CN105349461A - 一株产琼胶酶溶藻弧菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株溶藻弧菌（<i>Vibrio</i><i>？alginolyticus</i>）A-001，保藏在中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，其保藏编号为？CCTCC？M2015555，保藏日期：2015.9.18，以及用该菌株产生的琼胶酶制备琼胶寡糖的方法。本发明以该菌株作为菌种，采用碳源、氮源、无机盐组成的发酵培养基产酶，发酵液通过硫酸铵进行盐析，离心，透析，过离子交换柱及凝胶柱，制得酶干粉，并用琼胶酶和0.5%的琼胶底物反应，于超滤膜上过滤，收集滤液、冻干，即获得琼胶寡糖。

Description

一株产琼胶酶溶藻弧菌及应用

技术领域

本发明属于食品生物技术领域，涉及筛选一株产琼胶酶溶藻弧菌及其制备琼胶寡糖方法。

背景技术

琼胶，还被称为琼脂，具有水溶性，是一种复杂的混合物，三大海藻多糖之一。由于琼胶具有较好的稳定性与胶凝性等特性，在食品、医药等行业应用十分广泛。随着海藻多糖工业的持续健康发展，对琼胶多糖降解酶的研究深度与广度也在不断加大。根据琼胶酶对糖苷键作用点的差异可以将其分为α-琼胶酶和β-琼胶酶，这两种酶分别裂解琼胶糖的α-1，3糖苷键与β-1，4糖苷键，并获得3，6-内醚-α-L-半乳糖和D-半乳糖。该类酶以琼胶作为反应底物，可利用其功能的特异性来获得聚合度各异的琼寡糖，如琼三糖、琼四糖、琼五糖、新琼二糖、新琼四糖、新琼六糖，这些琼胶寡糖具有抗氧化、抑制脂质过氧化、减慢淀粉水解和保湿等化学特性。琼胶酶及降解琼胶的菌株也成为近年来海洋生物资源研究、开发的焦点之一。

琼胶酶来源广泛，目前获得产琼胶酶的海洋微生物主要集中在海水中富集筛选产琼胶酶的菌株，如假单胞菌属，交替假单胞菌属，交替单胞菌属，微颤菌属，弧菌属，链霉菌属，噬细胞菌属。海洋杂食动物及其肠道微生物具有较高的藻类多糖降解酶开发潜力，目前在滨螺属，海兔属，冠海詹属等肠道内分离到降解琼胶的酶。

琼胶酶主要来源于海洋软体动物和海洋微生物。于1902年Gran首次从海水中筛选到琼胶降解微生物一琼胶假单胞菌(Psudomonasgalatica)以来，研究人员已经从海水系统中分离到多种不同属种的琼胶分解菌。如Cytophaga(噬细胞菌属)(DuckworthMetal.,1968)、Pseudomonas-like(类假单胞菌属)（VonHofstenBetal.,1975）、Pseudomanaswellantypicum(井氏假单胞菌)（王选良，1985）、Streptomyces(链霉菌属)（BibbMJetal.,1987）、Pseudomonas(假单胞菌属)（BelasRetal.,1989）、Vibrio(弧菌属)（Aokietal.,1990）、AltermonasagarlyticsGJ1B（交替假单胞菌）（Potinetal.,1993）、Alterococcus(交替球菌属)（ShiehWYetal.,1998）、Thalassomonassp.JAMB-A33（海洋嗜冷单胞菌）（Ohtaetal.,2005）。因此筛选新的微生物制备琼胶低聚糖成为当前研究者的新任务。

我国海藻资源丰富，为开发生产琼胶低聚糖奠定了物质基础，现在传统工业上主要采用酸水解法生产琼胶低聚糖，酶法生产琼胶低聚糖的工业比较少，酸水解法生产琼胶低聚糖存在很多不足，包括生产周期长，生产操作繁琐，降解成分复杂，水解产物不稳定、不易纯化，不利于琼胶低聚糖的回收和利用。而酶法生产琼胶低聚糖反应条件温和，操作简单、易于控制，生产成本低，生产的低聚糖产物均一且不易被破坏，有利于高效生产和回收特定的琼胶低聚糖，现在酶法生产琼胶低聚糖是成为产业界主要关注点之一。

发明内容

本发明的一个目的是筛选出一种产琼胶酶的新菌株，并提供一种利用此菌株制备琼胶酶生产琼胶寡糖方法。

本发明的技术方案：一株筛选自海洋贝类肠道的细菌，可以用于制备琼胶酶(agarase)，其分类命名为溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus）A-001，已保藏在中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：武汉大学，其保藏编号为CCTCCNO:M2015555，保藏日期：2015.9.18。

微生物菌株的筛选与鉴定：

本发明从海洋贝类肠道采取样液，接种到琼脂筛选培养基上，于28℃倒置培养48h后，观察菌落周围现象，把周围有显著凹陷或者透明圈的菌落挑选出来，并在2216E斜面培养基上保存，得到可以降解琼胶的菌株。将具有降解琼胶的菌株用无菌牙签接种在筛选培养基上，28℃怛温倒置培养48h后，用鲁戈氏碘液进行染色观察。如果菌株产琼胶酶可以降解琼胶，则琼胶被降解后不会被染色，而菌落周围将形成透明圈，测定透明圈的直径。取经过纯化的可降解琼胶菌株，按无菌操作各挑取一环转接到装有25mL种子培养基的三角瓶里，于28℃、150r/min的摇床中震荡培养24h，再分别取10mL种子培养液接种到90mL液体发酵培养基中，28℃，150r/min摇床震荡培养32h，将发酵好的培养液于5000r/min、4℃条件下离心15min，取上清液作为胞外酶粗酶液测定酶活力，筛选出酶活最高的菌株。最终筛选出目标菌株，对其进行生理生化特性实验和16srDNA序列分析，确定其属于溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus），命名为溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus）A-001。

用所述溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus）A-001生产琼胶酶生产琼寡糖方法包括如下步骤：

（1）用250mL锥形瓶装50-90mL种子培养基，按常规方法灭菌，冷却，并接种菌落，接种后于28℃，150rpm摇床培养15h后得到种子发酵液，所述种子培养基为：氯化钠35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，琼脂2.0g/L，七水硫酸亚铁1g/L，调节pH为7.5左右，自来水水配制。

（2）用250mL锥形瓶装90mL发酵培养基，按常规方法灭菌，冷却，并按5-10%的接种量，将种子发酵液接入发酵培养基，28℃培养32-60h后得到含琼胶酶的发酵液，所述发酵培养基为：氯化钠35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，琼脂2.0g/L，七水硫酸亚铁1g/L，调节pH为7自来水水配制。而后将发酵培养基经过4℃，10000r/min离心15min之后，取上清液。

（3）在上清液中加入固体硫酸铵使饱和度达到30%-90%，进行盐析，置4℃冷室过夜，4℃，8000r/min离心20min取沉淀。

（4）将得到的沉淀加入0.02mol/L的Tris-HCI缓冲液中进行溶解，离心取上清液，将收集的上清液放入透析袋中进行透析，将透析液过预平衡的阴离子交换色谱DEAE-SepharoseFF柱(2.6cm×30cm)，用480ml的含0.3-1MNaCl的Tris-HCI缓冲液进行线性洗脱，洗脱速度为1.5mL/min，检测波长为280nm，洗脱液以4.5mL/管分部收集。测定收集到的溶液的酶活，将有活性的部分合并，冻干，-20℃保藏备用。

（5）取0.5g琼脂，加入到盛有100ml蒸馏水的三角瓶中，加热煮沸使琼脂溶解，并迅速冷却到40℃，加入1%（w/v）上述制作的琼胶酶，40℃，酶解反应40h。将酶解液在10000r/min离心20min，取上清液于10KDa超滤膜上进行过滤，收集过滤液，冻干，即得到琼胶寡糖。

用该方法生产的琼胶酶的检测方法：

取步骤（2）得到含有琼脂酶的上清液1mL，加入20mL的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（其中含有琼胶0.2%），置于40℃摇床中酶解60min，后加入2mLDNS试剂，沸水浴5-10min。冷却至室温后，用蒸馏水补齐刻度，使用分光光度计在520nm下进行检测。1U定义为1min产生1ug还原糖所需的酶量。

用该方法生产的琼胶寡糖的检测方法：

薄层层析法（TLC）分离琼胶寡糖，点样：取一块硅胶板，在距离硅胶板底端2cm处标上一条直线，在直线上每隔2cm作一标记，方便点样。用0.5mm的点样管吸取样品在琼胶版上进行点样，使点样斑点不超过2mm，使点样点自然干燥。展层：将已点好样的硅胶板的点样端放入到装有展层剂的层析缸中，使展层剂的液面不要超过点样点，密闭层析缸，自上而下展层，当层析剂上升到硅胶板顶端1cm处，立即取出硅胶板，于60℃的烘箱中烘干。显色：取出已烘干的硅胶板，将显色剂均匀喷洒在硅胶板上，放置到60℃的烘箱中加热，直至层析斑点出现。

本发明的有益效果：筛选出一株生产琼胶酶的海洋微生物，分类命名为溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus）A-001。在贝类肠道微生物筛选出可降解琼胶的溶藻弧菌，国内外少有报道。该菌以常见碳源，氮源，无机盐组成的发酵培养基，生产周期短，12h可达到对数生长期，该菌种能诱导表达琼胶酶。通过简单的分离纯化方法即可得到琼胶寡糖。

具体实施方式

以下是说明本发明的具体实施例，但本发明并不限于此。

实施例1

海洋贝类肠道采取样液，吸取1ml进行稀释（10^-1,10^-2,10^-3,10^-4,10^-5，10^-6，10^-7，10^-8），吸取0.2ml涂布于琼脂筛选培养基上，在28℃下，培养48h后，挑选有明显凹陷的菌落，经过分离纯化后，将菌种转接接到液体培养基28℃，150rpm，摇瓶培养32h，离心取上清液（上清液即为粗酶液），采用分光光度法检测培养基中的琼脂酶活性，经过初筛，共分离获得6株能长琼胶酶的细菌，结合琼胶酶的生产能力，最终选定溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus）A-001作为出发菌株。

实施例2

经形态学和生理生化特性研究，产琼胶酶菌株的特征如下：

菌落形态：菌落湿润，显乳白色，边缘整齐，圆形。

细胞形态：弯曲短杆状。

生理生化特征：为革兰氏阴性菌,具有运动性，氧化酶阳性，可利用葡萄糖、淀粉为碳源，也可利用蛋白胨，酵母膏，硝酸铵，硫酸铵，氯化铵等作为生长所需的氮源。

对保藏号为CCTCCM2015555的菌株的16SrDNA基因进行PCR扩增与序列测定，发现其16SrDNA的基因部分片断长度为1420bp，经过NCBI和核糖体数据库进行比对，鉴定为溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus）A-001，拟命名为溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus）A-001，菌株的16SrRNA序列如SEQIDNO.1所示。

实施例3

（1）将溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus）A-001在种子培养基中，用250mL锥形瓶装62mL种子培养基，按常规方法灭菌，冷却，并接种菌落，接种后于25℃，140rpm摇床培养24h后得到种子发酵液，所述种子培养基为：氯化钠35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，琼脂2.0g/L，七水硫酸亚铁0.1g/L，调节pH为7，自来水水配制。

（2）用250mL锥形瓶装90mL发酵培养基，按常规方法灭菌，冷却，并按11%的接种量，将种子发酵液接入发酵培养基，接种后于28℃，150rpm摇床培养培养48h后得到含琼胶酶的发酵液，所述种子培养基为：氯化钠35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，琼脂2.0g/L，七水硫酸亚铁0.1g/L，调节pH为7，自来水水配制，该实施例所得的琼胶酶的活力为13.01U/mL。

实施例4

取5g琼脂，加入到盛有100ml蒸馏水的三角瓶中，加热煮沸使琼脂溶解，并迅速冷却到40℃，加入1%（w/v）上述制作的琼胶酶，于40℃，酶解反应40h，将酶解液在10000r/min离心20min，取上清液于10KDa超滤膜上进行过滤，收集过滤液，冻干，即得到琼胶寡糖。

SEQUENCELISTING

<110>福建农林大学

<120>一株产琼胶酶溶藻弧菌及应用

<130>1

<160>1

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>1420

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

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Claims (3)

1.一株溶藻弧菌，其特征在于：所述溶藻弧菌为溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus）A-001，已于2015年9月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO:M2015555。

2.一种如权利要求1所述的溶藻弧菌用于琼胶寡糖的制备。

3.如权利要求2所述的溶藻弧菌用于琼胶寡糖的制备，其特征在于：其制备方法包括如下步骤：

（1）用250mL锥形瓶装50-90mL种子培养基，按常规方法灭菌，冷却，并接种菌落，接种后于28℃，150rpm摇床培养15h后得到种子发酵液，所述种子培养基为：氯化钠35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，琼脂2.0g/L，七水硫酸亚铁0.1g/L，调节pH为7.5，自来水水配制；

（2）用250mL锥形瓶装90mL发酵培养基，按常规方法灭菌，冷却，并按5-10%的接种量，将种子发酵液接入发酵培养基，28℃培养32-60h后得到含琼胶酶的发酵液，所述发酵培养基为：氯化钠35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，琼脂2.0g/L，七水硫酸亚铁0.1g/L，调节pH为7自来水水配制，而后将发酵培养基经过4℃，10000r/min离心15min之后，取上清液；

（3）在上清液中加入固体硫酸铵使饱和度达到30%-90%，进行盐析，置4℃冷室过夜，4℃，8000r/min离心20min取沉淀；

（4）将得到的沉淀加入0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液中进行溶解，离心取上清液，将收集的上清液放入透析袋中进行透析，将透析液过预平衡的阴离子交换色谱DEAE-SepharoseFF柱，用480mL的含0.3-1MNaCl的Tris-HCl缓冲液进行线性洗脱，洗脱速度为1.5mL/min，检测波长为280nm，洗脱液以4.5mL/管分部收集，测定收集到的溶液的酶活，将有活性的部分合并，冻干，-20℃保藏备用；

（5）取0.5g琼脂，加入到盛有100ml蒸馏水的三角瓶中，加热煮沸使琼脂溶解，并迅速冷却到40℃，加入1%（w/v）上述制作的琼胶酶，40℃，酶解反应40h；将酶解液在10000r/min离心20min，取上清液于10KDa超滤膜上进行过滤，收集过滤液，冻干，即得到琼胶寡糖。