CN116555094A - 一株溶藻弧菌属多糖降解菌及其培养方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株溶藻弧菌属多糖降解菌及其培养方法与应用，属于生物技术领域，具体提供了一株溶藻弧菌H204，于2022年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC No.25216；本发明提供的溶藻弧菌H204菌株，能够以褐藻胶，果胶，多聚半乳糖醛酸，透明质酸，硫酸软骨素，几丁质为唯一碳源进行生长，即具有降解多种多糖的酶活性。
Description
技术领域
本发明涉及一株溶藻弧菌属多糖降解菌及其培养方法与应用，属于生物技术领域。
背景技术
多糖及其寡糖产物具有重要的应用价值，因此多糖降解菌及其多糖降解酶资源的开发一直是酶法制备寡糖的研究热点之一，其中新型多糖降解菌的发现是研制新型工具酶的源头保障。
多糖（polysaccharide），是由单糖通过糖苷键结合的聚合糖高分子碳水化合物[1]。根据生物来源的不同分为微生物多糖，如肽聚糖等；海藻多糖，如褐藻胶、琼脂糖、卡拉胶等；高等植物多糖，如纤维素、果胶、甘露聚糖、木聚糖；以及动物多糖如糖胺聚糖、几丁质等[2]。
多糖是生物体内重要的一部分[3]，不仅为动植物微生物等储备能源提供能量，是细胞的重要组成部分，肽聚糖和纤维素构成动植物的细胞壁，此外还参与重要生理病理过程从而发挥重要生物学作用。研究发现多糖及其衍生产物具有抗肿瘤[4-5]、免疫调节[6]、抗氧化[7]、抗血栓[8]等功能活性。参与分子识别、细胞信号转导与病毒侵染等过程[9]。然而，由于多糖结构的不均一性和复杂的功能基团修饰使得不同来源甚至同一来源不同发育阶段的同种多糖在结构和序列上存在很大差异。近年来越来越多的研究表明，多糖结构中特定结构序列与特定蛋白相互作用赋予了其多种生物学功能。此外，同一多糖链中不同的结构序列与不同蛋白的相互作用，使得其具有不同功能，因此可以通过选择性部分降解多糖链，制备结构均一或相对均一的特定功能区寡糖用于医药及功能食品的相关研究和开发。多糖降解菌及其多糖降解酶资源的开发一直是酶法制备寡糖的研究热点之一，其中新型多糖降解菌的发现是研制新型工具酶的源头保障。
多糖降解菌可利用多糖进行生长繁殖，是多糖降解酶资源开发的重要来源。多糖降解菌又分为单一多糖降解菌和多能型多糖降解菌，后者能以多种多糖为唯一碳源进行生长[10-11]，所产多糖降解酶类型多样，具有重要开发价值。海洋蕴含着丰富的藻类、海洋动物，是多糖物质的重要来源，必定也存在可以降解多糖的微生物。目前，海洋来源的多糖降解菌有Vibriosp. FC509[12]、Pseudoalteromonassp. A601[13]、Flammeovirgasp. MY04[14 -15]、Zobellia galactanivorans [16]、Saccharophagus degradans2-40[17-18]。近年来一些研究者开始考虑采用多种海洋多糖降解菌组合的使用方式，从而有效提高多糖降解率。
碳水化合物活性酶(carbohydrate-active enzymes，CAZymes)是负责糖类化合物降解、修饰及生成糖苷键的功能酶系，是糖类物质代谢通路中的基本功能单元。其中多糖降解酶是一类能够催化多糖分子内糖苷键断裂，使聚合度不断降低，最终产生寡糖的水解酶[19]，在多糖的降解过程中起着关键性的作用，与物理和化学降解法相比，生物酶法降解多糖的过程更安全简单，更环保节能。同时，由于其底物的特异性、作用方式和较高的酶活性，其降解的特异性和效率也更高。因此获取降解多糖的菌株及其产生的高活性多糖降解酶进行研究具有重要的科研和应用价值。
弧菌Vibriosp.MCCC1A13243（ZL202110203345.7）具有褐藻胶降解能力，但是其降解其它多糖的能力未见报道；Flammeovirgasp. MY04[14]也可以制备出褐藻胶及琼脂糖胶等多糖降解酶，但是该菌降解动物多糖硫酸软骨素、几丁质，及微生物多糖透明质酸的活性未见报道。李福川等人在2014年筛选到一株弧菌Vibrio sp. FC509，可以制备出多糖降解酶[12]，对透明质酸和硫酸软骨素等均具有降解活性，发现其能够高效降解糖胺聚糖，并且该酶活力是已知商品化糖胺聚糖裂解酶的几十到上百倍，但是该弧菌降解褐藻胶，果胶，多聚半乳糖醛酸等植物多糖活性未见报道。截至目前，弧菌既能降解褐藻胶又能降解软骨素及其它多糖的弧菌未见报道，而且溶藻弧菌的多糖降解功能未见报道。
1981年，Sakazaki等提出将溶藻弧菌作为一个独立的物种看待。溶藻弧菌广泛分布于海洋中，与哈维氏弧菌、副溶血弧菌并称海洋三大优势弧菌，其中溶藻弧菌居首。已有研究表明，溶藻弧菌产生和分泌胞外蛋白酶（MviN、Pep、Asp）是其治病性的关键[20]。关于溶藻弧菌的研究多集中在病害防治等方面，对于多糖降解酶的研究处于空白阶段。因此，对于这一重要海洋微生物物种的资源开发必然有利于相关分子致病机制的认知和功能寡糖药物的研制。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一株溶藻弧菌属多糖降解菌及其培养方法与应用。
本发明提供的溶藻弧菌能利用多种多糖，即具有降解多种多糖的酶活性。
一株溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus) H204，于2022年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCCNo.25216。
本发明提供的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus) H204，显微镜观察，菌株呈短杆状，红色，为革兰氏染色阴性菌。
上述溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204菌株的培养方法，包括如下步骤：
（1）将溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204菌株样品，接种至固体培养基上，25～30℃培养18～48h，制得活化菌株；
（2）挑取步骤（1）制得的活化菌株，接种至液体培养基中，在温度为25～30℃、转速为180～220转/分钟的条件下，培养16～24h，制得种子液；
（3）将步骤（2）制得的种子液，按1～5％的体积百分比接种于液体培养基中，在温度为25～30℃、转速为180～220转/分钟的条件下，扩大培养4～6天，制得溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204菌液。
根据本发明优选的，所述步骤（1）、步骤（2）中的液体培养基每升组分如下：
酵母提取物3-10 g，胰蛋白胨5-20 g，碳源1-20 g，余量人工海水，pH 7 .2；
所述人工海水组份如下：KH2PO43.0 g、K2HPO4•3H2O 7.0 g、(NH4)2SO42.0 g、NaCl30.0 g、FeSO4•7H2O 0.01 g、MgSO4•12H2O 0.01 g定容至1000 mL；
所述步骤（1）中固体培养基在液体培养基基础上每升加入琼脂15-20 g；
所述步骤（1）中碳源为褐藻胶，果胶，多聚半乳糖醛酸，硫酸软骨素，透明质酸或几丁质的一种。
上述溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204菌株在制备多糖降解酶制剂中的应用。
上述溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204菌株制备多糖降解酶制剂的方法，包括如下步骤：
①取溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204菌液，按1～5％的体积百分比接种于发酵培养基中，在温度为25～30℃、转速为180～220转/分钟的条件下，扩大培养2-5小时，加入多糖碳源，继续培养3～7天，制得溶藻弧菌H204菌株发酵液；
②取步骤①制得的溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）H204菌株发酵液，超声破碎后固液分离，取液体，加入硫酸铵，使浓度达到饱和度的80％，离心，收集沉淀，用20～50mL的TGE缓冲液重悬沉淀，透析去除硫酸铵，制得酶制剂，即为多糖降解酶制剂。
根据本发明优选的，所述步骤①中的发酵培养基，每升组分如下：
酵母提取物1.5-5g，胰蛋白胨2.5-10g，余量人工海水，pH7.2；
所述人工海水组份如下：KH2PO43.0 g、K2HPO4•3H2O 7.0 g、(NH4)2SO42.0 g、NaCl30.0 g、FeSO4•7H2O 0.01 g、MgSO4•12H2O 0.01 g定容至1000 mL。
根据本发明优选的，步骤①中，溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204菌液的制备，包括如下步骤：
将溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204菌株样品，接种至固体培养基上，25～30℃培养18～48h，制得活化菌株；挑活化菌株，接种至液体培养基中，在温度为25～30℃、转速为180～220转/分钟的条件下，培养16～24h，制得溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204菌液。
根据本发明优选的，步骤①中，加入多糖碳源的终浓度按质量分数计为0.01%～0.02%。
根据本发明优选的，步骤①中，所述多糖包括褐藻胶、果胶、多聚半乳糖醛酸、透明质酸、硫酸软骨素和/或几丁质。
根据本发明优选的，步骤②中，固液分离的条件为：1500-5000×g，4℃离心15～30min。
根据本发明优选的，步骤②中，硫酸铵沉淀后离心条件为：15000×g，4℃离心15～30min。
根据本发明优选的，步骤②中，TGE缓冲液组分如下：
50mMTris，50mMNaCl，0.5mMEDTA，5mMβ-巯基乙醇，5.0％(v/v)甘油，ddH2O定容至1000mL，pH 7.0。
根据本发明优选的，步骤②中，透析为采用分子截留量10,000Da的透析袋，进行搅拌透析。
上述溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204菌株在降解多糖中的应用。
根据本发明优选的，所述多糖包括褐藻胶、果胶、多聚半乳糖醛酸、透明质酸、硫酸软骨素和/或几丁质。
有益效果
本发明提供的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204菌株，能够以褐藻胶，果胶，多聚半乳糖醛酸，透明质酸，硫酸软骨素，几丁质为唯一碳源进行生长，即具有降解多种多糖的酶活性，其中在硫酸软骨素、壳聚糖、褐藻胶中生长旺盛；并且能够产生褐藻胶裂解酶，降解褐藻胶之后所产生的不饱和寡糖，寡糖主产物为不饱和三糖及不饱和四糖，具有潜在的应用价值。
附图说明
图1、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204菌株的基本形态学特征图。
图2、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204形态学特征电子图。
图3、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204菌株基于16S rRNA基因序列绘制的进化树图。
图4、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204基因组扫描图。
图5、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204菌株在唯一碳源培养基中生长的最高菌体浓度柱状图。
图6、褐藻胶诱导溶藻弧菌H204后制备的酶制剂SDS-PAGE电泳图；
图中：泳道M、10 μL蛋白质分子量标准物PageRuler；泳道1、5μL H204菌株酶制剂。
图7：溶藻弧菌H204所产酶制剂降解褐藻胶的HPLC色谱分析图；
图中：1：不饱和八糖，2：不饱和七糖，3：不饱和六糖；4：不饱和五糖，5：不饱和四糖，6：不饱和三糖，7：不饱和二糖。
图8、酶制剂降解褐藻胶多糖生成的寡糖-不饱和三糖UDP3的质谱(MS)分析图。
图9、溶藻弧菌H204所产酶制剂降解果胶产寡糖的HPLC色谱分析图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
生物材料来源
溶藻弧菌((Vibrio alginolyticus)H204，于2022年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCCNo.25216。
褐藻胶：购自sigma公司；
果胶：购自sigma公司；
多聚半乳糖醛酸：购自sigma公司；
壳聚糖：购自sigma公司；
透明质酸：购自sigma公司；
硫酸软骨素：购自sigma公司。
实施例1
微生物的分离与纯化
取青岛鳌山卫附近海岸沉积物，取1 g样品，置于体积为100 mL的褐藻胶、硫酸软骨素等多糖为唯一碳源液体培养基中，在温度为28℃、转数为200转/分钟的条件下，培养至溶液浑浊；取1 mL上述培养液加入到9 mL无菌水中，分别稀释至浓度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的5个浓度梯度。将稀释后的菌悬液涂布于固体培养基，每个浓度做两个平行，28℃培养1天。挑选出形态差异比较明显的菌落再次划线培养，如此反复经过3次平板划线分离纯化后，获得单克隆菌株。挑单菌落于唯一碳源液体培养基中，28℃、200转/分钟培养3天。最后取培养物1 .6 mL加入400 μL甘油，混匀后于-80℃冰箱长期保存。
上述唯一碳源液体培养基为：
人工海水中分别添加多糖底物至终浓度为0.50％(w/v)，pH 7.2；
上述碳源选自：褐藻胶，果胶，多聚半乳糖醛酸，壳聚糖，透明质酸，硫酸软骨素。
上述固体培养基为：
酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，琼脂15 g，余量人工海水，pH7.2；
人工海水每升组份如下：KH2PO43.0 g、K2HPO4•3H2O 7.0 g、(NH4)2SO42.0 g、NaCl30.0 g、FeSO4•7H2O 0.01 g、MgSO4•12H2O 0.01 g定容至1000 mL。
实施例2
多糖降解菌的筛选
把实施例1中所得到的菌株单克隆，分别接种到唯一碳源液体培养基中，200转/分钟、30℃培养72h，观察菌液浑浊情况，以及利用上清液和咔唑方法检测唯一碳源消耗情况。依据上述两个指标选择产酶菌株。将在唯一碳源液体培养基中浑浊度高且糖消耗较高的菌株挑取到固体培养基上划线培养，分别保种并编号 H201，H202，H203，H204，H205，H206，H207，H208，H209。按照如上所述方法，分离得到溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204菌株，如图1所示。该菌株在固体培养基上，菌落扁平粗糙、不透明、无光泽、边缘不整齐、较湿润。将单菌落培养24 h后，用革兰氏染色法进行染色并于显微镜下观察。
所述的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204菌株，倒置显微镜（100 x）观察，发现菌株呈短杆状或卵圆形，红色，为革兰氏染色阴性菌，如图2所示。
上述唯一碳源液体培养基的配制方法是：
向人工海水中分别添加多糖底物至终浓度为0.50％(w/v)；
上述碳源选自：褐藻胶，果胶，多聚半乳糖醛酸，壳聚糖，透明质酸，硫酸软骨素。
上述人工海水，每升组分如下：
KH2PO43.0 g、K2HPO4•3H2O 7.0 g、(NH4)2SO42.0 g、NaCl 30.0 g、FeSO4•7H2O 0.01g、MgSO4•12H2O 0.01 g，余量水。
实施例3
基于16S rRNA基因克隆的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204菌株的分子鉴定
用细菌基因组提取试剂盒(天根生化)制备菌株Q02的基因组DNA，用作模板，用细菌16S rRNA基因的通用引物(27f和1492r)进行扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳，然后用胶回收试剂盒(天根)纯化PCR扩增产物，电泳验证后进行测序。所得16S rRNA基因测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，将序列与美国国家生物信息中心 (NCBI)收录的标准菌株的16S rRNA基因序列进行比对检索，应用MEGA6 .0构建系统发育树。
上述用于菌株16S rRNA基因扩增的通用引物为：
正向引物为27f：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’SEQIDNO.2；
反向引物为1492r：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’SEQIDNO.3。
上述用于菌株16S rRNA基因扩增的反应体系如下，总体积50μL：
所用基因扩增试剂Prime STAR HS DNA polymerase、dNTP混合物、缓冲液购自大连宝生物技术有限公司。
上述用于菌株16S rRNA基因扩增的程序为：
94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃延伸15min；降温至4℃并保温15min。
上述基于16S rRNA基因系统发育树构建方法：应用MEGA6 .0软件包中的ClustalW对测得的16S rRNA基因序列以及自NCBI基因数据库中获得的标准菌株的相似序列，一起进行多序列比对，用UPGMA法构建系统发育树，并进行1000次Bootstraps检验，获得统计树。
结果如图3所示，本发明的菌株的16SrRNA的基因序列长度为1428 bp，如SEQIDNO.1所示与NCBI注册的菌株Vibrio alginolyticusstrain 20-1-9 16S rRNA序列最近，序列相似度为99.7%。溶藻弧菌H204菌株与溶藻弧菌的多个标准菌株聚类，并位于该分支内部，加上其16S序列与溶藻弧菌16S序列相似度高于97%，一般认为该菌为溶藻弧菌。虽然与已注册菌株相似性高但溶藻弧菌降解多糖的功能作用未见报道。
溶藻弧菌((Vibrio alginolyticus)H204，于2022年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCCNo.25216。
实施例4
溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204基因组扫描及序列分析
将培养的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204菌株进行基因组扫描测序（美吉生物公司），利用NCBI网站对测序结果进行在线分析。结果显示其基因组由约5兆碱基组成，含有多个降解碳水化合物的基因，见图4。
实施例5
溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204利用唯一碳源的生长情况
把实施例4中所得到的H204菌株，分别接种到唯一碳源液体培养基中，200转/分钟、30℃培养72 h，观察菌液浑浊情况，并检测OD600吸收值，进而分析其利用多糖情况。
结果如图5溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204所示能利用多种多糖，如褐藻胶，果胶，多聚半乳糖醛酸，透明质酸，硫酸软骨素，几丁质为唯一碳源进行生长，其中在硫酸软骨素、壳聚糖、褐藻胶中生长旺盛，在多聚半乳糖醛酸等中生长较旺盛，在透明质酸中生长相对较慢。说明溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)H204可以降解上述碳源为自身生长和生理提供能量，必定存在着可以降解上述碳源的多糖降解酶。
上述唯一碳源液体培养基的配制方法是：
向人工海水中分别添加多糖底物至终浓度为0.50％(w/v)；
上述多糖底物选自：褐藻胶，果胶，多聚半乳糖醛酸，壳聚糖，透明质酸，硫酸软骨素；在115℃高压灭菌20 min。
上述人工海水，每升组分如下：
KH2PO43.0 g、K2HPO4•3H2O 7.0 g、(NH4)2SO42.0 g、NaCl 30.0 g、FeSO4•7H2O 0.01g、MgSO4•12H2O 0.01 g，余量水。
实施例6
溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204菌株在制备多糖降解酶中的应用，步骤如下：
(1)从-80℃冰箱拿出溶藻弧菌H204甘油菌株划线于固体培养基上，28℃倒置培养16 h；
(2)挑取H204单克隆菌落至液体培养基中，28℃、200转/分钟，摇床震荡培养16 h，制得种子液；
(3)将步骤(2)制得的种子液，按1％的体积比例接种于发酵培养基，100 mL/瓶中，在温度为28℃、转速为200转/分钟的条件下，扩大培养5 h，然后加入褐藻胶，使褐藻胶质量浓度为0.01%，继续培养72 h，制得H204菌株发酵液；
(4)取步骤 (3)制得的溶藻弧菌H204菌株的发酵液，超声破碎，15000×g，4℃离心30 min，取上清，加入硫酸铵，使浓度达到饱和度的80％，15000×g，4℃离心30 min后收集沉淀，用20倍体积的TGE缓冲液重悬沉淀，并使用分子截留量为10, 000Da的透析袋透析三次，以去除硫酸铵，制得酶制剂。然后用SDS-PAGE电泳对溶藻弧菌H204菌株的酶制剂进行检测。结果显示溶藻弧菌H204菌株酶制剂含有多条蛋白条带，如图6所示。
上述TGE缓冲液的组分如下：
50 mM Tris，50 mM NaCl，0 .5 mM EDTA，5 mM β-巯基乙醇，5 .0％(v/v)Glycerol (甘油)，ddH2 O 1000 mL，pH 7 .9。
上述液体培养基为：
酵母提取物5g，胰蛋白胨10 g，余量人工海水，pH 7 .2；
所述固体培养基在液体培养基基础上每升加入琼脂15 g。
上述发酵培养基为：
酵母提取物2.5g，胰蛋白胨5 g，余量人工海水，pH 7 .2。
人工海水每升组份如下：KH2PO43.0 g、K2HPO4•3H2O 7.0 g、(NH4)2SO42.0 g、NaCl30.0 g、FeSO4•7H2O 0.01 g、MgSO4•12H2O 0.01 g定容至1000 mL。
实施例7
溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204酶制剂降解褐藻胶所得产物的HPLC分析
将浓度5 mg/mL的褐藻胶多糖、实施例6制备的酶制剂、150 mM Tris缓冲液按1：1：1(体积比)的比例混合后，在30℃、pH 8.0的条件下反应2 h，沸水浴中温育10 min使酶失活，12,000×g，4℃离心15 min，取上清，作为酶制剂的酶解产物。对照为失活酶制剂的反应。取上述酶解产物30 μg进行高效液相(HPLC)分析，所用凝胶柱为Cytiva品牌的Superdex 30 Increase 10/300 GL，流动相为0.2 M碳酸氢铵，流速为0.4 mL/min；检测波长为UV232nm。
结果如图7所示，在酶制剂与褐藻胶反应后的主产物中，具有最高吸收值的寡糖片段的出峰时间约为38-40 min之间，提示是不饱和三糖。相比之下，对照组的产物中检测不到任何具有特征吸收的寡糖成分。因此，由溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204菌株制备的酶制剂，含有褐藻胶裂解酶，可用于生产系列不饱和褐藻胶寡糖。
实施例8
溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204酶制剂降褐藻胶产寡糖的分子量分析
按照实施例7所述，将20 mg褐藻胶多糖用实施例6制备的酶制剂进行降解，样品过凝胶柱Superdex 30 Increase 10/300 GL，并根据出峰时间(参照图7)收集上述不饱和三糖，收集的寡糖经过反复冻干三次以上除去碳酸氢铵。用无菌去离子水溶解所得寡糖，进行一级质谱分析，以确定寡糖的相对分子量。
阴离子模式一级质谱结果表明，图7所述的且在232 nm处具有特征吸收的6号峰的ESI(-)-MS所显示的质荷比(m/z)主要为527.12、549.09、571.11(图8)分别与[UDP3-H]-、[UDP3-H+Na]-、[UDP3-H+2Na]-分子量相符，说明6号峰是褐藻胶不饱和三糖（UDP3）。因此，溶藻弧菌H204酶制剂中的褐藻胶裂解酶的这一褐藻胶降解模式及寡糖生成特征，与中国专利文献(申请号：ZL201711408224 .6 )及研究论文[15]所述的褐藻胶裂解酶Aly2相似，说明该菌株产生了褐藻胶裂解酶。
实施例9
溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204酶制剂降解果胶所得产物的HPLC分析
将浓度5 mg/mL的果胶多糖、实施例6制备的酶制剂、150 mM Tris缓冲液按1：1：1(体积比)的比例混合后，在30℃、pH 8.0的条件下反应2 h，沸水浴中温育10 min使酶失活，12,000×g，4℃离心15 min，取上清，作为酶制剂的酶解产物。对照为失活酶制剂的反应。取上述酶解产物进行高效液相(HPLC)分析，所用凝胶柱为Cytiva品牌的 Superdex 30Increase 10/300 GL，流动相为0.2 M碳酸氢铵，流速为0.4 mL/min；检测波长为UV232nm。
结果如图9所示，在酶制剂与果胶反应后的主产物中，具有最高吸收值的寡糖片段的出峰时间约为38-40 min之间，提示是不饱和三糖。相比之下，对照组的产物中检测不到任何具有特征吸收的寡糖成分。因此，由溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204菌株制备的酶制剂，含有果胶降解酶，可用于生产系列果胶寡糖。
本发明提供的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204菌株，能够以褐藻胶，果胶，多聚半乳糖醛酸，透明质酸，硫酸软骨素，几丁质为唯一碳源进行生长，即具有降解多种多糖的酶活性，其中在硫酸软骨素、壳聚糖、褐藻胶中生长旺盛，并且能够产生褐藻胶裂解酶，降解褐藻胶之后所产生的不饱和寡糖，寡糖主产物为不饱和三糖及不饱和四糖；能够产生果胶裂解酶，可用于生产系列果胶寡糖。
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Claims (10)
1.一株溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus) H204，于2022年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCCNo.25216。
2.权利要求1所述溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204菌株的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204菌株样品，接种至固体培养基上，25～30℃培养18～48h，制得活化菌株；
（2）挑取步骤（1）制得的活化菌株，接种至液体培养基中，在温度为25～30℃、转速为180～220转/分钟的条件下，培养16～24h，制得种子液；
（3）将步骤（2）制得的种子液，按1～5％的体积百分比接种于液体培养基中，在温度为25～30℃、转速为180～220转/分钟的条件下，扩大培养4～6天，制得溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204菌液。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（1）、步骤（2）中的液体培养基每升组分如下：
酵母提取物3-10 g，胰蛋白胨5-20 g，碳源1-20 g，余量人工海水，pH 7 .2；
所述人工海水组份如下：KH2PO4 3.0 g、K2HPO4•3H2O 7.0 g、(NH4)2SO4 2.0 g、NaCl30.0 g、FeSO4•7H2O 0.01 g、MgSO4•12H2O 0.01 g定容至1000 mL；
所述步骤（1）中固体培养基在液体培养基基础上每升加入琼脂15-20 g；
所述步骤（1）中碳源为褐藻胶，果胶，多聚半乳糖醛酸，硫酸软骨素，透明质酸或几丁质的一种。
4.权利要求1所述溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204菌株在制备多糖降解酶制剂中的应用。
5.权利要求1所述溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204菌株制备多糖降解酶制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：
①取溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204菌液，按1～5％的体积百分比接种于发酵培养基中，在温度为25～30℃、转速为180～220转/分钟的条件下，扩大培养2-5小时，加入多糖碳源，继续培养3～7天，制得溶藻弧菌H204菌株发酵液；
②取步骤①制得的溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）H204菌株发酵液，超声破碎后，固液分离，取液体，加入硫酸铵，使浓度达到饱和度的80％，离心，收集沉淀，用20～50mL的TGE缓冲液重悬沉淀，透析去除硫酸铵，制得酶制剂，即为多糖降解酶制剂。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤①中的发酵培养基，每升组分如下：
酵母提取物1.5-5 g，胰蛋白胨2.5-10 g，余量人工海水，pH 7 .2；
所述人工海水组份如下：KH2PO4 3.0 g、K2HPO4•3H2O 7.0 g、(NH4)2SO4 2.0 g、NaCl30.0 g、FeSO4•7H2O 0.01 g、MgSO4•12H2O 0.01 g定容至1000 mL；
优选的，步骤①中，溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204菌液的制备，包括如下步骤：
将溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204菌株样品，接种至固体培养基上，25～30℃培养18～48h，制得活化菌株；挑活化菌株，接种至液体培养基中，在温度为25～30℃、转速为180～220转/分钟的条件下，培养16～24h，制得溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204菌液。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤①中，加入多糖碳源的终浓度按质量分数计为0.01%～0.02%；
步骤①中，所述多糖碳源包括褐藻胶、果胶、多聚半乳糖醛酸、透明质酸、硫酸软骨素和/或几丁质。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤②中，固液分离的条件为：1500-5000×g，4℃离心15～30min；
优选的，步骤②中，硫酸铵沉淀后离心条件为：15000×g，4℃离心15～30min；
优选的，步骤②中，TGE缓冲液组分如下：
50mMTris，50mMNaCl，0.5mMEDTA，5mMβ-巯基乙醇，5.0％(v/v)甘油，ddH2O定容至1000mL，pH 7.0；
优选的，步骤②中，透析为采用分子截留量10,000Da的透析袋，进行搅拌透析。
9.权利要求1所述溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)H204菌株在降解多糖中的应用。
10.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多糖包括褐藻胶、果胶、多聚半乳糖醛酸、透明质酸、硫酸软骨素和/或几丁质。
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