CN102389022B

CN102389022B - 利用地衣芽孢杆菌降解羽毛制备菌肽复合蛋白饲料添加剂的方法

Info

Publication number: CN102389022B
Application number: CN 201110231644
Authority: CN
Inventors: 张桂敏; 龚一轩
Original assignee: Hubei University
Current assignee: HUBEI HUAYANG TECHNOLOGY DEVELOPMENT CO., LTD.
Priority date: 2011-08-11
Filing date: 2011-08-11
Publication date: 2013-04-24
Anticipated expiration: 2031-08-11
Also published as: CN102389022A

Abstract

本发明利用益生菌地衣芽孢杆菌CCTCC M208251具有降解羽毛活性并能以羽毛为唯一的碳源氮源进行生长的特点，提供了一种降解羽毛制备菌肽复合蛋白饲料的方法。工艺步骤为羽毛处理、种子液制备、底物配制、底物发酵、过滤、喷雾干燥等过程。本发明工艺简单，利废环保，节约资源，菌肽复合含量高，符合饲料安全。羽毛降解率可达80％。本发明不仅有效的处理了废料羽毛并且获得大量的可溶性蛋白小肽和益生菌，所得菌肽复合蛋白用于饲料添加，有很好的经济效益和社会效益。

Description

利用地衣芽孢杆菌降解羽毛制备菌肽复合蛋白饲料添加剂的方法

技术领域

本发明属废弃物资源化利用领域，特别是涉及具有降解羽毛活性的地衣芽孢杆菌菌株及其降解羽毛制备含益生菌蛋白饲料的方法。

背景技术

羽毛是鸟类和禽类表皮细胞角质化的衍生物，其中蛋白质含量高达90%。动物的大量消费产生许多羽毛废弃物，传统处理方法主要为填埋、焚烧，造成了羽毛蛋白资源的浪费。羽毛中蛋白主要是角蛋白，因含大量二硫键，交联成复杂的三维网状结构，具有良好的稳定性和难溶性，一般方法很难将其水解。目前理论的降解途径有物理降解法、化学降解法、酶降解法和微生物降解法。尽管物理、化学方法研究较早，但存在破坏氨基酸结构、产物单一以及产物稳定性差等缺点。用化学法酸水解更会对环境造成污染。用酶法处理是今后发展的方向，但是目前羽毛降解用酶因为生产成本过高，尚未工业化应用。利用微生物对废弃羽毛进行降解，已经有很多研究，如李金婷，路福平，李玉，王建玲，高效降解羽毛角蛋白菌株的筛选与鉴定，天津科技大学学报；又如专利可以降解羽毛的苏云金芽孢杆菌NJY1，专利编号200810155958.2。这些研究均是利用微生物降解羽毛，并研究发酵工艺，但是上述技术中所分离到的菌株不是已经产业化的益生菌，没有工业化生产并将降解产物和菌株一起用在饲料添加剂中。

益生菌被动物服用后，可调整菌群失调达到防病的目的，可促使机体产生抗菌活性物质、杀灭致病菌。能产生抗活性物质，并具有独特的生物夺氧作用机制，能抑制致病菌的生长繁殖。但目前益生菌的应用还没有涉及对废弃羽毛的降解与利用。利用地衣芽孢杆菌降解羽毛，不仅能使羽毛降解为多肽和氨基酸。同时地衣芽孢杆菌也能以废弃羽毛作为营养成分得到大量增殖，所得发酵产物是一种含益生菌蛋白饲料添加剂。一般益生菌生产方法是将发酵液喷成粉末。本方法同样是将发酵液加入淀粉添加剂后喷成粉末，产品中含有高菌体密度的地衣芽孢杆菌芽孢且含有可溶性蛋白寡肽，芽孢杆菌以芽孢形式存在，抗逆性强，保存时间长。

发明内容

本发明的目的是提出利用益生菌地衣芽孢杆菌具有降解羽毛活性并能以羽毛为唯一的碳源氮源进行生长的特点，提供了一种降解羽毛制备菌肽复合蛋白饲料的方法。

本发明采用的菌株是Bacillus licheniformis BSK4，该菌株在中国典型培养物保藏中心已经有保藏，保藏号为CCTCCM208251（由武汉科诺生物科技股份有限公司保藏生产）。该菌株是从市售的益生菌中筛选出来，具有能高效降解羽毛并能以羽毛为唯一的碳源氮源进行生长的特点。

该菌株在适当的发酵条件下可以高效的降解羽毛角蛋白，产生可溶性蛋白并完成自身菌体的快速增长。培养条件粗放，不易染杂菌，能较快的降解羽毛，菌酶均无毒。

本发明的工艺步骤为羽毛处理、种子液制备、底物配制、底物发酵、过滤、喷雾干燥等过程。具体工艺步骤如下：

1、收集羽毛，去除杂质，浸泡水洗压干2-3次，并将羽毛风干；再将羽毛放入0.02~0.05%的NaOH水溶液中，煮沸15min；滤去NaOH溶液，用自来水浸泡水洗压干2-3次，并将羽毛烘干保存备用；

2、将茄形瓶中保藏的CCTCCM208251菌种在固体LB平板上划线，使其活化；从上述LB平板中挑选单菌落接种于12~15瓶250mL锥形瓶中，瓶内含100mL液体LB培养基，放入摇床，在37℃、220rpm的条件下培养10h；分别从各瓶发酵液中取样并送镜检，选取无污染，生长旺盛的发酵液作为种子液；

3、按5~10 %的比例将上述一级种子发酵液接种至40L发酵罐中，罐内含25L 液体LB培养基，进行二级种子扩大培养，发酵7-8h，取样送镜检，将无污染的发酵液保留在发酵罐中备用，镜检结果见（图4）发酵初期镜检结果；

4、在400L的发酵罐中配制250L的发酵底物，并用108-110℃灭菌，发酵底物成分为：（w/v％）0.3%硝酸钾，0.1%磷酸氢二钾，0.06%磷酸二氢钾，0.04% (w/v)六水氯化镁，0.5% NaCl，2%羽毛，0.1％山梨醇，其余为水；另加（v/v%）0.5%豆油，0.5%聚醚用于消泡；将上述种子液接种至400L发酵罐内，按5~10 %的接种量接种进行分批发酵，发酵条件为：37℃，pH值自然，罐压为0.05 Mpa，通入空气，通气量与发酵罐体积比为1:1.3-1.5，转速330--380rpm；

5、在发酵过程中，每隔0.5h记录一次数据，记录内容为生产时间，罐温，罐压，pH值，泡沫情况，循环水温，罐内空气温度；每隔8h取发酵液50mL于塑料离心管内并依次编号，4℃保存备用。待发酵结束后将所有样品送检，观察发酵液状态（图5），检测其菌体含量及可溶性蛋白或小肽的含量；

6、发酵70--120h放罐，放罐指标为：结合摇瓶数据，没有明显的羽毛固形物存在，取样送检，将样品作镜检并测量其稀释150倍后在600nm波长下的OD值，所接菌种全部形成芽孢，形态见图（4）发酵末期镜检结果；当取样检测OD值为0.200~0.400时，发酵结束；

7、将上述发酵液用单层纱网过滤两次，去除固形物；按10%的比例加入可溶性淀粉，搅拌均匀；用高温离心式喷雾干燥塔将发酵液喷成粉末，进口温度为190℃，出口温度为80℃；

8、将粉末收集装袋，检验出厂，本产品为菌肽复合蛋白饲料，含有高菌体密度的以芽孢形式存在的地衣芽孢杆菌且含有可溶性蛋白寡肽。

第2步所述的固体LB平板为蛋白胨1g，酵母膏0.5g，NaCl 1g，蒸馏水 100ml，琼脂1.5g。

第2步、第3步所述的液体LB培养基为蛋白胨1g，酵母膏0.5g，NaCl 1g，蒸馏水100ml，pH 7.0。

本发明具有明显的优点。工艺简单，利废环保，节约资源，菌肽复合含量高，符合饲料安全。羽毛降解率可达80％。

本发明涉及的几种测量方法。

一、100mL发酵液摇瓶发酵中羽毛降解率测定方法：

1、用电子天平称量滤纸质量m1。

2、将摇瓶培养的羽毛发酵液稀释2~5倍，用玻璃棒引流至装了之前称量的滤纸的漏斗中。在此过程中不断往漏斗中加水稀释，并用玻璃棒搅拌，确保菌体和残余羽毛能够完全分离。

3、待全部发酵液过滤完后，将滤纸连同滤渣一同放入60℃烘箱内烘干至质量不再减少，称得总质量m2。

4、培养基中添加羽毛的总含量为m3。

羽毛降解率测定结果：（例如m1=0.022，m2=1.62，m3=2）

降解率P=（m2-m1）/m3*100%=（1.62-0.022）/2*100%=80%

二、100mL发酵液摇瓶发酵中地衣芽孢杆菌菌体增长量测定方法：

因为培养基中有羽毛固形物干扰，因此采用平板计数法测定菌体增长量：

1、分别取1mL接种后的培养基和发酵结束后的发酵液，编号A，B。

2、各取A，B混合液用无菌水进行10倍的梯度稀释，10倍梯度稀释至10^-5~-7。将每一份样品取100uL涂布两块LB平板，将平板放入37℃培养箱培养过夜。

3、次日统计每块平板的菌体数，取菌体数在30~200个之间的平板为有效样品，求平均菌体数。

利用平板计数法测定菌体生长结果，见图（2）：

初始菌体数：4.7×10¹⁰ 发酵末菌体数：1.55×10¹²

三、100mL发酵液摇瓶发酵中羽毛培养基发酵液上清可溶性蛋白含量测定：

用Bradford法测量发酵液上清可溶性蛋白或小肽的含量：

1、用蒸馏水配制0.5mg/ml的标准蛋白。取发酵初末两个状态的发酵液1mL，离心取上清，编号a，b。

2、在96空板中A行依次分别加入0，1，2，4，8，12，16，20μL的标准蛋白，用蒸馏水补齐至20uL，在B，C行重复两次，共三组。

3、在96空板中D行依次分别加入2，4，8，16，20μL a，b样品，用蒸馏水补齐至20uL，在E，F行重复两次，共三组。

4、在上述每个孔补加200μL G250工作液，30 ??C反应2 min。

5、将96空板放入酶标仪在595nm波长下读数。

利用A B C三行的数据制作标准曲线，计算出a，b两个样品的可溶性蛋白及小肽含量，测定结果见图（3）。

附图说明

图1为实施例3发酵初始结果对比。

图2为实施例4菌体生长变化状态。

图3为实施例4可溶性蛋白变化状态。

图4为实施例2菌体形态变化。

图5为实施例5取样发酵液形态颜色变化。

具体实施方法：

实施例1：羽毛的前处理

原始的羽毛从菜场采购回来后，首先要将其铺展开，将鸭皮，内脏等杂质剔除；之后用自来水冲洗浸泡20min，把水压干，再浸泡10min，把水压干，并将其风干；配制0.02％的NaOH溶液，加热至沸腾，将羽毛放入其中（每升该NaOH溶液约可处理200g干羽毛），15min后将羽毛取出，滤去NaOH溶液挤压羽毛至没有溶液渗出，用自来水泡2min，再次挤压羽毛至没有溶液渗出。直至羽毛pH为中性。将羽毛放入60℃烘干至质量不再增加。

实施例2：种子液的制备

将茄形瓶中保藏的CCTCCM208251菌种在固体LB平板上划线，使其活化。从上述LB平板中挑选单菌落接种于12瓶250mL锥形瓶中，瓶内含100mL液体LB培养基，放入摇床，在37℃，220rpm的条件下培养10h。分别从各瓶发酵液中取样并送镜检，12瓶发酵液均无污染且生长旺盛。按10 %的比例将上述一级种子发酵液接种至40L发酵罐中，罐内含25L 液体LB培养基，进行二级种子扩大培养。发酵7h，取样送镜检，镜检结果无污染。将无污染的发酵液保留在发酵罐中备用。镜检结果见（图4）。

实施例3：按发酵底物体积5%接种100mL羽毛发酵底物的摇瓶发酵：

羽毛生物发酵降解在250mL的锥形瓶中进行，每个锥形瓶的装液量为100mL。将地衣芽孢杆菌按5%接种于121℃，30min灭菌的发酵底物中，发酵底物成分为：（w/v％）0.3%硝酸钾，0.1%磷酸氢二钾，0.06%磷酸二氢钾，0.04%六水氯化镁，0.5% NaCl，0.1％山梨醇，2%羽毛。将其在37℃，200rpm条件下进行摇床发酵培养，每12h对发酵液观察一次，至发酵液中的羽毛不再减少即可停止发酵，沉渣中含有大量益生菌地衣芽孢杆菌。取样送检其菌体含量，及羽毛降解率。菌体含量变化见图（2），羽毛降解率为79%。

第一天羽毛状态无明显变化，发酵液颜色变深，变浑浊，第三天羽毛明显解体，培养基有不均一状态趋向于均一状态。第五天固体羽毛数量明显下降，培养基处有少量羽毛桔梗，其它为均一状态，培养液明显变稠，锥形瓶壁上附有地衣芽孢杆菌，发酵初始和结束发酵液状态见图（1）。

实施例4：按发酵底物体积10%接种100mL羽毛发酵底物的摇瓶发酵：

羽毛生物发酵降解在250mL的锥形瓶中进行，羽毛发酵底物与实施例3相同。每个锥形瓶的装液量为100mL。以10％的接种量接入实施例2的种子液，并在37℃，200rpm的条件下进行摇床发酵培养，每12h对发酵液观察一次，至发酵液中的羽毛不再减少即可停止发酵。发酵液沉渣中含有大量益生菌地衣芽孢杆菌。取样送检，检测其上清液的可溶蛋白质或小肽含量及羽毛降解率。上清液可溶蛋白或小肽含量变化见图（3），羽毛降解率为82%。

第一天羽毛状态无明显变化，发酵液颜色变深，变浑浊，第二天羽毛明显解体，培养基有不均一状态趋向于均一状态。第三天固体羽毛数量明显下降培养基处少量羽毛桔梗其它为均一状态，培养液明显变稠，锥形瓶壁上附有地衣芽孢杆菌。

实施例5：按发酵底物体积10%接种400L发酵罐进行发酵：

羽毛生物发酵降解在400L发酵罐中进行，装液量为250L，发酵底物成分为：（w/v％）0.3%硝酸钾，0.1%磷酸氢二钾，0.06%磷酸二氢钾，0.04% (w/v)六水氯化镁，0.5% NaCl，2%羽毛，0.1％山梨醇，其余为水，另加（v/v%）0.5%豆油、0.5%聚醚用于消泡，并用108~110℃灭菌。利用罐压将种子压入400L发酵罐内，按10%的接种量接种进行分批发酵。发酵条件为：37℃，pH自然，罐压为0.05Mpa，通气比为1:1.3~1.5，转速为350rpm。

第一天羽毛已经明显降解，发酵液均一且呈黑色，发酵液中有较粗大的羽毛梗碎片。第二天，发酵液颜色略淡，羽毛残渣变得非常细。第三天羽毛残渣较之第二天变少，发酵液变稠。发酵液中菌体形态见图（4），发酵过程发酵液状态见图（5），发酵结束后经检测稀释150倍后的OD值为0.281，羽毛降解率为80%。

将发酵液用单层纱网过滤两次，滤液中按10%的比例加入可溶性淀粉，搅拌均匀；用高温离心式喷雾干燥塔将含淀粉的发酵液喷成粉末。即为本发明的产品菌肽复合蛋白饲料，含有高菌体密度的以芽孢形式存在的地衣芽孢杆菌且含有可溶性蛋白寡肽。

Claims

1.一种利用地衣芽孢杆菌降解羽毛制备菌肽复合蛋白饲料添加剂的方法，其特征在于步骤为：

⑴、收集羽毛，去除杂质，浸泡水洗压干2-3次，将羽毛风干；将上述羽毛放入0.02~0.05%的NaOH的水溶液中，煮沸15min；滤去NaOH溶液，用自来水浸泡水洗压干2-3次，并将羽毛烘干保存备用；

⑵、将茄形瓶中保藏的CCTCCM208251菌种在固体LB平板上划线，使其活化；从上述LB平板中挑选单菌落接种于12~15瓶250mL锥形瓶中，瓶内含100mL液体LB培养基，放入摇床，在37℃、220rpm的条件下培养10h；分别从各瓶发酵液中取样并送镜检，选取无污染，生长旺盛的发酵液作为种子液；

⑶、按5~10 %的比例将上述一级种子发酵液接种至40L发酵罐中，罐内含25L 液体LB培养基，进行二级种子扩大培养，发酵7-8h，取样送镜检，将无污染的发酵液保留在发酵罐中备用；

⑷、在400L的发酵罐中配制250L的发酵底物，并用108-110℃灭菌，发酵底物成分为：（w/v％）0.3%硝酸钾，0.1%磷酸氢二钾，0.06%磷酸二氢钾，0.04% (w/v)六水氯化镁，0.5% NaCl，2%羽毛，0.1％山梨醇，其余为水，另加（v/v%）0.5%豆油，0.5%聚醚用于消泡；将上述种子液接种至400L发酵罐内，按5~10 %的接种量接种，进行分批发酵，发酵条件为：37℃，pH值自然，罐压为0.05 Mpa，通入空气，通气量与发酵罐体积比为1:1.3-1.5，转速330--380rpm；

⑸、在发酵过程中，每隔0.5h记录一次数据，记录生产时间，罐温，罐压，pH值，泡沫情况，循环水温，罐内空气温度；每隔8h取发酵液50mL于塑料离心管内并依次编号，4℃保存备用，待发酵结束后将所有样品送检，检测其菌体含量及可溶性蛋白或小肽的含量；

⑹、发酵70--120h放罐，放罐指标为：结合摇瓶数据，没有明显的羽毛固形物存在，取样送检，将样品作镜检并测量其稀释150倍后在600nm波长下的OD值，所接菌种全部形成芽孢，当取样检测OD值为0.200~0.400时，发酵结束；

⑺、将上述发酵液用单层纱网过滤两次，去除固形物；按10%的比例加入可溶性淀粉，搅拌均匀；用高温离心式喷雾干燥塔将发酵液喷成粉末，进口温度为190℃，出口温度为80℃；

⑻、将粉末收集装袋，检验出厂。