CN102119631A - 用于米糠和麸皮复合原料生产多糖的灰树花菌株 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物应用技术和食品生物技术领域,公开了用于由米糠和麸皮复合原料生产多糖的灰树花菌株。该灰树花菌株JSU10已经于2010年10月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏菌株编号为CGMCC No.4179，经鉴定为奇果菌（Grifola sp.）。本发明通过紫外和微波的复合诱变，提高了能在米糠和麸皮复合培养基上快速生长并产灰树花多糖的灰树花菌株的正突变率，得到了高产菌株，该菌株和原始菌株分别液体发酵米糠和麸皮复合培养基，诱变菌株的菌丝干重和多糖分别比原始菌株提高了39.24%和42.58%。

Description

用于米糠和麸皮复合原料生产多糖的灰树花菌株

技术领域                             

本发明涉及食品微生物应用技术领域，尤其涉及一株适合在米糠和麸皮复合培养基上生长并高产多糖的灰树花菌株的菌株。

背景技术

国内外科学研究和国内市场表明：食用菌多糖能增强人体免疫力，辅助治疗肿瘤等疾病，已成为肿瘤生物疗法选用的辅助用品。国内由食用菌子实体制成的药字号产品有安徽芜湖的灵芝胶囊、浙江庆元的灰树花胶囊等，由食用菌提取物制成的非药字号保健品也有销售。国际上新西兰产有“GanoPoly”（甘诺宝力）多糖提取物系列产品，销往美国、澳大利亚、中国（包括香港和台湾）等地方。该产品的发明人高益槐是国际知名食用菌产品开发专家，曾经获得爱因斯坦发明奖。高益槐发明的“GanoPoly”系列产品主要由灵芝、云芝、猴头等提取的多糖与壳聚糖一道复合构成，用于提高免疫力、辅助抗肿瘤治疗等。新西兰安发保健品有限公司现在中国福建泉州建有食用菌多糖的生产基地。在各种食用菌多糖的研究中，现在已有研究说明，药食两用食用菌灰树花的多糖也具有较好的提高免疫力、辅助抗肿瘤治疗等的功效，值得引起足够的重视，例如Ohno Naohito 、Suzuki Iwao等从灰树花菌体中提取灰树花多糖的药效试验表明，灰树花多糖具有抗肿瘤作用和免疫调节作用（参考文献见① Ohno N,Lino K,Suzuki I et al. Neutral and acidic antitumor polysaccharides extracted from cultured fruit bodies of Grifola Frondosa[J]. Chem. Pharm. Bull,1985,33(3):1181-1186；② Naohito Ohno,Yoshiyuki Adachi,Iwao Suzuki,et al.characterization of the antiumor glucan obtained from liquid-cultured Grifola frondosa[J].Chem.pharm.Bull.1986,34(4):1709；③Iwao Suzuki,Koichi Hashimoto,Shozo Oikawa,et al.Antiumor and immunmodulating activity of a β-glucan obtained from liquid-cultureed Grifola frondosa[J].chem.Pharm Bull,1986,37(2):410.）。

灰树花（Grifola frondosa）是一种药食两用的食用菌，属担子菌亚门，层菌纲，无隔担子菌亚纲，非褶菌目，多孔菌科，树花（亦称奇果菌）属。灰树花有多种名称，如贝叶多孔菌、千佛菌、栗子蘑、莲花菌、奇果菌、舞茸等 。野生灰树花分布于日本、欧洲、北美和我国许多地区，如黑龙江、吉林、河北、四川、云南、广西、福建等省区。近年来，国内灰树花已在一些省份如河北、浙江、福建等省获得栽培，用于鲜食或提取功能成分。 灰树花栽培的缺点是占用土地，生产周期相对较长。为高效生产灰树花多糖，研究人员对能工厂化生产的液体培养方法的研究十分重视，形成多种研究成果。1986年Ohno N等报道了灰树花液态培养的研究。国内江南大学陈石良的博士论文研究了灰树花深层发酵技术及灰树花的抗肿瘤多糖（参考文献见：陈石良. 药用真菌灰树花深层发酵技术及其抗肿瘤多糖的研究[D].博士学位论文.无锡:江南大学，2000.）。这类研究的内容主要涉及培养基研制、培养工艺、适宜菌种选育等。研究的重点是降低生产成本和提高多糖产量。多数工艺采用葡萄糖、粮食类原料如淀粉、马铃薯等作为培养基，即使用到农产品加工的副产品如米糠或麸皮，也是作为次要成分加入，一般还是以葡萄糖、粮食类原料或其他原料为主要碳源或氮源。现有的灰树花菌种难以在不添加葡萄糖或其他粮食类原料的米糠或麸皮的培养基上生长。本专利设计人刘伟民、杨锁华、顾慧敏曾对原有的灰树花菌种在米糠培养基上液体发酵产灰树花多糖的可能性进行过研究，发现尽管对菌株也进行过初步紫外诱变的处理，如不添加较大量的葡萄糖，灰树花在米糠培养基上发酵不理想，所以杨锁华和顾慧敏的硕士论文研究中，仍添加了较多的葡萄糖，故而只以农产品加工副产品为原料生产灰树花多糖以降低成本的设想并没有能得到真正的实现（参考文献见：杨锁华.灰树花发酵米糠制备多糖[D].硕士学位论文.镇江：江苏大学.2006；顾慧敏.灰树花在米糠培养基中液态培养产多糖和富集有机硒的研究[D].硕士学位论文.镇江：江苏大学.2009.）。

中国是农业大国，农副产品来源丰富。米糠、麸皮作为稻谷和小麦加工的副产物，不但其营养成分丰富，而且价格低廉。米糠中富含淀粉、纤维素等物质，而麸皮富含蛋白、纤维素等物质。从理论上讲，米糠和麸皮复合已经具备了灰树花生长所需要的碳源和氮源物质。在灰树花自身纤维素酶及其他酶的作用下，灰树花可将米糠和麸皮转化成自身的营养物质进行生长，生产灰树花多糖。因此，运用米糠、麸皮等廉价农副产品，完全替代葡萄糖等灰树花液体发酵所需的营养物质，生产具有辅助肿瘤治疗的灰树花多糖，将具有经济价值。其关键问题为必须得到适宜在米糠和麸皮复合培养基上生长的灰树花菌株，所以必须对已有菌株进行诱变筛选。如能筛选出适宜的灰树花菌株，则研究和生产将有可能取得突破。目前微生物的物理选育方法主要有紫外诱变、离子束诱变、微波诱变等。为了诱变筛选出适合在米糠和麸皮复合培养基上生长并产多糖的灰树花菌株，有必要将紫外诱变与微波诱变进行复合，强化诱变的极端环境，扩大被试灰树花出发菌株突变的位点范围，提高得到正突变菌株的可能性。本发明所采用的紫外诱变与微波诱变进行复合，诱变得到适合在米糠和麸皮复合培养基上生长并产灰树花多糖的高效菌株的思路还未见有同类报道，所得菌株也为首次发明得到。

发明内容

本发明解决上述现有技术中的不足，为了降低生产成本，可以考虑采用大宗农产品稻谷和小麦等加工的副产品米糠和麸皮作为培养基，不再添加其他碳源如葡萄糖和氮源，进行液体发酵，以节约原料成本、减少使用土地和降低生产周期，但这需要诱变筛选出在米糠麸皮复合培养基上适宜生长的灰树花菌株。因此，为实现上述目的，在自然选育之外，通过生物技术手段对灰树花菌株进行诱变，筛选出适宜的高产菌株尤为重要。此外，应用单一的诱变技术，往往会得到较高的负突变率，且菌株的遗传性和稳定性较差，容易出现回复突变，故需要考虑复合诱变技术以得到一株用于由米糠和麸皮复合原料生产灰树花多糖的灰树花菌株。

本发明将通过紫外和微波的复合诱变的方法，提高正突变率，并以高产多糖为指标，定向转化米糠麸皮为基础，选育出高产、低成本的灰树花菌株。通过一系列的稳定性、遗传性等筛选方法的建立，保证灰树花的优良性状，为进一步大规模利用低成本的米糠和麸皮生产高价值的灰树花多糖奠定基础。

本发明所采取的技术方案如下：

本发明提供一种灰树花菌株JSU10，可以在不加其他碳源和氮源的米糠麸皮复合培养基上具有高生长速率和高多糖产量的灰树花变株；该灰树花菌株JSU10已经于2010年10月8日保藏在中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏菌株编号为CGMCC No.4179，经鉴定为奇果菌（Grifola sp.）。

在本发明的一个方面中，提供上述灰树花菌株JSU10的用途，用于发酵米糠和麸皮复合原料生产灰树花多糖。

本发明的有益效果

国内外有采用紫外线诱变技术选育灰树花高产菌株，但负突变率较高，且并未针对不加其他碳源和氮源的米糠麸皮复合培养基进行灰树花的诱变选育，而采用紫外和微波的复合诱变有可能提高正突变率，选育得到灰树花高产菌株，故本发明由实验室现有的灰树花出发菌株出发进行复合诱变，采用紫外和微波的复合诱变，以生长速率、菌丝干重和菌丝多糖为指标进行筛选，最终获得在不加其他碳源和氮源的米糠麸皮复合培养基上较出发菌株生长速度更快，多糖产量更高的诱变菌株JSU10，其菌丝干重和菌丝多糖分别提高了了39.24%和42.58%。本发明的三种创新：紫外微波复合诱变技术，不加其他碳源和氮源的米糠麸皮复合培养基技术，以及得到的在不加其他碳源和氮源的米糠麸皮复合培养基上生长速度更快、多糖产量更高的诱变菌株JSU10，使得本发明具有明显的有益效果，可以降低生产成本，节约原料成本、减少使用土地和降低生产周期，生产出高价值的具有辅助抗肿瘤治疗效果的灰树花多糖。该方法使用紫外-微波复合诱变法诱变并筛选实验室现有的灰树花菌种，得到具有高生长速率和高多糖产量的突变菌株JSU10，所得菌株适合在米糠和麸皮复合培养基上生长快并高产灰树花多糖，其液体发酵的菌丝干重和多糖较出发菌株分别提高了39.24%和42.58%。灰树花多糖具有辅助抗肿瘤治疗的价值，使得灰树花已经成为一种重要的药用真菌，但灰树花多糖大规模生产依然要面对成本高、产量低等一系列问题。基于此，本发明解决了一个技术问题：提供一株在不加其他碳源和氮源的米糠麸皮复合培养基上生长速度更快、多糖产量更高的灰树花诱变菌株JSU10，所述诱变株是由实验室现有灰树花出发菌株采用紫外和微波复合诱变技术选育，所述诱变株JSU10在相同条件下菌丝干重较出发菌株提高了39.24%，多糖产量较出发菌株提高了42.58%，并经过产纤维素酶鉴定、JSU10与出发菌株的拮抗试验、蛋白电泳谱图比对和酯酶同工酶电泳谱图比对证明诱变后的菌株JSU10与出发菌株在遗传特性和发酵性能不同，从而得到了新的菌株，产生了有益的效果。

附图说明

图1为本发明菌株紫外-微波诱变选育方法的流程图；

图2为产纤维素酶鉴定图，其中注：A.原始菌株；B. JSU10；C. 另一菌株；

图3为JSU10与出发菌株的拮抗图，其中注：左边为原始菌株、右边为JSU10；

图4为蛋白电泳谱图，注：1. Marker；2. 原始菌株；3. JSU10；4. UVW-5；

图5为酯酶同工酶电泳谱图，注：1.原始菌株；2.JSU10；3.UVW-5。

具体实施方式

本发明按照说明书附图1所示的流程，提供了紫外和微波复合诱变选育在不加其他碳源和氮源的米糠麸皮复合培养基上具有高生长速率和高多糖产量的灰树花菌株的方法，所述方法包括下列步骤：

取实验室现有的灰树花为出发菌株；

将灰树花菌株接种于固体斜面培养基上进行正常培养；

菌体培养后生理盐水洗脱制得孢子悬液；

将上述得到的孢子悬液在紫外灯下照射进行诱变后，无光暗培养，一次筛选出生长速率较快、比较稳定的菌株；

将筛选的菌株进行二次微波诱变，二次筛选出生长速率较快，比较稳定的菌株；

在米糠、麸皮液体发酵培养基上进行发酵，三次筛选高生长速率和高多糖产量的菌株；

进行稳定性、降解纤维素能力和遗传性分析和鉴定；

在一个实施方案中，所用的固体斜面培养基为马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75g/L，维生素B₁ 10mg/L，琼脂20g/L，pH自然。

在一个实施方案中，所述恒温为28℃。

在一个实施方案中，所述紫外诱变采用红光暗操作，以二个功率为30W的紫外灯管作为紫外诱变的光源，距离20cm，照射30s。

在一个实施方案中，所述无光暗培养为在28℃下无光培养2-3天。

在一个实施方案中，所述无光暗培养所用培养基为米糠、麸皮固体平板培养基：米糠20g/L，麸皮30g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75g/L，维生素B₁ 10mg/L，琼脂20g/L，pH自然。

在一个实施方案中，所述筛选方法为平板直径测定法。

在一个实施方案中，所述微波诱变采用红光暗操作，微波功率700W，脉冲频率2450Hz诱变时间20s。

在一个实施方案中，所述一次筛选步骤为：从紫外诱变无光暗培养平板上挑取生长良好的单菌落分别接种至新的米糠麸皮固体平板培养基中，挑选出10株生长速度快且浓密的诱变株，对其传代培养，从中选出相对于出发菌株生长快、形状好、稳定性高的菌株进行微波诱变。

在一个实施方案中，所述二次筛选步骤为：从微波诱变无光暗培养平板上挑取生长良好的单菌落分别接种至新的米糠麸皮固体平板培养基中，挑选出5株生长速度快、健壮、纯正的变异株。

在一个实施方案中，所述三次发酵筛选步骤为：二次生长确定的高生长速率变异株作为三次筛选的对象，与出发菌株一起进行三次发酵筛选从而确定变异株优良性状稳定表达的菌株。将二次筛选菌株和出发菌株进行摇瓶发酵试验，连续发酵3代，按指标确定目的诱变株。

在一个实施方案中，所述摇瓶为250mL锥形瓶。

在一个实施方案中，所述米糠、麸皮液体发酵培养基为：米糠20g/L，麸皮30g/L（米糠、麸皮水煮3h取汁），磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75g/L，维生素B₁ 10mg/L，pH自然。

在一个实施方案中，所述指标为菌丝多糖和菌丝干重。

本发明中转化米糠和麸皮复合原料的灰树花突变株的分析鉴定方法，所述方法包括下列步骤：

菌落形态比对；

稳定性分析；

降解纤维素能力分析；

遗传性分析。

在一个实施方案中，所述为菌落形态比对，将斜面上的出发灰树花菌株和JSU10菌株接种到固体斜面培养基上，各6个重复，在28℃恒温培养箱中培养7天，每天观察一次，观察包括菌落的生长速度、颜色、菌落形状、气味等。

在一个实施方案中，所述稳定性分析为以菌丝生长速度为指标考察稳定性，对最终筛选出10株较优的变异菌株，经5次传代，选出最优的JSU10菌株，将该株变异菌株再传代3代，观察菌丝生长速度的变化，从而确定稳定性，并与出发菌株对比。

在一个实施方案中，所述遗传性分析包括产纤维素酶变化、拮抗分析、同工酶电泳分析。

实施例1灰树花紫外线-微波复合诱变

① 孢子悬液的制备

将灰树花接种在9cm灭好菌的固体培养基平板上培养4d后用10mL无菌生理盐水冲洗，用灭菌的毛笔来回扫刷营养体，收集洗液即得。

② 紫外诱变效应曲线及紫外线诱变剂量的选择

取20 个9 cm 平皿, 每皿分别装有新制备的孢子悬液5 mL。每两个为一组, 共分为10 组。分别照射0、5、10 、15 、20 、25 、30 、45 、60 、150 s , 然后每皿取1mL适当稀释后涂平板。平板用黑布包裹后置于黑暗闭光的28℃恒温箱培养。待平板长出菌落后，菌落计数。每组以两个皿菌落数的平均值作为该组的菌落数。计算诱变致死率，以诱变致死率为指标选择紫外线诱变剂量。

式中，A为诱变后菌落再生数；B为诱变前菌落数。

③ 紫外诱变

打开紫外线预热约20min，取直径9cm无菌培养皿2套，分别加入上述调整好的孢子悬液5mL，并放入震动器上，打开板盖，在距离为20cm，功率为30w的紫外灯下按上述选择最佳照射剂量分别照射。盖上皿盖，关闭紫外灯。照射计时从开盖起，加盖止。先开震动器开关，再开盖照射，使孢子悬液中的细胞接受照射均匀等。

④ 诱变菌株的筛选

取紫外照射的菌悬液0.2mL，用无菌玻璃涂棒均匀地涂满米糠、麸皮固体平板培养基表面，每批涂5个平皿，诱变10批，将再生的单菌落分别接种至新的平皿中，挑选出10株生长速度快且浓密的诱变株，对其传代培养，从中选出相对于出发菌株生长快、形状好、稳定性高的菌株进行二次诱变。

⑤二次微波诱变

对首次诱变筛选的最优菌株进行培养，按照上述制备孢子悬液，吸取制得的孢子悬液，注入底部平整的平皿中，每个平皿的悬液量为10mL，调整微波功率为700W，脉冲频率为2450Hz，按照不同的处理时间，对孢子悬液进行辐照处理。吸取孢子悬液0.3mL，涂布米糠、麸皮固体平板培养基，然后置于28℃恒温箱培养3d。活菌计数，计算致死率。连续诱变10批，挑选在米糠麸皮培养基上能最先生长出来、健壮、纯正的菌株，以菌丝生长速率为指标进行筛选，如此筛选到第五代，筛选出5株较好的变异株。

将上述灰树花诱变株进行摇瓶发酵试验，以菌丝多糖、菌丝干重为指标，筛选出目的诱变株。

表1 选出菌株各代发酵菌丝干重

表2 选出菌株各代发酵菌丝体多糖

从表1和2中可以看出变异菌株第一代发酵的菌丝和多糖产量均高于出发菌株，但在第二代和第三代中，其性状发生了一定的变化，而JSU10相对稳定，其菌丝干重和多糖均高于出发菌株，其第三代菌丝干重和多糖产量在100mL摇瓶培养中分别提高了2.4%和11.3%，菌株JSU10于2010年10月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏菌株编号为CGMCC No.4179，经鉴定为奇果菌（Grifola sp.）。

试验一变异菌株的分析

1、生物形态学分析

将斜面上灰树花菌种接种到固体斜面培养基上，6个重复，在28℃恒温培养箱中培养7天，每天观察一次，观察得到的菌落的生长速度、颜色、菌落形状、气味等结果为：突变菌株JSU10生长速度较快，平板在5天内覆盖，出发菌株的平板生长速率为7.38mm/h，突变菌株JSU10的平板生长速率为8.18mm/h，提高了10.84%。JSU10菌落白色，初为绒毛状，后变棉絮状，有几分毡状，菌落厚。反面略呈微黄色，有轻微的奶香味。

、稳定性分析

以菌丝生长速度为指标考察稳定性，对最终筛选出10株较优的变异菌株，经5次传代，选出最优的JSU10菌株，将该株变异菌株再传代3代，观察菌丝生长速度的变化，并与出发菌株对比，从而确定稳定性，再传代3代的结果见表3。

表3 选出菌株各代生长速度

由表3中可以看出，诱变菌株JSU10的生长速度高于出发菌株，其生长速度退化并不很明显，经过8代传代，仍有0.752mm/h的生长速度，由此可见灰树花经紫外-微波复合诱变后产生的性状变异可以遗传。

、降解纤维素分析

在纤维素鉴别培养基中央部位打半径为0.5cm的孔，取0.1mL变异菌株菌悬液注入孔内，28℃培养，观察各变异菌株的生长状况。所述降解纤维素能力分析为在纤维素鉴定培养基上，以平板生长速率为指标分析。所述纤维素鉴定培养基为(NH₄)₂SO₄ 2g/L，MgSO₄ 0.5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，NaCl 0.5g/L，纤维素粉 20 g/L，刚果红 0.2g/L，琼脂 20g/L，pH自然。

试验结果见说明书附图2。可以看出出发菌株的生长半径（2.324cm）高于JSU10（1.916cm），但出发菌株较为稀疏，JSU10较致密，说明两株菌株分解纤维素酶活不同，在产生纤维素酶性能上JSU10与出发菌株相比发生了变化。附图2中的另一菌株分解纤维素酶活比JSU10好，但经发酵评价，其多糖的生产能力不如JSU10，故本发明未予采用。

、遗传性分析

(1)   拮抗性分析

把变异菌株和出发菌株同时接种在PDA平板上，两菌株相距一定的距离，放在28℃的培养箱中培养，4d后观察菌落间的拮抗现象。

不同种的食用菌菌丝在生长发育中，菌丝会相互限制对方的生长蔓延，产生拮抗，在交界处形成拮抗线，这就是拮抗现象。拮抗现象不仅在食用菌的不同种间存在，而且在同种但遗传特性有差异的菌株之间也存在，菌株之间拮抗作用的强弱反映了菌株间遗传差异性的大小，因此拮抗现象不仅可以用于判断菌株间的亲缘关系，而且可以用于育种，鉴定菌株是否产生变异。本试验将出发菌株与变异菌株接于平板上菌产生了一定的拮抗，从说明书附图3可以看出右边变异菌株JSU10的生长形态发生了一定的变化，其菌丝生长致密，且与左边出发菌株形成了拮抗线，说明了出发菌株和变异菌株JSU10产生了遗传差异性。

(2)   同工酶电泳分析

同工酶电泳分析试验包含以下步骤。

① 蛋白提取

称取米糠麸皮培养基上生长4d的菌丝1g，加2mL缓冲液（内含0.065mol/L Tris-柠檬酸，pH8.2），-20℃下冷冻24h，置于研钵中，冰浴下研磨成糊状，4℃下离心（10000r/min,10min），取上清液放于4℃冰箱保存备用。

② 凝胶配制

4%浓缩胶组成为：Tris-HCl缓冲液（pH6.8）2.5mL、Ars/Bis贮液1.3mL、10%过硫酸铵50μL、TEMED10μL、双蒸水6.14mL。10%的酯酶同工酶分离胶组成为：Tris-HCl缓冲液（pH8.8）6.25mL、Ars/Bis贮液8.3mL、10%过硫酸铵125μL、TEMED12.5μL、双蒸水10.32mL。灌好分离胶后在液面上方轻轻加入高1cm的正丁醇，注意不要搅动液面。放在40℃条件下静止30-60min，等凝胶凝固后倒出上面的正丁醇，用浓缩胶缓冲液淋洗分离胶上端空腔，然后再加一层分离胶缓冲液，让其室温过夜。第二天倒掉分离胶缓冲液，按浓缩胶配制要求依次取各种溶液，混匀后加入玻璃板间隙中，把干净的电泳梳（水洗干净，临用前用无水乙醇擦洗，挥发至干）轻轻插入胶液中，室温放置30min，待胶凝聚后，小心移出电泳梳，用电极缓冲液淋洗胶面样品槽。

③ 加样与电泳

把电极缓冲液倒入上槽和下槽，吸取20μL样品，插入样品槽底部胶面上，推动样品液进入样品小槽底部，加样毕，轻轻抽出进样器。打开电泳仪，开始稳压50V，待溴酚蓝进入分离胶后加大电压至100V，3个小时左右结束电泳。

④ 染色

蛋白染色：将胶板浸于考马斯亮蓝染色液中，37℃染色1～2 h，至谱带清晰。

酯酶同工酶染色：称取50mg醋酸-α-萘酯和50mg醋酸-β-萘酯，分别用5mL丙酮溶解，然后溶解后的醋酸萘酯倒入100mL的0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.4）中，在恒温水浴振荡器上染色（37℃，100r/min）15～20 min 后弃去染色液 ,用蒸馏水稍加漂洗，再用0.05%KMnO₄溶液染色，直至显出酶带，等酶带清晰后用自来水冲洗干净，进行照相分析，染色液要即用即配。

⑤ 电泳图谱分析

染色后的胶板用卡尺测量指示剂及各条酶带的迁移距离，按式计算迁移率R _f 值。

式中，x ₁为酶带迁移距离；x ₂为指示剂迁移距离。图谱见说明书附图4和5。

电泳分析结果为：

从附图4蛋白图谱中可以看出，出发菌株有7条谱带，分子量分别为98000，97000，87200，81800，66200，31300、17000道尔顿，与出发菌株相比较，JSU10菌株在分子量31300和17000道尔顿位置上谱带消失，其遗传特性与出发菌株相比发生变化。

从附图5酯酶同工酶图谱可知，出发菌株有1条谱带，位置为：R _f =0.333。与出发菌株相比JSU10菌株的谱带也出现在此，酶带条数没有变化，但JSU10菌株酶带较浅，酶活性与出发菌株的酶活性不同，说明遗传特性相对于出发菌株发生变化。

试验二突变菌株JSU10和出发菌株产量比较

经筛选的诱变菌株和出发菌株进行发酵罐发酵，比较发酵性能。

使用丹麦诺维信公司生产的酶活为1590.41IU/mL(FPU酶活)的植物水解酶Viscozyme L，按36FPU/g原料添加酶，固液比采用1：15，酶解时间为15h对米糠和麸皮进行处理，得到处理液作为培养基用于发酵。装样量为发酵罐容积的80%，培养温度为28℃，通风量1：0.8v/v/mim，搅拌速度150r/min，罐表压0.05MPa，接种量8%，培养时间4d，发酵培养基为米糠100g/L，麸皮110g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75g/L，pH自然。称重法测定菌丝干重，苯酚硫酸法测定菌丝多糖。将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3 次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60℃条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸馏水，经研磨后，在80℃水浴中浸提3h，3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖。在4℃的冰箱中醇沉24h，经离心、冷冻干燥，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。发酵液离心后的上清液适当浓缩到原来的1/5的体积，Sevage法脱蛋白后用3倍体积的95%的乙醇提取胞外多糖，并且在4℃的冰箱中醇析24小时，离心即得到胞外粗多糖的沉淀。将此沉淀物用丙酮、乙醚依次洗涤后，干燥，称量得到胞外多糖的质量。试验结果为：（1）突变菌株JSU10和出发菌株在相同条件和培养基中发酵，菌丝干重分别为10.0g/L和7.21g/L，突变菌株JSU10的菌丝干重较出发菌株提高了39.24%。（2）突变菌株JSU10和出发菌株在相同条件和培养基中发酵，菌丝多糖两者分别为1.02g/L和0.718g/L， 突变菌株JSU10的菌丝多糖较出发菌株提高了42.58%。发酵试验表明，JSU10和原始菌株相比，发酵性能发生了变化。

Claims (2)

1.灰树花菌菌株（Grifola sp.）CGMCC No.4179。

2.权利要求1所述的灰树花菌菌株（Grifola sp.）的用途，其特征在于用于由米糠和麸皮复合原料生产灰树花多糖。

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