CN114591871A - 一种短稳杆菌及其酶制剂在畜禽养殖及加工废弃物转化中的应用 - Google Patents

一种短稳杆菌及其酶制剂在畜禽养殖及加工废弃物转化中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于农林废物资源化无害化利用领域，具体涉及一种短稳杆菌Empedobacter brevis LY‑5及其酶制剂在畜禽养殖及加工废弃物高效转化和资源化利用方面的应用。本发明菌株于2022年03月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），菌种保藏号CGMCC No.24452，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明获得一株能够高效降解羽毛角蛋白废弃物的短稳杆菌LY‑5，在25º酶解羽毛48 h，对羽毛的降解率为80%。该菌能够产生角蛋白酶，1 L发酵液中角蛋白酶总酶活11130 U，提取的角蛋白酶酶制剂对羽毛角蛋白有非常好的降解作用，37ºC酶解羽毛12 h对羽毛的降解率为60%。短稳杆菌LY‑5及角蛋白酶在对畜禽养殖及加工产生的废弃物进行高效转化和资源化利用方面有潜在应用价值。

Description

一种短稳杆菌及其酶制剂在畜禽养殖及加工废弃物转化中的 应用
技术领域
本发明属于农林废物资源化无害化利用领域，具体涉及一种短稳杆菌Empedobacter brevis LY-5及其酶制剂在畜禽养殖及加工废弃物高效转化和资源化利用方面的应用。
背景技术
角蛋白是一种结构蛋白，是脊椎动物表皮及表皮附属物的组成部分，在羽毛、蹄甲、羊毛和动物毛发中含量丰富。作为一种不溶性纤维蛋白，角蛋白分子间存在大量氢键和疏水相互作用，与其他蛋白质相比，角蛋白的胱氨酸和脯氨酸含量丰富，因此角蛋白是一类含硫量高、富含二硫键的结构非常稳定的蛋白质。由于角蛋白高度致密的结构，它很难被普通的蛋白酶如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶等水解，但可以被称作“角蛋白酶”的蛋白酶所水解。
全球畜牧业每年产生数百万吨羽毛废弃物。家禽羽毛角蛋白中含有粗蛋白达80%以上，被认为是一种独特价值的蛋白质饲料。使用传统方法，如填埋、焚烧或使用化学品将羽毛废弃物转化为蛋白质水解物，不但成本高，还会对环境产生有害污染，此外这些方法会导致羽毛的必需氨基酸，如蛋氨酸、赖氨酸和半胱氨酸的损失。从而导致水解物营养价值降低。作为传统方法的替代品，酶和/或微生物降解羽毛废料的方法在转化效率、能源需求、成本和生物量稳定化方面显示出若干优势，同时具有更大的应用潜力。
为了羽毛等畜禽废弃物高效转化的需要，亟需寻找有潜在应用价值、底物更广泛、有新酶解特点的角蛋白降解菌和角蛋白酶资源。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明提供了一种短稳杆菌Empedobacter brevis LY-5（以下简称短稳杆菌LY-5）在降解畜禽养殖及加工废弃物比如羽毛中的应用，还提供了该菌发酵产生的角蛋白酶，以及该酶在降解畜禽养殖及加工废弃物中的应用。
本发明人从屠宰场附近长期堆放羽毛废弃物的沼渣中筛选到一株短稳杆菌LY-5，该菌能在羽毛作为唯一碳源氮源的培养基中生长并高效降解羽毛。本发明菌株于2022年03月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号CGMCC No.24452，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为短稳杆菌Empedobacter brevis。
本发明的短稳杆菌LY-5的发酵培养基的配方（g/L）为：羽毛15，NaCl 0.5，K2HPO41.0，KH2PO4 0.4，MgCl2·7H2O 0.1，CaCl2 0.06，其余为水，NaOH调pH至7.5，培养温度为20~30℃；发酵培养的接种量为1.5～2.5%，优选的为2%（体积），培养时间为48~72 h。
本发明短稳杆菌LY-5角蛋白酶的制备方法：短稳杆菌LY-5通过发酵培养基培养48~72 h后得到发酵液，用纱布过滤掉发酵后培养基渣滓，11000 rpm离心15 min，收集发酵液上清即为角蛋白酶；制备的角蛋白酶催化角蛋白水解的较适宜的温度为45～55℃，pH为8.5～9.5；最适酶活温度为50℃，最适pH为9.0，制备的角蛋白酶属于中温碱性蛋白酶。此外，经检测，角蛋白酶能高效降解羽毛角蛋白。
含有以下至少一种的制剂在降解畜禽养殖及加工废弃物的应用，也是本发明所要重点保护的内容：
短稳杆菌LY-5；
短稳杆菌LY-5的菌剂；
短稳杆菌LY-5的活菌悬液；
短稳杆菌LY-5的死菌悬液；
短稳杆菌LY-5的代谢产物；
短稳杆菌LY-5提取物；
短稳杆菌LY-5发酵产生角蛋白酶/纯化后的酶制剂；
上述的短稳杆菌LY-5的菌种保藏号CGMCC No. 24452。
上述的应用中，所述及的畜禽养殖及加工废弃物包括但不仅限于以下的种类：动物的发、毛、鳞、羽、甲、蹄、角、爪、喙、丝及表皮中的任一种，还可以是其它的含有角蛋白较多的畜禽类副产品。
制剂优选的为角蛋白酶。
角蛋白酶在降解畜禽养殖及加工废弃物包括催化角蛋白水解，水解温度为45～55℃，pH为8.5～9.5。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明获得一株能够高效降解羽毛角蛋白废弃物的短稳杆菌LY-5，在25º酶解羽毛48 h，对羽毛的降解率为80%。该菌能够产生角蛋白酶，1 L发酵液中角蛋白酶总酶活11130 U，提取的角蛋白酶酶制剂对羽毛角蛋白有非常好的降解作用，37ºC酶解羽毛12 h对羽毛的降解率为60%。具体的实验步骤和结果见实施例。
附图说明
图1为短稳杆菌 LY-5在以羽毛为唯一碳源和氮源的培养基中对羽毛的降解；
图2为目视观察（A）、光镜观察（B）和电镜观察（C）短稳杆菌 LY-5形态；
图3为进化树分析短稳杆菌LY-5的进化位置；
图4为短稳杆菌LY-5角蛋白酶降解羽毛角蛋白。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
短稳杆菌LY-5的分离纯化，步骤如下：
羽毛液体培养基（g/L）： 羽毛15， NaCl 0.5，K2HPO4 1.0， KH2PO4 0.4，MgCl2·7H2O 0.1，CaCl2 0.06，NaOH调pH 7.5。
LB液体培养基（g/L）：蛋白胨10，NaCl 10，酵母粉10。
取1 g土壤作为种子接种剂，在100 mL 羽毛液体培养基中培养7 d。培养条件：25℃，180 rpm。取100 µL菌液涂布LB平板，将平板倒置于25℃培养箱中培养24 h。挑选平板上长势良好的菌落在LB平板上连续划线3次对菌株进行纯化，淘汰传代过程中生长能力弱的菌株。纯化好的菌株接种于羽毛液体培养基，25ºC，180 rpm培养48 h，目视观察羽毛降解程度，培养结束后挑选羽毛降解能力强的菌株，测定其发酵液的角蛋白酶酶活并计算羽毛降解率。
角蛋白酶酶活测定方法按照Fang方法略加修改，每分钟660 nm吸光值升高0.01定义为1个酶活单位U（Fang et al., International Biodeterioration & Biodegradation2013, 82: 166-172）；羽毛降解率按照Jaouadi方法测定（Jaouadi et al., PloS ONE,2013, 8(10): e76722）。
本实验筛选获得一株高效降解角蛋白的菌株LY-5，在25º酶解羽毛48 h，对羽毛的降解率为80%（图1）。1 L发酵液中测得角蛋白酶总酶活11130 U。
实施例2
短稳杆菌LY-5菌种鉴定，具体如下：
1. 菌株形态特征
菌株于LB平板25°C培养24 h，菌落呈圆形，直径3 mm左右，淡黄色，菌落扁平，表面湿润有光泽，边缘整齐，菌落随培养时间延长而增大（图2A），革兰氏染色为阴性短杆菌（图2B）。扫描电子显微镜观察细菌呈杆状，两端钝圆，无鞭毛，无芽孢形成，大小为0.55 µm×1.11~2 µm（图2C）。
2. 系统发育学分析
将LY-5菌株单菌落接种于液体LB培养基中，37°C培养过夜。取1 mL培养好的菌液，按照“百泰克细菌基因组提取试剂盒”说明书提取细菌总DNA。
设计16S通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）。以细菌基因组为模板，按照I-5™ 2×High-FidelityMaster Mix（北京擎科生物科技有限公司 TP001）说明书中的PCR体系及程序，PCR获得DNA片段（Frey, B. and Suppman, B., BioChemica. 1995, 2, 34-35; Chester, N. andMarshak, D.R. , Analytical Biochemistry. 1993, 209, 284-290）。利用DNA胶回收试剂盒（Omega）回收DNA片段，操作按试剂盒说明书进行。回收的PCR产物在铂尚生物技术(上海)有限公司测序。
测序共测得16 S rRNA序列全长 1384 bp。将序列在NCBI数据库中BLAST比对分析，序列一致性较高的均为短稳杆菌 Empedobacter brevis，与Empedobacter brevisstrain NBRC 14943菌株16S rRNA序列一致性99%。利用Clustalx X1.83软件对序列一致性较高的菌株的16 S rRNA进行多重比对，利用MEGA 6.0软件的邻接法（Neighbor-JoiningMethod）绘制序列进化树（图3）。
短稳杆菌LY-5的16S rRNA序列如序列表NO.1所示。
分离纯化后获得的短稳杆菌LY-5于2022年03月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号CGMCC NO. 24452，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例3
短稳杆菌LY-5角蛋白酶对羽毛角蛋白的降解，实验步骤如下：
按照实施例1的培养方法，培养结束后，用纱布过滤掉培养基渣滓，11000 rpm离心15 min，收集发酵液上清即为角蛋白酶。
角蛋白酶酶解羽毛：37ºC，150 rpm，羽毛底物1%，酶活10 U，酶解时间12 h。
结果表明该菌所产角蛋白酶能高效降解羽毛，在实验条件下角蛋白酶对羽毛的降解率为60%（图4），这表明本发明所提供的短稳杆菌LY-5产生的新型角蛋白酶在畜禽养殖及加工废弃物的高效转化和资源化利用方面有巨大的应用潜力。
序列表
<110> 山东省农业科学院
<120> 一种短稳杆菌及其酶制剂在畜禽养殖及加工废弃物转化中的应用
<141> 2022-04-01
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1384
<212> DNA
<213> 短稳杆菌(Empedobacter brevis)
<400> 1
tgcaagccga ggggtatgat tctttcggga gtcagagacc ggcgcacggg tgcgtaacgc 60
gtatgcaact tgccctactg aaaaggatag cccttcgaaa ggaggattaa tactttataa 120
cagattgaat ggcatcattt aattttgaaa gatttatcgc agtaggatag gcatgcgtaa 180
gattagttag ttggagaggt aacggctcac caagacgatg atctttaggg ggcctgagag 240
ggtgaacccc cacactggta ctgagacacg gaccagactc ctacgggagg cagcagtgag 300
gaatattgga caatgggtgg aagcctgatc cagccatccc gcgtgtagga tgacggcctt 360
atgggttgta aactactttt atctggggat aaacctactc acgtgtgagt agctgaaggt 420
accagaagaa taagcaccgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatac ggagggtgca 480
agcgttatcc ggatttattg ggtttaaagg gtccgtaggc ggattaatca gtcagtggtg 540
aaatcccgca gcttaactgt ggaactgcca ttgatactgt tagtcttgag tgatgttgaa 600
gtggctggaa tgtgtagtgt agcggtgaaa tgcttagata ttacgcagaa caccaattgc 660
gaaggcaggt cactaagtat caactgacgc tgatggacga aagcgtgggg agcgaacagg 720
attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatggatac ttgctgttgg ggtttcggct 780
tcagtggcta agcgaaagtt ataagtatcc cacctgggga gtacgttcgc aagaatgaaa 840
ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgatgata 900
cgcgaggaac cttaccaagg cttaaatgca taatgacaga tctagaaata gatttttctt 960
cggacagaat gcaaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgccgtgagg tgttaggtta 1020
agtcctgcaa cgagcgcaac ccctatcatt agttgccagc gtttaaagac ggggactcta 1080
atgagactgc cggtgcaaac cgcgaggaag gtggggacga cgtcaagtca tcacggccct 1140
tacgtcttgg gctacacacg tgctacaatg gtaagtacag agggcagcta cttggcaaca 1200
agatgcgaat ctcgaaaact tatctcagtt cggattggag tctgcaactc gactctatga 1260
agctggaatc gctagtaatc gcatatcagc catgatgcgg tgaatacgtt cccgggcctt 1320
gtacacaccg cccgtcaagc catggaagct gggggtacct gaagtcggtg accgtaaaag 1380
gagc 1384

Claims (10)

1.一株短稳杆菌LY-5，其特征在于，短稳杆菌LY-5于2022年03月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No. 24452，分类命名为短稳杆菌Empedobacter brevis，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.如权利要求1所述的短稳杆菌LY-5，其特征在于，所述的短稳杆菌LY-5于LB平板25℃培养24 h后，菌落呈圆形，直径3 mm，呈淡黄色，菌落扁平，表面湿润有光泽，边缘整齐，菌落随培养时间延长而增大，革兰氏染色为阴性短杆菌，扫描电子显微镜观察细菌呈杆状，两端钝圆，无鞭毛，无芽孢形成，大小为0.55 µm×1.11~2 µm；
所述的短稳杆菌LY-5的16S rRNA序列如序列表NO.1所示。
3.如权利要求2所述的短稳杆菌LY-5，其特征在于，所述短稳杆菌LY-5通过如下的发酵培养基培养：羽毛15 g/L、NaCl 0.5 g/L、K2HPO4 1.0 g/L、KH2PO4 0.4 g/L、MgCl2·7H2O0.1 g/L、CaCl2 0.06 g/L，其余组分为水，NaOH调pH至7.5；发酵培养基培养温度为20~30℃，培养时间为48~72 h；
发酵培养基培养时，短稳杆菌 LY-5的接种量为1.5～2.5%（体积）。
4.含有权利要求1所述的短稳杆菌 LY-5的菌剂。
5.短稳杆菌LY-5通过发酵获得的角蛋白酶。
6.如权利要求5所述的角蛋白酶，其特征在于，其制备方法如下：短稳杆菌LY-5通过发酵培养48~72 h后得到发酵液，发酵液11000 rpm离心15 min，收集上清液，获得角蛋白酶。
7.含有以下至少一种的制剂在对畜禽养殖及加工产生的废弃物进行高效降解和资源化利用中的应用：
短稳杆菌LY-5；
短稳杆菌LY-5的菌剂；
短稳杆菌LY-5的活菌悬液；
短稳杆菌LY-5的死菌悬液；
短稳杆菌LY-5的代谢产物；
短稳杆菌LY-5提取物；
短稳杆菌LY-5发酵时所产生的角蛋白酶/纯化后的酶制剂；
所述的短稳杆菌LY-5在权利要求1中所述及。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述畜禽养殖及加工产生的废弃物包括：动物的发、毛、鳞、羽、甲、蹄、角、爪、喙、丝及表皮中的任一种。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，制剂为角蛋白酶。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，角蛋白酶在降解畜禽废弃物包括催化角蛋白水解，水解温度为45～55℃，pH为8.5～9.5。
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