CN111321184B

CN111321184B - 一种提高肠杆菌fy-07发酵生产细菌纤维素的产量和/或性能的方法

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Publication number: CN111321184B
Application number: CN202010142463.7A
Authority: CN
Inventors: 马挺; 李国强; 高歌; 曹艺严; 张一博
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Tianjin Selusi Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2020-03-04
Filing date: 2020-03-04
Publication date: 2022-03-08
Anticipated expiration: 2040-03-04
Also published as: CN111321184A

Abstract

本发明提供了一种提高肠杆菌FY‑07发酵生产细菌纤维素的产量和/或性能的方法，属于发酵工程技术领域；所述方法包括以下步骤：将肠杆菌FY‑07的种子液和发酵培养基混合，于28～32℃条件下进行发酵培养，收集上层漂浮物，得到细菌纤维素。本发明的发酵培养基中包括黄原胶，本发明以黄原胶作为改性剂和悬浮剂，利用黄原胶进行原位改性，能够为肠杆菌FY‑07提供高产细菌纤维素环境，并能够与细菌纤维素进行物理或化学作用进而增强细菌纤维性能。

Description

一种提高肠杆菌FY-07发酵生产细菌纤维素的产量和/或性能的方法

技术领域

本发明涉及发酵工程技术领域，尤其涉及一种提高肠杆菌FY-07发酵生产细菌纤维素的产量和/或性能的方法。

背景技术

细菌纤维素是（Bacterial cellulose，简称BC）是一种由细菌产生的胞外多糖聚合物，由葡萄糖分子链接而成。细菌纤维素具有高纯度、高结晶度、纳米级网状结构、高持水力、高弹性模量以及良好的生物相容性和可降解性，因此广泛应用于食品、医药、造纸、石油工程等领域。

目前已发现多个细菌种属能够发酵产生细菌纤维素，其中葡糖醋杆菌（Gluconacetobacter）因其较高的细菌纤维素产量而被认为具有商业化潜力。众多研究表明Gluconacetobacter为严格好氧菌且适宜生长于低pH条件，因此该菌属的发酵生产需要在浅盘静态下培养并需要调节培养基pH，造成生产场地和pH调节成本较高。此外，Gluconacetobacter生长和生长缓慢，每批细菌纤维素的发酵生产需要耗时7~20天，造成产率低下难以满足工业生产需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高肠杆菌FY-07发酵生产细菌纤维素的产量和/或性能的方法，本发明利用黄原胶进行原位改性，能够为肠杆菌FY-07提供高产细菌纤维素环境。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种提高肠杆菌FY-07发酵生产细菌纤维素的产量和/或性能的方法，包括以下步骤：

将肠杆菌FY-07的种子液和发酵培养基混合，于28~32℃条件下进行发酵培养，收集上层漂浮物，得到细菌纤维素；

所述肠杆菌FY-07保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；所述肠杆菌FY-07的保藏号为CGMCC No.6103；

所述发酵培养基包括 HS-XG发酵培养基和无菌葡萄糖水溶液；所述HS-XG发酵培养基和无菌葡萄糖水溶液的体积比为90:8~12；

所述HS-XG发酵培养基以1L计，包括以下原料：黄原胶0.05~0.15g、酵母粉7~8g、蛋白胨8~12g、Na₂HPO₄8~12g和余量的水；

所述无菌葡萄糖水溶液中葡萄糖的质量浓度为20~30 g/L。

优选的，所述肠杆菌FY-07的种子液和发酵培养基的体积比为0.5~1.5：100。

优选的，在将肠杆菌FY-07的种子液和发酵培养基混合后，将混合有肠杆菌FY-07种子液的发酵培养基转入培养皿浅盘，浅盘以堆叠的方式，于28~32℃条件下进行发酵培养。

优选的，所述发酵培养的时间为1~2d。

优选的，所述肠杆菌FY-07的种子液采用以下方法制备得到：

1）将肠杆菌FY-07接种于含有刚果红水溶液的LB固体培养基，于28~32℃培养20~30h，挑取肠杆菌FY-07单菌落；所述LB固体培养基中刚果红水溶液的体积百分含量为0.8%~1.2%；所述刚果红水溶液中刚果红的质量含量为8~12mg/mL；

2）将肠杆菌FY-07单菌落接种于LB斜面培养基，于28~32℃培养20~30h，用灭菌蒸馏水冲洗LB斜面培养基表面，收集冲洗液，得到肠杆菌FY-07的种子液。

优选的，在得到细菌纤维素后，还包括用灭菌蒸馏水对细菌纤维素进行冲洗，将冲洗后的细菌纤维素浸泡于NaOH水溶液中，重复冲洗和浸泡的过程，至细菌纤维素湿膜的pH值为6.8~7.2。

优选的，所述浸泡的温度为90~100℃，每次浸泡的时间为0.5~1h。

优选的，所述NaOH水溶液中NaOH的摩尔浓度为0.1M。

优选的，得到pH值为6.8~7.2的细菌纤维素湿膜后，还包括对细菌纤维素湿膜进行干燥。

优选的，所述干燥的方式包括烘干或真空冷冻干燥。

本发明的有益效果：本发明提供了一种提高肠杆菌FY-07发酵生产细菌纤维素的产量和/或性能的方法，所述方法包括以下步骤：将肠杆菌FY-07的种子液和发酵培养基混合，于28~32℃条件下进行发酵培养，收集上层漂浮物，得到细菌纤维素。本发明的发酵培养基中包括黄原胶，本发明以黄原胶作为改性剂和悬浮剂，利用黄原胶进行原位改性，能够为肠杆菌FY-07提供高产细菌纤维素环境，并能够与细菌纤维素进行物理或化学作用进而增强细菌纤维性能。

生物保藏说明

肠杆菌（Enterobacter sp.）FY-07，于2012年5月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.6103。

附图说明

图1为不同改性剂改性及堆叠发酵方式的细菌纤维素产率；

图2为细菌纤维素(a)、黄原胶(c)和改性后细菌纤维素(b)的FTIR图谱；

图3为细菌纤维素(a)、黄原胶(c)和改性后细菌纤维素(b)的XRD；

图4-a为细菌纤维素的微纤结构图；

图4-b为改性后细菌纤维素的微纤结构图；

图4-c为细菌纤维素的纤维直径；

图4-d为改性后细菌纤维素的纤维直径；

图4-e为细菌纤维素和改性后细菌纤维素的平均直径，***p＜0.001；

图5-（a）为细菌纤维素、黄原胶和改性后细菌纤维素的TGA曲线；

图5-（b）为细菌纤维素、黄原胶和改性后细菌纤维素的DTG曲线；

图6为细菌纤维素和改性后细菌纤维素的TPA结果（回弹性），***p<0.001；ns p>0.05；

图7为细菌纤维素和改性后细菌纤维素的TPA结果（咀嚼度），***p<0.001；ns p>0.05；

图8为细菌纤维素和改性后细菌纤维素的TPA结果（硬度），***p<0.001；ns p>0.05；

图9为细菌纤维素和改性后细菌纤维素的TPA结果（弹性），***p<0.001；ns p>0.05；

图10为细菌纤维素和改性后细菌纤维素的TPA结果（内聚力），***p<0.001；ns p>0.05；

图11为细菌纤维素和改性后细菌纤维素的拉伸强度，*p<0.05；ns p>0.05；

图12为细菌纤维素和改性后细菌纤维素的断裂伸长率，*p<0.05；ns p>0.05。

具体实施方式

本发明提供了一种提高肠杆菌FY-07发酵生产细菌纤维素的产量和/或性能的方法，所述方法包括以下步骤：

将肠杆菌FY-07的种子液和发酵培养基混合，于28~32℃条件下进行发酵培养，收集上层漂浮物，得到细菌纤维素；所述发酵的温度优选为30℃；所述肠杆菌FY-07的种子液包括肠杆菌FY-07和细菌纤维素膜。

本发明中，所述肠杆菌FY-07的种子液中包含包含大量肠杆菌FY-07细菌的细菌纤维素膜状物和无菌水。本发明具体实施过程中，所述肠杆菌FY-07的种子液为从斜面培养基上冲洗下的包含大量肠杆菌FY-07细菌的细菌纤维素膜状物和无菌水的混合物。

本发明中，所述肠杆菌FY-07保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；所述肠杆菌FY-07的保藏号为CGMCC No.6103；所述肠杆菌FY-07分离自油田采出液，为革兰氏阴性的兼性厌氧细菌，具有在厌氧、好氧、兼性厌氧条件下以廉价碳源如糖蜜均可产生大量细菌纤维素的特点；肠杆菌FY-07生长和生产迅速，每批细菌纤维素的发酵生产仅需1~3天，且不需调节培养基pH。

本发明中，所述发酵培养基包括 HS-XG发酵培养基和无菌葡萄糖水溶液；所述HS-XG发酵培养基和无菌葡萄糖水溶液的体积比为90:8~12，优选为9:1。

本发明中，所述HS-XG发酵培养基以1L计，包括以下原料：黄原胶0.05~0.15g、酵母粉7~8g、蛋白胨8~12g、Na₂HPO₄8~12g和余量的水；优选的，所述HS-XG发酵培养基以1L计，包括以下原料：黄原胶1g、酵母粉7.5g、蛋白胨10g、Na₂HPO₄10g和余量的水；所述酵母粉、蛋白胨和Na₂HPO₄来源于常规市售；所述黄原胶（Xanthan gum，XG）来源于常规市售。

本发明以黄原胶作为改性剂和悬浮剂，利用黄原胶进行原位改性，能够为肠杆菌FY-07提供高产细菌纤维素环境，并能够与细菌纤维素进行物理或化学作用进而提高细菌纤维性能；所述提高细菌纤维性能包括增加细菌纤维素的纤维直径、提高细菌纤维素的硬度、提高细菌纤维素的弹性和提高细菌纤维素的拉伸强度。

本发明中，所述HS-XG发酵培养基优选的采用以下制备方法制得：将酵母粉、蛋白胨、Na₂HPO₄和水混合后，得到混合液，向混合液中缓慢并伴随搅拌添加黄原胶（黄原胶粘度极大且溶解缓慢，先添加黄原胶影响培养基其他成分的溶解；添加时如过快会导致结块而难以溶解充分），于30℃条件下震荡处理，得到HS-XG发酵培养基；本发明对上述过程中的时间没有特殊限制，以混合均匀为准。

本发明中，所述无菌葡萄糖水溶液中葡萄糖的质量浓度为20~30 g/L，优选为25g/L；所述无菌葡萄糖水溶液作为碳源。

本发明中，所述肠杆菌FY-07的种子液和发酵培养基的体积比优选为0.5~1.5：100，更优选为1:100。

本发明在将肠杆菌FY-07的种子液和发酵培养基混合后，优选的还包括将混合有肠杆菌FY-07种子液的发酵培养基转入培养皿浅盘，浅盘以堆叠的方式，于28~32℃条件下进行发酵培养。

本发明中，利用浅盘发酵可增加菌体与容器接触面积从而刺激细菌转向细菌纤维素高产状态。因肠杆菌FY-07发酵产细菌纤维素不需要氧气的存在，使用堆叠发酵可以节省生产占地面积；细菌纤维素性能通常与发酵容器关系不大，本发明中影响细菌纤维素性质的主要因素为黄原胶的存在。

本发明中，所述肠杆菌FY-07的种子液优选的采用以下方法制备得到：

本发明首先将肠杆菌FY-07接种于含有刚果红水溶液的LB固体培养基，于28~32℃培养20~30h，挑取肠杆菌FY-07单菌落；所述培养的温度优选为30℃，时间优选为24h；所述LB固体培养基中刚果红水溶液的体积百分含量优选为0.8%~1.2%，更优选为1%；所述刚果红水溶液中刚果红的质量含量优选为8~12mg/mL，更优选为10mg/mL；所述接种的方式优选为划线接种；通过划线方式分离得到纯净的单菌落，因刚果红会与细菌纤维素结合，因此红而大的菌落被认为是活力强的菌种；所述刚果红水溶液能够用于筛选高产细菌纤维素菌落。

挑取肠杆菌FY-07单菌落后，本发明将肠杆菌FY-07单菌落接种于LB斜面培养基，于28~32℃培养20~30h，用灭菌蒸馏水冲洗LB斜面培养基表面（试管中的斜面培养基上的细菌纤维素膜不易进行剥离操作，灭菌蒸馏水冲洗可防止染菌），收集冲洗液，得到肠杆菌FY-07的种子液；本发明具体实施过程中，每个LB斜面培养基冲洗到100mL无菌水中。

本发明中，所述LB固体培养基和LB斜面培养基以1L计，包括以下组分：酵母粉5g、蛋白胨10g、NaCl 5g，琼脂15g，pH值为7.4~7.6。

本发明在得到细菌纤维素后，优选的还包括用灭菌蒸馏水对细菌纤维素进行冲洗，将冲洗后的细菌纤维素浸泡于NaOH水溶液中，重复冲洗和浸泡的过程，至细菌纤维素湿膜的pH值为6.8~7.2，优选为7.0；所述浸泡的温度优选为90~100℃，每次浸泡的时间优选为0.5~1h；所述NaOH水溶液中NaOH的摩尔浓度优选为0.1M。

本发明在得到pH值为6.8~7.2的细菌纤维素湿膜后，优选的还包括对细菌纤维素湿膜进行干燥；所述干燥的方式优选的包括烘干或真空冷冻干燥；本发明对所述干燥的温度和时间没有特殊限制，以本领域常规设置为准。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 以韦兰胶（welan gum）、三赞胶（Ss gum）和黄原胶（XG）分别作为改性剂进行原位改性以提高肠杆菌FY-07细菌纤维素产率和性质

1、将肠杆菌FY-07菌液划线于含有0.1% (v/v) 10mg/mL刚果红水溶液的LB固体培养基平板，30℃培养24h；

2、挑取红色且较大的单菌落密集划线于LB斜面培养基，30℃培养24h；

3、用提前灭菌好的100mL蒸馏水冲洗步骤2得到的斜面培养基，反复冲洗直至斜面培养基上的包含大量细菌的细菌纤维素膜脱离，置于该蒸馏水中混匀作为种子液；

4、将步骤3得到的种子液以1%的接种量接种于装有90mL HS-WG或HS-SS或HS-XG发酵培养基的锥形瓶中，同时向发酵培养基中加入10mL灭菌的25 g/L葡萄糖水溶液碳源；

5、将步骤4得到的培养基放置于培养箱中，30℃培养发酵；

6、将步骤5发酵产生的细菌纤维素膜捞出，用水冲洗以去除大部分菌体及杂质；

7、再用的0.1M NaOH 溶液于100℃条件下处理0.5h，除去纤维素水合物中的菌体和残留培养基；

8、之后多次水洗和浸泡直至pH为中性从而得到细菌纤维素湿膜；

9、如有必要，可对细菌纤维素湿膜进行烘干或真空冷冻干燥处理。

其中：

LB培养基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂15 g/L，pH 7.4~7.6；

HS-WG发酵培养基：韦兰胶0.1 g/L，酵母粉7.5 g/L，蛋白胨10 g/L，Na₂HPO₄10 g/L，pH无需调节。

HS-XG发酵培养基：黄原胶0.1 g/L，酵母粉7.5 g/L，蛋白胨10 g/L，Na₂HPO₄10 g/L，pH无需调节。

韦兰胶/黄原胶需最后添加，添加时应缓慢并伴随搅拌，添加完成后置于30℃振荡混匀直至完全溶解。韦兰胶来源于鞘氨醇单胞菌ATCC3155（Sphingomonas sp. ATCC3155）发酵生产纯化；黄原胶来源于野油菜黄单胞菌CGMCC15155（Xanthomonas campestris CGMCC15155）发酵生产提纯产物。

以此方法进行发酵，添加韦兰胶和黄原胶得到的细菌纤维素产率分别为2.16 g/L/d和2.5 g/L/d。参见图1。

对比例1 塑料培养皿浅盘堆叠发酵提高肠杆菌FY-07细菌纤维素产率

4、将步骤3得到的种子液以1%的接种量接种于装有90mL HS发酵培养基的锥形瓶中，同时向发酵培养基中加入10mL灭菌的25 g/L葡萄糖水溶液碳源；

5、将步骤4得到的接种后的培养基混匀后转入25×25cm方形无菌塑料培养皿浅盘中；

6、将步骤5得到的浅盘以堆叠的方式放置于培养箱中，30℃培养发酵；

7、将步骤6发酵产生的细菌纤维素膜捞出，用水冲洗以去除大部分菌体及杂质；

8、再用的0.1M NaOH水溶液于100℃条件下处理0.5h，除去纤维素水合物中的菌体和残留培养基；

9、之后多次水洗和浸泡直至pH为中性从而得到细菌纤维素湿膜；

10、如有必要，可对细菌纤维素湿膜进行烘干或真空冷冻干燥处理。

其中：

HS发酵培养基：酵母粉7.5 g/L，蛋白胨10 g/L，Na₂HPO₄10 g/L，pH无需调节。

以此方法得到细菌纤维素产率为2.2 g/L/d。参见图1。

实施例2 以黄原胶（XG）作为改性剂进行原位改性并进行塑料培养皿浅盘堆叠发酵以提高肠杆菌FY-07细菌纤维素产率和性质

4、将步骤3得到的种子液以1%的接种量接种于装有90mL HS-XG发酵培养基的锥形瓶中，同时向发酵培养基中加入10mL灭菌的25 g/L葡萄糖水溶液碳源；

8、再用的0.1M NaOH 溶液于100℃条件下处理0.5h，除去纤维素水合物中的菌体和残留培养基；

其中：

HS-XG发酵培养基：黄原胶 0.1 g/L，酵母粉7.5 g/L，蛋白胨10 g/L，Na₂HPO₄10g/L，pH无需调节。黄原胶需最后添加，添加时应缓慢并伴随搅拌，添加完成后置于30℃振荡混匀直至完全溶解。

以此方法得到细菌纤维素产率为3.2 g/L/d。参见图1。

实施例3 以黄原胶（XG）作为改性剂进行原位改性并进行塑料培养皿堆叠发酵得到的细菌纤维素的 Fourier-transform infrared (FTIR) spectroscopy（傅里叶红外光谱）分析

采用衰减全反射-FTIR光谱法鉴定冻干黄原胶、细菌纤维素和改性后细菌纤维素样品的主要化学特征。FTIR光谱记录在FTIR/4200光谱仪上，每个光谱分辨率为4cm-1和64次扫描。检测结果如图2所示。结果表明改性后细菌纤维素兼具细菌纤维素和黄原胶的特征。

实施例4 以黄原胶（XG）作为改性剂进行原位改性并进行塑料培养皿堆叠发酵得到的细菌纤维素的X-ray diffraction (XRD)（X射线衍射）分析

用D/max-2500 X射线衍射仪（日本东京秋岛日谷公司）测定了冻干细菌纤维素和改性后细菌纤维素复合薄膜的微晶指数（CrI）。工作电压和电流分别为40kv和30ma。从5°–60°2θ以每分钟2°的速度扫描样品。根据衍射数据计算CrI如下：

CrI（%）=[1-（IAM/I200）]×100%，

其中I200是2θ（约22.8°）峰值的整体强度，IAM是基线在2θ（18°）时的强度。检测结果如图3所示。结果表明改性后细菌纤维素的结晶度略有降低。

实施例5 以黄原胶（XG）作为改性剂进行原位改性并进行塑料培养皿堆叠发酵得到的细菌纤维素的scanning electron microscopy (SEM)（扫描电子显微镜）分析

将冻干细菌纤维素和改性后细菌纤维素复合材料切成小块，安装在铝钉上，在高真空条件下涂以金/钯合金。为了观察破裂表面的微观结构，使用QUANTA200扫描电子显微镜（FEI，俄勒冈州，美国）对试样进行了检查。为了测定BC和BC/XG复合膜中纤维的平均直径，从SEM图像中随机选择200多条纤维，并使用图像分析软件image-J（美国NIH）测量直径。检测结果如图4-a~图4-e所示。结果表明改性后细菌纤维素具有更粗的纤维直径。

实施例6 以黄原胶（XG）作为改性剂进行原位改性并进行塑料培养皿堆叠发酵得到的细菌纤维素的thermogravimetric analysis (TGA)（热重分析）分析

用Q500型热重分析仪（TA仪器，Water LLC，New Castle，DE）对样品的热降解行为进行了评价。分析前，在流动氮气（20毫升/分钟）下冲洗TGA装置。以10°C/min的速率将每个样品（10 mg冻干样品）从室温加热至800°C。检测结果如图5-（a）~图5-（b）所示。结果表明改性后细菌纤维素的热性能没有显著变化。

实施例7 以黄原胶（XG）作为改性剂进行原位改性并进行塑料培养皿堆叠发酵得到的细菌纤维素的texture profile analysis (TPA)（质构分析）

使用质构分析仪（TA XTplus，稳定微系统，英国）记录力与时间的数据。利用质构分析仪和计算机软件（s a s）对湿细菌纤维素和改性后细菌纤维素纳米复合薄膜在圆柱形探针（P/0.5）下以1mm/s的测试速度和5g的控制力进行压缩。变形水平为原始样品高度的25%，每个样品压缩两次。每个样本至少分析10个重复。检测结果如图6~图10所示。结果表明改性后的细菌纤维素的硬度、弹性均有显著性提高。

实施例8 以黄原胶（XG）作为改性剂进行原位改性并进行塑料培养皿堆叠发酵得到的细菌纤维素的机械性能测试

采用标准试验方法（ASTM-D-882；http://www.ASTM.org/Standards/D882.htm），使用质构分析仪（TA-XT plus，Stable Micro System，UK）评估拉伸强度和断裂伸长率。夹具间距初始设定为40mm，十字探头移动速度为50mm/min，将湿细菌纤维素和改性后细菌纤维素纳米复合薄膜切割成15mm×200mm的试样。实验前，样品在51%的相对湿度下保存5d，以防止不同的样品湿度影响结果。检测结果如图11~图12所示。结果表明改性后细菌纤维素的拉伸强度显著提高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种提高肠杆菌FY-07发酵生产细菌纤维素的产量和/或提高细菌纤维性能的方法，所述方法由以下步骤组成：将肠杆菌FY-07的种子液和发酵培养基混合，将混合有肠杆菌FY-07种子液的发酵培养基转入培养皿浅盘，浅盘以堆叠的方式，于28~32℃条件下进行发酵培养，收集上层漂浮物，得到细菌纤维素；

所述提高细菌纤维性能包括增加细菌纤维素的纤维直径、提高细菌纤维素的硬度、提高细菌纤维素的弹性和提高细菌纤维素的拉伸强度；

所述无菌葡萄糖水溶液中葡萄糖的质量浓度为20~30 g/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肠杆菌FY-07的种子液和发酵培养基的体积比为0.5~1.5：100。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的时间为1~2d。

4.根据权利要求1~3任意一项所述的方法，其特征在于，所述肠杆菌FY-07的种子液采用以下方法制备得到：

将肠杆菌FY-07接种于含有刚果红水溶液的LB固体培养基，于28~32℃培养20~30h，挑取肠杆菌FY-07单菌落；所述LB固体培养基中刚果红水溶液的体积百分含量为0.8%~1.2%；所述刚果红水溶液中刚果红的质量含量为8~12mg/mL；

将肠杆菌FY-07单菌落接种于LB斜面培养基，于28~32℃培养20~30h，用灭菌蒸馏水冲洗LB斜面培养基表面，收集冲洗液，得到肠杆菌FY-07的种子液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在得到细菌纤维素后，还包括用灭菌蒸馏水对细菌纤维素进行冲洗，将冲洗后的细菌纤维素浸泡于NaOH水溶液中，重复冲洗和浸泡的过程，至细菌纤维素湿膜的pH值为6.8~7.2。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述浸泡的温度为90~100℃，每次浸泡的时间为0.5~1h。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述NaOH水溶液中NaOH的摩尔浓度为0.1M。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，得到pH值为6.8~7.2的细菌纤维素湿膜后，还包括对细菌纤维素湿膜进行干燥。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述干燥的方式包括烘干或真空冷冻干燥。