粉碎至秸秆粉备用；

(2)向三角瓶中加入秸秆粉，121摄氏度灭菌40分钟，加入土壤，30摄氏度恒温培养20天；

(3)纤维素降解菌的初筛：取富集培养材料于装有无菌水的三角瓶中，振荡45分钟，取上清液，稀 释涂布到羧甲基纤维素钠固体培养基，30摄氏度恒温培养，观察菌落生长情况，将长出的菌落进行划线分 离。将分离出的菌株置于纤维素刚果红培养基30摄氏度恒温培养3天，测定透明圈直径，挑选出直径最 大的菌落，进一步划线分离纯化，将纯化后的单菌株编号后于保藏培养基上培养48小时后4摄氏度保藏。

(4)纤维素降解菌的复筛：初次筛选的菌种置于羧甲基纤维素钠液体培养基，2天后置于液体产酶培 养基，连续培养7天，取培养液离心10分钟，测定上清液中纤维素全酶、内切酶、外切酶和β-葡萄糖苷 酶的酶活。

(5)纤维素降解菌群的构建：从(4)中挑选出酶活性较高的菌株，将不同菌株按照1∶1比例接种于 产酶培养基中进行混合培养，连续培养7天，取培养液离心10分钟，测定上清液中纤维素全酶、内切酶、 外切酶和β-葡萄糖苷酶的酶活，并对比不同组合的菌群的酶活性，取酶活性最高的微生物组合作为所构建 的高效降解秸秆菌群。

(6)所述的纤维素内切酶与纤维素全酶的酶活力测定方法参照QB2583-2003，纤维素外切酶与β-葡 萄糖苷酶的酶活力测定方法参照中国农业科学院的殷中伟在《秸秆纤维素高效降解菌株与复合系的筛选鉴 定及其对秸秆降解效果研究》(2010)中提到的方法。

(7)上述培养基配方如下：

羧甲基纤维素钠固体培养基：1g/L NH₄NO₃，15g/L CMC-Na，1g/L KH₂PO₄，1g/L酵母膏，20g/L琼脂，0.5g/L七水硫酸镁，自然PH，121℃，灭菌20分钟；

羧甲基纤维素钠液体培养基：15g CMC-Na，1g NH₄NO₃，1g酵母膏，0.5g MgSO₄·7H₂O，1g KH₂PO₄， 1L蒸馏水，自然PH，121℃，灭菌20分钟；

产酶培养基：1.0g/L KH₂PO₄，0.1g/L NaCl，20g/L秸秆粉，0.3g/L MgSO₄·7H₂O，2.5g/L NaNO₃，0.01g/L FeCl₃，0.1g/L CaCl₂，PH为7.3；

保藏培养基：细菌、放线菌分别采用细菌基础培养基和高氏合成培养基一号。

本发明的优点是：

(1)从土壤中筛选出本发明所需的菌株，菌株来源广泛。

(2)本发明菌群的构建方法简单，将5株高效菌落按照1∶1比例进行构建，得到一个降解能力最高的 菌群为er-72、ye-9和se-93。

(3)本发明构建的菌群的纤维素降解酶活性高于单一菌株，其降解玉米秸秆的降解效率和多糖产量 高，多糖产量最高可达2159.23mg/L。

附图说明

图1-1是放线菌在CMC培养基上的效果图

图1-2是真菌在CMC培养基上的效果图

图1-3是细菌在CMC培养基上的效果图

图2-1是2株菌落组合的酶活

图2-2是3株菌落组合的酶活

图2-3是4、5株菌落组合的酶活

图3是纤维素、半纤维素和木质素含量变化趋势

图4-1是ye-9的形态观察结果

图4-2是er-72的形态观察结果

图4-3是se-93的形态观察结果

图5是多糖产量随时间变化曲线

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明实施过程作详尽描述，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述 的范围。

下列实施例中所用原料或制剂来源：

本试验所用的样品来自天津理工大学校园内土壤，将采集的土壤贮存于已灭菌的透明封口袋内，4℃ 冰箱中保存备用。将秸秆剪成段，烘干破碎，40目过筛，保存备用。

下述实施例中，所使用的方法均为常规方法，所用的试剂购自凯马特(天津)化工科技有限公司。

实施例1：降解秸秆产多糖降解菌的筛选以及菌群的构建

(1)富集

向250ml三角瓶中加入50g的秸秆粉，121℃灭菌40min，加入土样2g，30℃培养20天。

(2)纤维素降解菌的初筛

取1g(1)中的富集材料于盛有99ml无菌水的三角瓶中，恒温摇床振荡培养45分钟，转速为每分钟 120次，将上清液涂布到羧甲基纤维素钠固体培养基上，30℃恒温培养，待菌落长出，划线分离纯菌落。

将初次筛选的单菌株置于纤维素刚果红培养基，30℃培养3天，测定透明圈与菌落直径比值，选出比 值较大的菌株，进一步划线纯化，将纯化后的单菌株编号，于保藏培养基培养48小时，4℃保藏。

其中羧甲基纤维素钠固体培养基(g/L)配方为1g KH₂PO₄，15g CMC-Na，1g NH₄NO₃，1g酵母膏，20g 琼脂，0.5g MgSO₄·7H₂O；羧甲基纤维素钠液体培养基配方为1g酵母膏，15gCMC-Na，1g KH₂PO₄，1g NH₄NO₃，0.5g MgSO₄·7H₂O，1L蒸馏水；保藏培养基(g/L)：细菌、放线菌分别采用细菌基础培养基和 高氏合成培养基一号。

结果如下：

3天后挑选出有明显透明圈的菌株，菌株的降解效果如图1所示，分别为放线菌、真菌及细菌在CMC 固体培养基上的效果图。标准为透明圈直径与菌落直径之比大于2，挑选出比值大于2的单菌种有11株。

(3)纤维素降解菌的复筛

将初次筛选的菌株置于液体培养基上进行振荡培养，转速为每分钟120次，培养2天，置于液体产酶 培养基中连续培养7天，测定培养液中纤维素全酶、内切酶、外切酶和β-葡萄糖苷酶的酶活。其中纤维素 内切酶与纤维素全酶酶活性测定方法参照QB2583-2003，纤维素外切酶与β-葡萄糖苷酶的酶活性测定方法 参照中国农业科学院的殷中伟在《秸秆纤维素高效降解菌株与复合系的筛选鉴定及其对秸秆降解效果研 究》(2010)中提到的方法。其中液体产酶培养基(g/L)配方为0.01g FeCl₃，1g KH₂PO₄，0.1g NaCl，0.1g CaCl₂，20g秸秆粉，2.5g NaNO₃，0.3g MgSO₄·7H₂O，PH为7.3。

酶活性结果见表1。可知纤维素内切酶酶活性最高的菌株为ye-9、se-93，纤维素全酶酶活性最高的菌 株为yi-71、er-72，纤维素外切酶酶活性最高的菌株为y3、yi-71，纤维素β-葡萄糖苷酶酶活性最高的菌株 为ye-9、er-72。

表1不同菌种的产酶能力比较

(4)构建菌群的秸秆降解效率

从(3)中挑选出酶活性较高的菌株，将不同菌株按照1∶1比例接种于产酶培养基中进行混合培养，连 续培养7天，取培养液离心10分钟，取上清液测定纤维素全酶、内切酶、外切酶和β-葡萄糖苷酶的酶活， 并对比不同组合的菌群的酶活性，取酶活性最高的微生物组合作为所构建的高效降解菌群。

结果如图2所示，图2-1为2株菌落组合的酶活性，图2-2为3株菌落组合的酶活性，图2-3为4、5 株菌落组合的酶活性。由图可知菌株混合培养提高酶的活力，酶活性最高的菌群为er-72、ye-9、se-93。

(5)秸秆降解菌的鉴定

采用常规鉴定和分子生物学鉴定方法分别对(4)中酶活性最高的菌群中的菌株进行鉴定。常规鉴定 是将菌落置于固体培养基培养，观察其生长情况。挑取生长情况良好的菌落染色，用显微镜观察。分子生 物学鉴定交于北京三博远志生物技术有限公司。

菌株的形态特征如图4所示。ye-9菌株生长慢，1.5天后出现白色菌株，菌株致密且浑浊，如图4-1 所示，菌株外形为圆形，菌丝良好，孢子丝呈螺旋形；er-72生长较快，1天后出现白色菌株，2天后菌株 颜色由灰色变深灰色，菌落致密干燥且浑浊，如图4-2所示，菌株外形为圆形，菌丝弯曲；se-93生长快， 出现白色菌株，菌株致密干燥且浑浊，如图4-3所示，菌株外形为圆形，菌落颜色白色与乳黄色相间，菌 丝纤细，气丝绒状。初步认为上述三种菌株均为放线菌。

对基因产物进行测序并获得部分DNA序列，具体如下：

(1)ye-9的16S rRNA基因序列

(2)er-72的16S rRNA基因序列

(3)se-93的16S rRNA基因序列

序列相似度大于97％一般可认为是相同菌种，见表2可知，ye-9与鲤链霉菌同源度97％，er-72与灰 略红链霉菌同源度99％，se-93与娄彻氏链霉菌同源度99％。

表2菌种鉴定结果

实施例2：所构建菌群对玉米秸秆的降解效率

(1)玉米秸秆纤维素的定量测定

将玉米秸秆(以下简称：秸秆)烘干至恒重，向三角瓶中加入0.5g秸秆，再加入50mL产酶培养基， 将实施例1中构建的高效菌群置于羧甲基纤维素钠培养基中活化2天，转接于产酶培养基中30℃， 120r/min，培养8天，在第8天取出并测定失重率及秸秆各组分的含量。

(2)秸秆各组分含量的测定及变化趋势

用差重法测定秸秆中各组分(纤维素、半纤维素、木质素)的含量。

结果如下：

如图3和表3所示，秸秆三大组分的含量都逐步下降。秸秆中纤维素初始含量36.2％、半纤维素初始 含量25.5％、木质素初始含量16.2％。纤维素含量在第2d时下降到34.8％，第4d时下降到29.3％，到第 6d时下降到28.1％，到第8d时下降到27.5％，共降低了24.1％。半纤维素含量在整个培养过程共降低了 28.3％，木质素在培养过程中共降低了18.4％。

表3纤维素、半纤维素及木质素的占比

(3)培养基

上述培养基配方如下：

羧甲基纤维素钠液体培养基：15g CMC-Na，1g NH₄NO₃，1g酵母膏，0.5g MgSO₄·7H₂O，1g KH₂PO₄， 1L蒸馏水，自然PH，121℃，灭菌20分钟；

产酶培养基：1.0g/L KH₂PO₄，0.1g/L NaCl，20g/L秸秆粉，0.3g/L MgSO₄·7H₂O，2.5g/L NaNO₃，0.01g/L FeCl₃，0.1g/L CaCl₂，PH为7.3；

实施例3：测定构建菌群降解玉米秸秆产多糖的含量

多糖含量的测定方法采用3，5-二硝基水杨酸法(以下简称：DNS法)绘制葡萄糖标准曲线，对照标准 曲线求含糖量，具体步骤为：

(1)菌种活化

用接种环取菌株接种于50ml活化培养基中，30℃，120r/min活化48h。

其中活化培养基配方为：15g CMC-Na，1g酵母膏，1g NH₄NO₃，1g KH₂PO₄，0.5gMgSO₄，0.5g FeSO₄·7H₂O，20g琼脂，1000mL蒸馏水，自然PH。

(2)发酵液的处理

向三角瓶中加入秸秆发酵培养基50mL，121℃灭菌20min。然后向其接种4％(2ml)的(1)中所述 菌群悬浮液，30℃，120r/min培养2天。将培养液离心10min，8000r/min，取其上清液备用。

其中秸秆发酵培养基配方为：0.3g MgSO₄·7H₂O，2.5g NaNO₃，0.01g FeCl₃，0.1gCaCl₂，2g CaCO₃， 1.0g K₂HPO₄，0.1g NaCl，1L蒸馏水，20g 60目预处理秸秆，PH 7.3。

(3)总糖样品的制备

向1mL(2)中的发酵液中加入2mL 6mol/L HCl，沸水水浴30分钟后冷却，加少量酚酞指示剂，采用 氢氧化钠溶液进行中和，待液体颜色呈现微红色后，将其定容至5mL。

(4)测定多糖含量

还原糖样品为(2)中的上清液，将(2)中的1mL上清液及(3)中的1mL总糖样品分别加入比色管 中，用DNS法测定吸光度，对照标准曲线求还原糖量及总糖量，其中多糖的含量为总糖含量与还原糖含 量之差。

(5)发酵条件的优化方法

利用Minitab软件优化试验。

图5表示多糖含量的变化趋势，未接种菌群前，多糖含量低，接种菌群后，多糖产量大幅度增大，说 明菌群降解秸秆并产生多糖。多糖含量逐渐增长，当第7天时多糖产量达到最高为1079mg/L。利用软件 优化后，其最优条件为时间12.3天、秸秆含量50.4g/L，在以上条件下可预测得到产糖量为2146.9mg/L。

(6)多糖产量实验验证

按照(5)中的最优发酵条件进行培养，结果如下：

表14验证试验结果

实验验证的平均产量与实验预测产量基本一致，说明利用Minitab软件优化发酵条件是有效的。

Claims (7)

1.一组降解玉米秸秆(以下简称：秸秆)产多糖的菌群，其特征在于该混合菌群包括以下组分：灰略红链霉菌、鲤链霉菌和娄彻氏链霉菌，各组分按照1∶1∶1的接种量组合。

2.权利要求1所述的菌群的制备方法包括以下步骤：

(1)于天津理工大学采集土壤，置于4摄氏度冰箱保存。将秸秆制成秸秆粉备用；

(2)向三角瓶中加入秸秆粉，121摄氏度灭菌40分钟，加入土壤，30摄氏度恒温培养20天；

(3)纤维素降解菌的初筛：取(2)中的培养材料于三角瓶中，加入无菌水，振荡45分钟，静置，取其上清液，稀释涂布到羧甲基纤维素钠固体培养基，30摄氏度培养，观察菌落生长情况，将长出的菌落进行划线分离。将分离出的菌株置于纤维素刚果红培养基恒温培养3天，筛选出透明圈直径最大的菌落，进一步划线分离纯化，将纯化后的单菌株于保藏培养基上培养，48小时后4摄氏度保藏。

(4)纤维素降解菌的复筛：将初次筛选的菌株接种到羧甲基纤维素钠液体培养基中，2天后将菌悬液按照2％接种到液体产酶培养基中，连续培养7天，取培养液离心10分钟，测定上清液中纤维素全酶、内切酶、外切酶和β-葡萄糖苷酶的酶活。

(5)纤维素降解菌群的构建：从(4)中挑选出酶活性较高的菌株，将不同菌株按照1∶1比例接种于产酶培养基中进行混合培养，连续培养7天，取培养液离心10分钟，测定上清液中纤维素全酶、内切酶、外切酶和β-葡萄糖苷酶的酶活，并对比不同组合的菌群的酶活性，取酶活性最高的微生物组合作为所构建的高效降解秸秆菌群。

3.根据权利要求2所述的纤维素内切酶与纤维素全酶的酶活性测定方法参照QB2583-2003，纤维素外切酶与β-葡萄糖苷酶的酶活性测定方法参照中国农业科学院的殷中伟在《秸秆纤维素高效降解菌株与复合系的筛选鉴定及其对秸秆降解效果研究》(2010)中提到的方法。

4.根据权利要求2所述的降解秸秆产多糖混合菌群的构建方法，其特征在于：(3)中的羧甲基纤维素钠固体培养基配方为：15g/L CMC-Na，1g/L酵母膏，20g/L琼脂，0.5g/LMgSO₄·7H₂O，1g/L NH₄NO₃，1g/L KH₂PO₄，PH自然，121℃灭菌20分钟。

5.根据权利要求2所述的降解秸秆产多糖混合菌群的构建方法，其特征在于：(3)中的细菌、放线菌分别采用牛肉膏蛋白胨培养基和高氏一号培养基保藏。

6.根据权利要求2所述的降解秸秆多糖的菌群的构建方法，其特征在于：(4)中羧甲基纤维素钠液体培养基为15g CMC-Na，0.5g MgSO₄·7H₂O，1g NH₄NO₃，1g酵母膏，1g KH₂PO₄，1L蒸馏水，PH自然，121摄氏度灭菌20分钟。

7.根据权利要求2所述的降解秸秆多糖的菌群的构建方法，其特征在于：(5)中液体产酶培养基为20g/L秸秆粉，1.0g/L KH₂PO₄，0.01g/L FeCl₃，2.5g/L NaNO3，0.1g/L NaCl，0.1g/L CaCl₂，0.3g/L MgSO₄·7H₂O，PH为7.3。

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