CN102690773B - 一株肠杆菌fy-07及其静态液体深层发酵生产细菌纤维素的方法 - Google Patents
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Abstract
一株肠杆菌FY-07及静态液体深层发酵法生产细菌纤维素。本发明菌株是从油田采出液中分离驯化得到，其分类命名为肠杆菌Enterobactersp.，其保藏号为CGMCCNo.6103。该菌可在普通牛肉汁、LB、营养琼脂营养培养基中生长，也可在含糖的无机盐培养基中生长并产生细菌纤维素。本发明提供的FY-07菌株在20~35℃温度条件下，能够在含糖或不含糖的无机盐和水的无菌培养基中发酵产生细菌纤维素，其纤维素产量可以达到5.17~10.32g/L，且其纤维素产量不受培养体系的装液量和氧化还原电位影响。利用本发明提供的FY-07菌株可以实现静态液体深层发酵法生产细菌纤维素。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和生物材料技术领域，具体地说，它涉及一株肠杆菌FY-07（Enterobacter sp.FY-07）菌株，及利用该菌株进行静态液体深层发酵生产细菌纤维素的方法。
背景技术
细菌纤维素（Bacterial Cellulose，简称BC）是细菌产生的一种胞外多糖，由葡萄糖分子以β-1,4-糖苷键连接而成。与植物纤维素相比，细菌纤维素具有许多独特的性质：①高化学纯度和高结晶度，无伴生的木质素和半纤维素；②超精细的网状结构，纤维是由直径3~4nm的亚纤维组合成40~60nm粗的纤维束,并相互交织形成发达的超精细网络结构；③较高的弹性模量，其直径在0.01~0.1μm之间，弹性模量为一般植物纤维的数倍至十倍以上,并且抗拉强度高；④很强的持水能力，能吸收60~700倍于干重的水分；⑤较高的生物相容性和生物可降解性，不污染环境。由于细菌纤维素具有以上优异的特性，在造纸、食品、医药、扬声器材、生物医学工程、石油开采等行业中具有广泛的应用前景。
目前已经发现能够产生纤维素的细菌包括：Acetobacter，Alcaligenes，Sarcina，Rhizobium，Pseudomounas，Azotobacter，Agrobacterium，Achromobacter，Aerobacter，Gluconacetobacter，Vibrio，Salmonella，Escherichia等。其中只有Gluconacetobacter和Acetobacter的某些种具有商业化生产前景。但这两个属的纤维素产生菌均为好氧菌株，只能在供氧充足的条件下大量产生细菌纤维素。氧的浓度对好氧菌的生长、纤维素的产量以及纤维素膜的物理特性均有很大影响。研究表明：当氧分压小于10%～15%时，纤维素的产量和膜的韧性随氧分压的增大而增强。这就要求在生产中必须设法满足氧的供应。例如可以通过增加培养基与空气的接触面积（薄层静态培养），这样做无疑会增加占地面积及劳动强度，不适合规模化生产；还可以采用通气、搅拌等方式增加溶氧（动态培养）。但静态培养和动态培养产生的纤维素虽然在化学成分上完全相同，但在形态和物理性能方面差异却很大，例如，静态培养比动态培养产生的纤维素结晶度、杨氏模量和产量等更高；此外，较高的剪切力可能使纤维素产生菌突变为不产纤维素菌株。因此，提高溶氧、降低剪切力是细菌纤维素培养方式的发展方向。随之出现了动态-静态二步培养法及独特的发酵反应器设计（例如生物转盘反应器、球形鼓泡塔等），但始终无法达到静态培养的效果。因此，目前细菌纤维素的生产主要是通过浅盘静态培养。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够在好氧和厌氧条件下均能高产细菌纤维素的肠杆菌；同时提供一种利用静态液体深层发酵法生产细菌纤维素的工艺，以及从发酵终产物中提取细菌纤维素的方法。
本发明提供的肠杆菌FY-07（Enterobacter sp.FY-07）菌株，于2012年5月11日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），其保藏号为CGMCC No.6103，分类命名为肠杆菌Enterobacter sp.。
本发明提供的肠杆菌FY-07（Enterobacter sp.FY-07）菌株，可在普通牛肉汁、LB、营养琼脂营养培养基中生长，也可在含糖的无机盐培养基中生长并产生细菌纤维素。该菌株在15～40℃之间的任一温度，且于好氧和厌氧条件下均能生长。
本发明提供的肠杆菌FY-07（Enterobacter sp.FY-07）菌株，是以含糖无机盐培养基为基础从油田采出液中分离，并以糖为唯一碳源在30°C反复驯化培养而获得。
本发明提供的肠杆菌FY-07（Enterobacter sp.FY-07）菌落特征：在LB琼脂（蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl5g/L，琼脂粉20g/L）平板上30°C培养24h即可长出白色、圆形菌落，菌落呈颗粒状，边缘规则，大小直径1～2mm，与培养基接触不紧密。
本发明提供的肠杆菌FY-07（Enterobacter sp.FY-07）菌株的形态特征：革兰氏染色阴性，菌体呈短杆状，大小0.5~1.0μm（宽）×1.0~2.5μm（长），不形成芽孢。
本发明提供的肠杆菌FY-07（Enterobacter sp.FY-07）菌株生理生化特征：生长温度15~40℃，生长pH范围5~12，NaCl耐受性0~5％；接触酶，柠檬酸盐利用，吲哚产生，硝酸盐还原实验均为阳性；V.P.，淀粉水解，甲基红，亚硝酸盐还原实验为阴性；葡萄糖发酵为氧化型；对氧的需求为兼性厌氧型。
本发明提供的肠杆菌FY-07（Enterobacter sp.FY-07）菌株的16S rRNA基因序列特征：将FY-07菌株接种于LB培养基（蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L），30℃摇床培养（180rpm）24小时，离心收集菌体，重新悬浮，加溶菌酶和SDS破壁，由酚-氯仿法提取基因组DNA，并采用上游引物（5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和下游引物（5’-AAGGAGGTGATCCA GCCGCA-3’），用这对引物对其16S rDNA基因进行PCR扩增，将扩增引物送大连宝生物公司进行测序，其16S rDNA的序列如SEQ ID No.1所示。PCR条件为：94℃，5min；94℃，45s，56.2℃，45s，72℃90s，30个循环；72℃9min，4℃保存。16S rDNA基因序列长度为1531bp，与Enterobacter cloacae ATCC 13047(99.1%),Enterobacter aerogenes KCTC 2190(98.7%)的同源性均大于98%。
本发明同时还提供了使用上述肠杆菌FY-07（Enterobacter sp.FY-07）菌株生产细菌纤维素的方法，该方法以1~3g/L的NH4NO3，0.5~1.5g/L的KH2PO4，0.3~0.7g/L的K2HPO4·3H2O，0.2~0.5g/L的MgSO4·7H2O，0.1~0.3g/L的MnCl2和10~50g/L的葡萄糖组成发酵培养基，使用静态液体深层发酵法生产细菌纤维素，并依次经过预处理、碱处理、水洗和干燥，从发酵终产物中提取细菌纤维素。
具体工艺步骤是：
第一、以无菌水将原始菌种从一个或多个斜面上洗下，直接接入含有万分之一纤维素酶的LB培养基中，好氧发酵培养制成一级种子液；所述的LB培养基的组成包括：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，以蒸馏水配制；
第二、将上步培养的一级种子液以5%的接种量接入二级种子培养基中进行好氧发酵培养，制成二级种子液；其中二级种子培养基的组成包括：1~3g/L的NH4NO3，0.5~1.5g/L的KH2PO4，0.3~0.7g/L的K2HPO4·3H2O，0.2~0.5g/L的MgSO4·7H2O，0.1~0.3g/L的MnCl2和5~20g/L的葡萄糖，以蒸馏水配制；
第三、将第二步制成的二级种子液以10%的接种量接入发酵培养基中进行静态液体深层发酵生产细菌纤维素；其中发酵培养基的组成包括：1~3g/L的NH4NO3，0.5~1.5g/L的KH2PO4，0.3~0.7g/L的K2HPO4·3H2O，0.2~0.5g/L的MgSO4·7H2O，0.1~0.3g/L的MnCl2和10~50g/L的葡萄糖，以蒸馏水配制；
第四、将第三步中获得的发酵产物，依次经过预处理、碱处理、水洗、干燥的后提取处理工艺得到细菌纤维素。
后提取处理工艺的具体操作过程是：
（1）预处理：用水洗方法去除细菌纤维素水合物中大部分未与纤维素结合的菌体及其碎片等杂质；
（2）碱处理：再用0.1mol/L的NaOH溶液于80℃条件下浸泡2h，除去纤维素水合物中的菌体和残留培养基；
（3）水洗：再用蒸馏水多次冲洗，直至纤维素水合物的pH值近7.0；
（4）干燥：最后将纤维素水合物风干或真空干燥，即制得细菌纤维素。
本发明的优点和有益效果：
细菌纤维素以其独特的性能及广阔的应用前景成为近二十年来研究的热点。但目前有潜力作为纤维素工业化生产的菌株比较单一，均为醋酸杆菌属和葡糖醋杆菌属的菌株，且它们都是好氧菌。与目前细菌纤维素工业生产中用到的菌种均为好氧细菌不同，本发明提供的肠杆菌FY-07（Enterobacter sp.FY-07）菌株为兼性厌氧细菌，不仅可以在好氧、厌氧等不同氧化还原电位下生长，并在好氧和厌氧条件下均可以大量产生细菌纤维素，且其产量可以达到10g/L，达到甚至超过纤维素工业主流菌种的产量。肠杆菌FY-07在好氧和厌氧条件下均能大量细菌纤维素的特点使利用静态液体深层发酵法生产细菌纤维素成为可能，给细菌纤维素生产工艺带来重大变革，大幅降低细菌纤维素的生产成本，改善细菌纤维素的产品质量。
附图说明
图1是肠杆菌FY-07在LB固体培养基上30℃培养24h后的菌落照片；
图2是肠杆菌FY-07在发酵培养基上30℃培养24h后的菌体电镜照片；
图3是不同氧化还原电位下肠杆菌FY-07的纤维素产量；
图4是肠杆菌FY-07合成细菌纤维素的发酵动态曲线；
图5是限氧条件下肠杆菌FY-07培养体系氧化还原电位的变化；
图6是静态培养时获得的细菌纤维素水合物状态图。
具体实施方式
实施例1
本发明提供的肠杆菌FY-07（Enterobacter sp.FY-07）菌株的筛选和育种。
取10mL吉林油田的油田采出液于90mL含葡萄糖无机盐培养基中（培养基组成：KH2PO43.48g/L，Na2HPO4·12H2O 1.5g/L，(NH4)2SO42g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，酵母提取物0.05g/L，葡萄糖10g/L，蒸馏水1000mL，pH7.2，105℃灭菌30min），置于200r/min低温摇床30℃富集培养5天。由于细菌纤维素具有精细的网状结构，致使其菌落与固体培养基表面接触不紧密，挑取菌落时容易在固体培养基表面滑动。因此将上述富集培养物在固体平板上划线培养后选取与培养基表面接触不紧密的菌落进行复筛；复筛时将挑选的菌落接种至新鲜的100mL葡萄糖无机盐培养基中进行传代驯化，培养条件同上；经过5～7个周期富集后最终得到FY-07；在LB琼脂（蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，琼脂粉20g/L）平板上反复划线，挑取单菌落划斜面保存；将FY-07菌落分别取一环接入装有5mL LB培养基（蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L）的试管内，30℃震荡培养48h，作为种子液；分别取1mL种子液接入装有100mL葡萄糖无机盐培养基的250mL三角瓶中，30℃培养3d，检测多糖聚合物的产量和种类（具体方法详见实施例4和实施例5），选取纤维素产量最高的菌株作为选育目的菌株。
实施例2
肠杆菌FY-07（Enterobacter sp.FY-07）菌株的形态特征和生理生化特征。
参照《Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology》（Vol.Ⅷ）的实验方法进行，检测其革兰氏染色，菌体大小和形态，有无芽孢，生长温度，生长pH范围，NaCl耐受性。接触酶，M.R.实验，V.P.实验，吲哚产生，硝酸盐还原，淀粉水解，柠檬酸盐利用，葡萄糖发酵等实验。
肠杆菌FY-07在LB琼脂（蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，琼脂粉20g/L）平板上30°C培养24h即可长出白色、圆形菌落，菌落呈颗粒状，边缘规则，大小直径1～2mm，与培养基接触不紧密；革兰氏染色阴性，菌体呈短杆状，大小0.5~1.0μm（宽）×1.0~2.5μm（长），不形成芽孢；生长温度15~40℃，生长pH范围5~12，NaCl耐受性0~5％；接触酶，柠檬酸盐利用，吲哚产生，硝酸盐还原实验均为阳性；V.P.，淀粉水解，M.R.，亚硝酸盐还原实验为阴性；葡萄糖发酵为氧化型；对氧的需求为兼性厌氧型。
实施例3
肠杆菌FY-07（Enterobacter sp.FY-07）菌株的16S rRNA基因的PCR扩增和序列测定。
本发明提供的肠杆菌FY-07（Enterobacter sp.FY-07）菌株的16S rRNA基因序列特征：将FY-07菌株接种于LB培养基（蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L），30℃摇床培养（180rpm）24h，离心收集菌体，重新悬浮，加溶菌酶和SDS破壁，由酚-氯仿法提取基因组DNA，并采用上游引物（5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和下游引物（5’-AAGGAGGTGATCCA GCCGCA-3’），用这对引物对其16S rDNA基因进行PCR扩增，将扩增引物送大连宝生物公司进行测序，其16S rDNA的序列如SEQ ID No.1所示。PCR条件为：94℃，5min；94℃，45s，56.2℃，45s，72℃90s，30个循环；72℃9min，4℃保存。16S rDNA基因序列长度为1531p，与Enterobacter cloacaeATCC 13047(99.1%),Enterobacter aerogenes KCTC 2190(98.7%)的同源性均大于98%。
实施例4
肠杆菌FY-07（Enterobacter sp.FY-07）菌株的多糖聚合物定性分析。
肠杆菌FY-07（Enterobacter sp.FY-07）菌株产生的聚合物不溶于水、醇、酮等有机溶剂。
聚合物的双缩脲反应、斐林试剂反应均为阴性，说明样品中不含游离的氨基酸和单糖类物质。采用不同的特异性显色方法对聚合物样品和酸水解后的样品进行薄层定性分析。酸水解前后的聚合物样品用硫酸-蒽酮显色后都呈明显的蓝绿色斑点，说明样品中含有糖类成分；聚合物样品的丁酮抽提物用钼酸铵-高氯酸显色无明显斑点，说明聚合物中不含有脂类物质；用茚三酮显色水解聚合物样品无明显斑点，说明聚合物样品中不含有多肽组分。
聚合物样品经过三氟乙酸水解后，气相色谱法测定单糖组成，结果表明样品中只含有一种单糖，其相对保留时间为14.542，与葡萄糖标准品的相对保留时间一致。进一步采用酶解法确定聚合物中葡萄糖苷键的链接方式，结果表明：肠杆菌FY-07产生的多糖只能被纤维素酶水解而不能被淀粉酶、半纤维素酶、果胶酶等糖苷酶水解。说明肠杆菌FY-07产生的多糖为葡萄糖分子以β-1,4-糖苷键连接而成的纤维素。
实施例5
本发明提供的肠杆菌FY-07（Enterobacter sp.FY-07）菌株生产细菌纤维素的方法1。
将肠杆菌FY-07在以1g/L的NH4NO3，0.5g/L的KH2PO4，0.3g/L的K2HPO4·3H2O，0.2g/L的MgSO4·7H2O，0.1g/L的MnCl2和10g/L的葡萄糖组成的培养基为发酵培养基进行发酵，发酵过程是在20℃，pH 6.0的条件下进行静态液体深层发酵，对发酵终产物采用预处理、碱处理、水洗和干燥技术，从发酵终产物中提取细菌纤维素。具体工艺步骤是：
1、以无菌水将原始菌种从一个或多个斜面上洗下，直接接入含有万分之一纤维素酶的LB培养基（蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L）中，好氧发酵24～36h制成一级种子液；
2、将一级种子液以5%的接种量接入二级种子培养基（1g/L的NH4NO3，0.5g/L的KH2PO4，0.3g/L的K2HPO4·3H2O，0.2g/L的MgSO4·7H2O，0.1g/L的MnCl2和5g/L的葡萄糖，以蒸馏水配制）中20℃好氧发酵24～36h制成二级种子液；
3、将二级种子液以10%的接种量接入发酵培养基（1g/L的NH4NO3，0.5g/L的KH2PO4，0.3g/L的K2HPO4·3H2O，0.2g/L的MgSO4·7H2O，0.1g/L的MnCl2和10g/L的葡萄糖，以蒸馏水配制）中，于20℃条件下进行静态液体深层发酵生产细菌纤维素。
4、将发酵终产物进行后提取处理工艺得到纤维素，包括如下步骤：
（1）预处理：用水洗方法去除细菌纤维素水合物中大部分未与纤维素结合的菌体及其碎片等杂质；
（2）碱处理：再用0.1mol/L的NaOH溶液于80℃条件下浸泡2h，除去纤维素水合物中的菌体和残留培养基；
（3）水洗：再用蒸馏水多次冲洗，直至纤维素水合物的pH值近7.0；
（4）干燥：最后将纤维素水合物风干或真空干燥，即制得细菌纤维素。统计称重纤维素产量约为5.17g/L。
实施例6
本发明提供的肠杆菌FY-07（Enterobacter sp.FY-07）菌株生产细菌纤维素的方法2。
将肠杆菌FY-07在以2g/L的NH4NO3，1g/L的KH2PO4，0.5g/L的K2HPO4·3H2O，0.35g/L的MgSO4·7H2O，0.2g/L的MnCl2和30g/L的葡萄糖组成的培养基为发酵培养基进行发酵，发酵过程是在30℃，pH 7.0的条件下进行静态液体深层发酵，对发酵终产物采用预处理、碱处理、水洗和干燥技术，从发酵终产物中提取细菌纤维素。具体工艺步骤是：
1、以无菌水将原始菌种从一个或多个斜面上洗下，直接接入含有万分之一纤维素酶的LB培养基（蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L）中，好氧发酵24～36h制成一级种子液；
2、将一级种子液以5%的接种量接入二级种子培养基（2g/L的NH4NO3，1g/L的KH2PO4，0.5g/L的K2HPO4·3H2O，0.35g/L的MgSO4·7H2O，0.2g/L的MnCl2和10g/L的葡萄糖，以蒸馏水配制）中30℃好氧发酵24～36h制成二级种子液；
3、将二级种子液以10%的接种量接入发酵培养基（2g/L的NH4NO3，1g/L的KH2PO4，0.5g/L的K2HPO4·3H2O，0.35g/L的MgSO4·7H2O，0.2g/L的MnCl2和30g/L的葡萄糖，以蒸馏水配制）中，于30℃条件下进行静态液体深层发酵生产细菌纤维素。
4、将发酵终产物进行后提取处理工艺得到纤维素，包括如下步骤：
（1）预处理：用水洗方法去除细菌纤维素水合物中大部分未与纤维素结合的菌体及其碎片等杂质；
（2）碱处理：再用0.1mol/L的NaOH溶液于80℃条件下浸泡2h，除去纤维素水合物中的菌体和残留培养基；
（3）水洗：再用蒸馏水多次冲洗，直至纤维素水合物的pH值近7.0；
（4）干燥：最后将纤维素水合物风干或真空干燥，即制得细菌纤维素。统计称重纤维素产量约为10.32g/L。
实施例7
本发明提供的肠杆菌FY-07（Enterobacter sp.FY-07）菌株生产细菌纤维素的方法3。
将肠杆菌FY-07在以3g/L的NH4NO3，1.5g/L的KH2PO4，0.7g/L的K2HPO4·3H2O，0.5g/L的MgSO4·7H2O，0.3g/L的MnCl2和50g/L的葡萄糖组成的培养基为发酵培养基进行发酵，发酵过程是在35℃，pH 8.0的条件下进行静态液体深层发酵，对发酵终产物采用预处理、碱处理、水洗和干燥技术，从发酵终产物中提取细菌纤维素。具体工艺步骤是：
1、以无菌水将原始菌种从一个或多个斜面上洗下，直接接入含有万分之一纤维素酶的LB培养基（蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L）中，好氧发酵24～36h制成一级种子液；
2、将一级种子液以5%的接种量接入二级种子培养基（3g/L的NH4NO3，1.5g/L的KH2PO4，0.7g/L的K2HPO4·3H2O，0.5g/L的MgSO4·7H2O，0.3g/L的MnCl2和20g/L的葡萄糖，以蒸馏水配制）中35℃好氧发酵24～36h制成二级种子液；
3、将二级种子液以10%的接种量接入发酵培养基（3g/L的NH4NO3，1.5g/L的KH2PO4，0.7g/L的K2HPO4·3H2O，0.5g/L的MgSO4·7H2O，0.3g/L的MnCl2和50g/L的葡萄糖，以蒸馏水配制）中，于35℃条件下进行静态液体深层发酵生产细菌纤维素。
4、将发酵终产物进行后提取处理工艺得到纤维素，包括如下步骤：
（1）预处理：用水洗方法去除细菌纤维素水合物中大部分未与纤维素结合的菌体及其碎片等杂质；
（2）碱处理：再用0.1mol/L的NaOH溶液于80℃条件下浸泡2h，除去纤维素水合物中的菌体和残留培养基；
（3）水洗：再用蒸馏水多次冲洗，直至纤维素水合物的pH值近7.0；
（4）干燥：最后将纤维素水合物风干或真空干燥，即制得细菌纤维素。统计称重纤维素产量约为8.52g/L。
实施例8
本发明提供的肠杆菌（Enterobacter sp.FY-07）菌株发酵生产细菌纤维素时对氧的需求。
将肠杆菌FY-07分别在有氧、限氧和无氧条件下进行静态液体深层发酵培养，测定其在不同氧化还原电位下菌体生长和细菌纤维素的产生状况。以无菌水将原始菌种从一个或多个斜面上洗下制成菌悬液（1~2×107cells/mL），然后将此菌悬液直接接入发酵培养基（2g/L的NH4NO3，1g/L的KH2PO4，0.5g/L的K2HPO4·3H2O，0.35g/L的MgSO4·7H2O，0.2g/L的MnCl2和30g/L的葡萄糖，以蒸馏水配制）中，30℃条件下进行静态液体深层发酵生产细菌纤维素。好氧培养在250mL三角瓶中进行，装液量为230mL,三角瓶用可以通气的乳胶塞封口。厌氧培养时，应先将培养基煮沸，加入终浓度为1mg/L的刃天青，密封、灭菌。然后，在经紫外照射灭菌的厌氧培养箱中加入0.5g/L的半胱氨酸盐酸盐，调节pH至7.0，接种后通无菌N2(2.0m3/h)直至培养基变为无色，最后分装到厌氧瓶中。限氧培养在厌氧培养瓶中进行，与厌氧培养不同的是培养体系不除氧，不加半胱氨酸盐酸盐。纤维素的提取和定量参照实施例5中的第4步进行。
在不同氧化还原电位条件下肠杆菌FY-07均能大量产生细菌纤维素，其产量可以达到5.17~10.32g/L，且不同氧化还原电位下细菌纤维素的产量并没有较大变化，说明在利用肠杆菌FY-07发酵生产纤维素时氧的有无不影响其生长和纤维素产量。限氧条件下，培养体系的氧化还原电位随着菌体的生长和纤维素的产生逐渐降低。肠杆菌FY-07不是只在培养基表面产生细菌纤维素，并逐渐形成纤维素膜的；而是在整个培养体系中产生细菌纤维素，形成果冻状细菌纤维素水合物，之后随着纤维素中气体含量的增加改变了它的比重，逐渐漂浮到液面形成了纤维素膜。这使得利用静态液体深层发酵法生产细菌纤维素成为可能。
Claims (4)
1.一种肠杆菌（Enterobacter sp.）FY-07菌株，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，分类命名为肠杆菌Enterobacter sp.，保藏号为CGMCC No.6103。
2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于：
所述的肠杆菌FY-07菌落特征：在LB琼脂平板上30℃培养24h即可长出白色、圆形菌落，菌落呈颗粒状，边缘规则，大小直径1～2mm，与培养基接触不紧密；所述LB琼脂的组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl5g/L，琼脂粉20g/L；
肠杆菌FY-07菌株的形态特征：革兰氏染色阴性，菌体呈短杆状，大小0.5～1.0μm×1.0～2.5μm，不形成芽孢；
肠杆菌FY-07菌株生理生化特征：生长温度15～40℃，生长pH范围5～12，NaCl耐受性0～5％；接触酶，柠檬酸盐利用，吲哚产生，硝酸盐还原实验均为阳性；V.P.，淀粉水解，甲基红，亚硝酸盐还原实验为阴性；葡萄糖发酵为氧化型；对氧的需求为兼性厌氧型。
3.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于所述的肠杆菌FY-07的16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。
4.一种使用权利要求1所述菌株生产细菌纤维素的方法，其特征在于该方法在以1～3g/L的NH4NO3，0.5～1.5g/L的KH2PO4，0.3～0.7g/L的K2HPO4.3H2O，0.2～0.5g/L的MgSO4.7H2O，0.1～0.3g/L的MnCl2和10～50g/L葡萄糖组成的发酵培养基中进行静态液体深层发酵，并采用预处理、碱处理、水洗和干燥，从发酵终产物中提取制得细菌纤维素，具体工艺步骤是：
第一、以无菌水将原始菌种从一个或多个斜面上洗下，直接接入含有万分之一纤维素酶的LB培养基中，好氧发酵24～36h培养制成一级种子液；所述的LB培养基的组成包括：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl5g/L，以蒸馏水配制；
第二、将上步培养的一级种子液以5%的接种量接入二级种子培养基中进行好氧发酵24～36h培养，发酵温度20℃、30℃或35℃，制成二级种子液；其中二级种子培养基由1～3g/L的NH4NO3，0.5～1.5g/L的KH2PO4，0.3～0.7g/L的K2HPO4.3H2O，0.2～0.5g/L的MgSO4.7H2O，0.1～0.3g/L的MnCl2和5～20g/L的葡萄糖组成，以蒸馏水配制；
第三、将第二步制成的二级种子液以10%的接种量接入发酵培养基中进行静态液体深层发酵生产细菌纤维素，发酵温度20℃、30℃或35℃；
第四、将第三步中获得的发酵产物，依次经过预处理、碱处理、水洗和干燥的后提取处理工艺得到细菌纤维素，所述的后提取处理工艺的具体操作过程是：
预处理：用水洗方法去除细菌纤维素水合物中大部分未与纤维素结合的菌体及其碎片等杂质；
碱处理：用0.1mol/L的NaOH溶液于80℃条件下浸泡2h，除去纤维素水合物中的菌体和残留培养基；
水洗：用蒸馏水多次冲洗，直至纤维素水合物的pH值近7.0；
干燥：最后将纤维素水合物风干或真空干燥，即制得细菌纤维素。
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