CN107488607B

CN107488607B - 一株产细菌纤维素菌株的分离鉴定及应用

Info

Publication number: CN107488607B
Application number: CN201710413705.XA
Authority: CN
Inventors: 谢文平; 张鸿; 鲍素敏; 吴冬青; 毛兴艳; 姚红涛; 李利佳
Original assignee: Yichang Shancheng Shuidu Biological Mask Fermentation Co ltd; Sunshine Lake Pharma Co Ltd
Current assignee: Dongguan Hec Pharm R&d Co ltd
Priority date: 2016-06-13
Filing date: 2017-06-05
Publication date: 2020-07-10
Anticipated expiration: 2037-06-05
Also published as: CN107488607A

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株产细菌纤维素菌株的分离鉴定及应用。该菌株从腐败水果中分离得到，具有快速产膜且产膜量高的特性，本发明综合采用了16S rDNA，和dnaK、groEL、rpoB 3个管家基因对所分离得到的HEC‑004菌株进行分子水平鉴定，确定所分离菌株为纳塔葡糖酸醋杆菌Gluconacetobacter nataicola，现已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为：CGMCC No.11588。

Description

一株产细菌纤维素菌株的分离鉴定及应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及到一株产细菌纤维素菌株的分离、鉴定，以及细菌纤维素膜的静态发酵培养。

背景技术

细菌纤维素(Bacterial cellulose，BC)是指由细菌合成的纤维素，是由葡萄糖通过β-1，4-糖苷键聚合而成的高分子化合物，其结构与天然纤维素的结构非常接近。与植物所产生的纤维素相比较，BC具有高纯度、高结晶性、高杨氏模量、高持水量、优良的生物可降解性和良好的生物相容性等特性，因而有望作为新型生物可降解材料用于食品、化学工业和医学等领域。

根据已有的报道，具有BC合成功能的微生物包括葡糖醋酸菌属(Gluconacetobacter)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、无色杆菌属(Achromobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、固氮菌属(Azotobacter)、根瘤菌属(Rhizobium)、八叠球菌属(Sarcina)等属的微生物。但是目前有关BC产生的研究主要集中在葡糖酸醋菌属的木醋杆菌(G.xylinum)、巴氏醋杆菌(G.pasteurianus)和汉式醋杆菌(G.hansenis)，而生产所用的菌株主要为木醋杆菌，如中国发明专利CN200910003956.6，木葡糖酸醋杆菌属菌株及其选育和生产细菌纤维素的方法；杜晶晶等，木醋杆菌的培养基优化研究，纤维素科学与技术，19(2011)，35-40。

然而，上述菌株在实际生产应用过程中都存在生长和产膜速度慢等问题。例如在静态发酵培养产膜过程中，产膜时间都在一周至半个月左右。近年来关于优良新菌种筛选的报道也较少，大多数多研究都集中在产BC菌种的发酵条件优化和纤维素合成分子机理的研究等方面。大自然中具有多样性的微生物，从中筛选出可以快速产优良纤维素膜的菌株对于扩大BC产能具有重要意义。此外，目前对产BC膜菌株的鉴定主要是通过结合16S rDNA和生理生化的方法进行鉴定，该方法鉴定菌种可能存在难于区分相邻种属菌种的局限性，因此在一些关于产BC菌种的专利中，都只是将菌种鉴定到属，如中国发明专利CN200810218500.7，细菌纤维素产生菌及利用该菌株制备细菌纤维素的方法；中国发明专利CN201010515946.3，一种细菌纤维素菌株。确定菌株的确切种属，对于菌株的后续的改造或者研究具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是为了提供一株产纤维素膜速度快、产量高的菌株。

其次本发明还提供一种产纤维素膜速度快、产量高的菌株的筛选方法。

再者，本发明提供一种通过分子生物学鉴定技术，将分离得到的菌株鉴定到种的方法。

同时，本发明提供一种利用分离菌株生产纤维素膜的方法。

最后，本发明提供一种纤维素膜在化妆品及医疗领域的应用。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一株产细菌纤维素菌株，为纳塔葡糖酸醋杆菌Gluconacetobacter nataicolaHEC-004，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.11588，保藏日期：2015年11月05日。

一种产纤维素膜菌株的筛选方法，包括以下步骤：

(1)富集产膜菌种：采集不同来源的腐败水果样品，分别用无菌水进行漂洗，吸取漂洗液100～200μL接种到5～10ml初筛液体培养基中；

(2)产膜菌种分离：25～30℃静止培养3～6天，选取表面长出乳白色薄膜的样品，将膜取出捣碎，加入2～4ml无菌水混匀，吸取混匀后的液体，进行梯度稀释，每个梯度稀释液取50～100μL，分别涂布在初筛固体培养基平板上。

(3)产膜菌种筛选：将平板至于25～30℃培养箱培养4～7天，挑选出优势菌落，接种到5～10ml初筛液体培养基中，于25～30℃进行静止培养，选出1～2天即能产膜，且产膜厚度在0.3cm以上的菌株。

一些实施例中，步骤(1)所述的腐败水果选自苹果、梨、柑橘、香瓜、芒果、葡萄、荔枝中的至少一种。

一些实施例中，步骤(1)和/或步骤(3)所述的初筛液体培养基成分为(质量百分比)：蔗糖2％～4％，(NH₄)₂SO₄ 0.4％～0.8％，MgSO₄·7H₂O 0.03％～0.05％，CaCl₂ 0.02％～0.04％，七水硫酸亚铁0.00002％～0.0005％，NaAC 0.06％～0.10％，酵母膏0.05％～0.2％。

一些实施例中，步骤(2)所述的初筛固体培养基成分为在初筛液体培养基中加入1.5％-2.0％的琼脂。

一些实施例中，步骤(3)所述的优势菌株，菌落较小，表面包裹一层乳白色膜的菌落。

一种通过分子生物学方法鉴定菌种的方法，包括以下步骤：

(a)利用细菌16S rDNA扩增用的通用引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:1扩增16SrDNA序列，将HEC-004鉴定到属，得到如SEQ ID NO:9所述序列，通过比对，该菌株属于葡糖醋杆菌属。

(b)设计dnaK，groEL和rpoB序列引物，其中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4用于扩增dnaK；SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6用于扩增groEL；SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8用于扩增rpoB。

(c)利用上述引物对菌株dnaK、groEL和rpoB基因进行PCR扩增和测序，得到的DNA序列为SEQ ID NO:10(dnaK)，SEQ ID NO:11(groEL)和SEQ ID NO:12(rpoB)。经过序列比对和进化树的构建，HEC-004菌株的dnaK序列、groEL序列、rpoB序列与Gluconacetobacternataicola LMG 1536T的dnaK、groEL、rpoB序列相似度为100％。综合分析，本发明中所分离出的菌株为一株纳塔葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter nataicola)。

发酵用菌种的保存：将纳塔葡糖酸醋杆菌HEC-004菌种接种到5～10mL液体种子培养基中，25～30℃160～200rpm培养2天；取上清，用接种环蘸取上清液，在固体种子培养基斜面上连续划线。放置于25～30℃培养箱中培养3～5天，将菌种转移到4℃冰箱冷藏保存。该菌种在两个月内有效。所述的液体种子培养基成分为(质量百分比)：蔗糖2％～4％，(NH₄)₂SO₄ 0.4％～0.8％，MgSO₄·7H₂O 0.03％～0.05％，CaCl₂ 0.02％～0.04％，七水硫酸亚铁0.00002％～0.0005％，NaAC 0.06％～0.10％，酵母膏0.05％～0.2％。所述的固体种子培养基斜面是在液体种子培养基的基础上加入1.5％～2.0％的琼脂。

一种利用分离菌株生产纤维素膜的方法，为了实现利用本发明中的纳塔葡糖酸醋杆菌HEC-004菌株进行细菌纤维素膜的快速生产，本申请采取如下步骤：

(Ⅰ)发酵种子液的培养：取出保藏于4℃的纳塔葡糖酸醋杆菌HEC-004，用接种环于固体种子培养基斜面上刮取1～3环膜与菌体的混合物，接种于装有50～100mL液体种子培养基的三角瓶中，25～30℃160～200rpm振荡培养24～48h。

(Ⅱ)细菌纤维膜的培养：在圆柱形或者方形发酵容器中加入发酵培养基，使液面高度为0.4～6cm，将步骤(Ⅰ)发酵种子液按4～6％接种量进行接种，容器敞口面用6～8层灭菌纱布覆盖，防止外界微生物的进入。将发酵容器放置于25～30℃培养箱或者恒温房，培养2～7天可以形成0.4～5cm厚的细菌纤维素膜，所产膜柔软，韧性强。

一些实施例中，步骤(Ⅱ)所述的发酵培养基成分为(质量百分比)：KH₂PO₄ 0.2％～0.4％，Na₂HPO₄·12H₂O 0.2％～0.4％，MgSO₄ 0.02％～0.05％，柠檬酸0.2％～0.4％，蔗糖2％～5％，大豆蛋白胨1％～3％。

用本发明所述方法生产的细菌纤维素膜具有优良的生物亲和性、生物相容性，可用于医疗及化妆品领域，优选地，切片后可用作伤口敷料或生物面膜的基材。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

本发明筛选菌株的过程取材方便、操作简单，筛选出的菌株不需要进行诱导即可投入生产，本发明通过分子生物学方法，鉴定出菌株的确切种属，对于菌株的后续的改造或者研究具有重要意义。之前人们认为，生产细菌纤维素的菌种主要集中在葡糖酸醋菌属的木醋杆菌(G.xylinum)、巴氏醋杆菌(G.pasteurianus)和汉式醋杆菌(G.hansenis)，但是存在发酵周期长等问题。人们为了加速产膜速率，通常会采用多种方式的诱导，筛选出快速产膜的突变菌株，通过本发明技术方案可以看出，纳塔葡糖酸醋杆菌HEC-004具有快速产膜且产膜量高等多种优良特性，可以满足工业化生产细菌纤维素的需求。

附图说明

图1为纳塔葡糖酸醋杆菌HEC-004菌体及其所产纤维素膜的扫描电镜图。

图2为纳塔葡糖酸醋杆菌HEC-004菌株与相近菌株16S rDNA比对N-J法制作的进化树

图3为纳塔葡糖酸醋杆菌HEC-004菌株与相近菌株dnak基因序列比对N-J法制作的进化树

图4为纳塔葡糖酸醋杆菌HEC-004菌株与相近菌株groEL基因序列比对N-J法制作的进化树

图5为纳塔葡糖酸醋杆菌HEC-004菌株与相近菌株ropB基因序列比对N-J法制作的进化树

图6为对比例1不同菌株产细菌纤维素膜对比试验结果

具体实施方式

下面的实施例对本发明作详细说明，应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明要求保护的范围。

实施例1：产膜菌株的筛选

(1)从腐烂苹果、梨、柑橘、香瓜、芒果上挑取带腐败组织的果肉各约1cm³小块，在10mL无菌水中漂洗。

(2)吸取100μL漂洗液接种到含有10mL初筛液体培养基的PA瓶中。30℃静止培养4天，出现一层薄薄的膜；将该膜用灭菌的镊子转移到无菌水中漂洗一次，洗去表面的杂菌，然后将膜转到一个5mL离心管，用灭菌枪头尽量捣碎；加入4mL灭菌水，混匀；吸取100μL液体，进行5倍梯度稀释，最终得到1倍，5倍，25倍，125倍，625倍稀释的菌悬液液。每个梯度稀释液取100μL，涂布在初筛固体培养基上。其中，初筛液体培养基成分为(质量百分比)：蔗糖2％～4％，(NH₄)₂SO₄ 0.4％～0.8％，MgSO₄·7H₂O 0.03％～0.05％，CaCl₂ 0.02％～0.04％，七水硫酸亚铁0.00002％～0.0005％，NaAC 0.06％～0.10％，酵母膏0.05％～0.2％。初筛固体平板培养基成分为(质量百分比)：蔗糖2％～4％，(NH₄)₂SO₄ 0.4％～0.8％，MgSO₄·7H₂O 0.03％～0.05％，CaCl₂ 0.02％～0.04％，七水硫酸亚铁0.00002％～0.0005％，NaAC 0.06％～0.10％，酵母膏0.05％～0.2％，琼脂1.5～2％，调节pH为5～6。

(3)将固体培养平板转移到30℃培养箱进行4天培养，观察所长单菌落的形态。从其中挑选出5个菌落较小，表面包裹有一层膜的菌落。将该5个菌落重新接种到带有5mL初筛液体培养基的PA瓶中，于30摄氏度进行静止培养，考察成膜情况。

(4)按照上述所筛选方法获得的5个菌落其中有一个菌落可以在接种2天后形约0.5cm厚的细菌纤维素膜，表现出最佳成膜能力。我们将该菌株命名为HEC-004。

实施例2：菌株的形态学观察

菌落形态：30℃培养条件，初筛固体平板培养基上培养72h，菌落呈圆形，灰白色，直径2～3mm，隆起，表面干燥，不平整，边缘无规则，易挑取。菌落随时间的延长而增大，10天后直径可达8mm以上，在培养基表面形成纤维素膜块。

细胞形态：扫描电镜观察菌体，HEC-004菌株为杆状，宽约0.4～0.8μm，长约4μm(见图1)；该菌株的革兰氏反应为阴性。

实施例3：菌种的鉴定

扩增所HEC-004菌株的16S rDNA、dnaK、groEL和rpoB基因，其主要步骤有：

从HS固体平板上挑取单个菌落接种到含有1％纤维素酶的初筛液体培养基中，30℃，150rpm培养48h。

用1.5mL离心管收集1mL培养液，12000rpm离心收集菌体去上清。用灭菌水将细胞沉淀重悬洗涤，离心后去上清。重复一次细胞水洗，最后将细胞悬浮到100μL水中。

采用PCR的方法分别扩增16S rDNA，dnaK，groEL，rpoB。PCR体系为：菌液1μL，

PCR Master Mix(Takara，Japan)25μL，正向引物2μL，反向引物2μL，加去离子水至50μL。PCR程序：为95℃10min；95℃30s，56℃30s，72℃90s，30个循环；72℃10min。

(1)利用细菌16S rDNA通用引物16S 27F(SEQ ID NO:1)和16S 1492R(SEQ ID NO:2)序列，将HEC-004鉴定到属，得到如SEQ ID NO:9(HEC-004 16S)所述序列，通过在NCBI中进行序列比对，该菌株属于葡糖醋杆菌属(见图3)。

(2)查找葡糖醋杆菌属的保守基因dnaK，groEL和rpoB序列。我们从NCBI中选取了不同的dnaK序列(gi|269913036|；gi|269913030|；gi|269913020|；gi|269913002|；gi|269913010|)，groEL序列(gi|396586160|；gi|313760291|；gi|269913180|；gi|269913164|；gi|269913154|)，以及rpoB序列(gi|269912619|；gi|269912613|；gi|269912603|；gi|269912593|；gi|269912575|)，通过序列比对，设计了SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:8所述引物，其中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4用于扩增dnaK；SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6用于扩增groEL；SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8用于扩增rpoB。

(3)采用利用上述引物对菌株的基因组DNA进行PCR扩增和测序，得到的DNA序列为：SEQ ID NO:10(HEC-004dnaK)、SEQ ID NO:11(HEC-004groEL)和SEQ ID NO:12(HEC-004rpoB)。经过序列比对，利用MEGA软件制作N-J进化树，结果表明HEC-004菌株的dnaK序列、groEL序列、rpoB序列与Gluconacetobacter nataicola LMG 1536的dnaK、groEL、rpoB序列相似度为100％(见图3～图5)。综合分析，本发明中所分离出的菌株为一株纳塔葡糖酸醋杆菌Gluconacetobacter nataicola。

实施例4：菌种的保存

将纳塔葡糖酸醋杆菌HEC-004菌种接种到5mL液体种子培养基中，30℃160rpm培养2天；取上清，用接种环蘸取上清液在固体种子培养基斜面上连续划线。放置于30℃培养箱中培养3天，将菌种转移到4℃冰箱冷藏保存。该菌种在两个月内有效。其中，液体培养基成分为(质量百分比)：蔗糖2％～4％，(NH₄)₂SO₄ 0.4％～0.8％，MgSO₄·7H₂O 0.03％～0.05％，CaCl₂ 0.02％～0.04％，七水硫酸亚铁0.00002％～0.0005％，NaAC 0.06％～0.10％，酵母膏0.05％～0.2％。固体斜面培养基成分为(质量百分比)：蔗糖2％～4％，(NH₄)₂SO₄ 0.4％～0.8％，MgSO₄·7H₂O 0.03％～0.05％，CaCl₂ 0.02％～0.04％，七水硫酸亚铁0.00002％～0.0005％，NaAC 0.06％～0.10％，酵母膏0.05％～0.2％，琼脂1.5～2％，调节pH为5～6。

实施例5：细菌纤维素膜厚膜培养

(1)发酵种子液的培养：取出保藏于4℃的HEC-004菌，用接种环于固体种子培养基斜面上刮取1环膜与菌体的混合物，接种于装有100mL液体种子培养基的三角瓶中，30℃160rpm振荡培养24h。

(2)细菌纤维膜的培养：将发酵种子液按5％接种量接种500mL容量的烧杯中，其中所含有的发酵培养基液面高度为6cm，烧杯敞口面用六层灭菌纱布覆盖，防止外界微生物的进入。将接种后的烧杯放至于30℃培养箱培养3-7天。取3天培养的膜和7天培养的膜进行厚度测定，培养3天所产生的细菌纤维素膜厚度约为3cm，培养7天所产生的细菌纤维素膜厚度约为5cm。

对比例1：快速产细菌纤维素膜对比试验

将保藏于4℃的纳塔葡糖酸醋杆菌HEC-004菌株和产细菌纤维素的模式菌株木糖葡糖酸醋杆菌CGMCC 1.1812(即：ATCC 23767)，分别用接种环于固体种子培养基斜面上刮取1环膜与菌体的混合物，并分别接种于装有100mL液体种子培养基的三角瓶中，30℃160rpm振荡培养24h。

将活化后的HEC-004和CGMCC 1.1812两个菌株按照5％接种量分别接种于含有25～30ml液体发酵培养基的9cm培养皿中；同时，对照培养皿中加入5％的灭菌水。将三种不同处理的培养皿置于30℃培养箱中培养40h。结果HEC-004菌株所产的膜接触到培养皿底部，基本无液体培养基残留，膜厚度约为5mm；CGMCC 1.1812产较薄，膜浮于培养基表面，残液多，所产膜厚度约为1mm；对照没有接种菌的培养基没有膜的形成(见图6)。该结果说明本发明中所分离得到的HEC-004细菌纤维素合成菌株比传统的木醋杆菌具有更优良的产膜能力。其中纳塔葡糖酸醋杆菌HEC-004所产膜表面光滑，柔软，韧性强，其形成细菌纤维为纳米级，适合用作伤口敷料或者生物面膜的基材。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东东阳光药业有限公司宜昌山城水都生物面膜发酵有限公司

<120> 一株产细菌纤维素菌株的分离鉴定及应用

<130> 2016

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tacggctacc ttgttacgac tt 22

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agaagraygg cggcacsat 19

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttggtcggga tggtcgtrtt g 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcgcagatgg tccgtgaggt 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcccagcatg tccagcgtca c 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gggcaagttc ctgttygctg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttcatcttca crcgrccmac 20

<210> 9

<211> 1337

<212> DNA

<213> Gluconacetobacter nataicola

<400> 9

agtcgcacga acctttcggg gttagtggcg gacgggtgag taacgcgtag ggatctgtcc 60

atgggtgggg gataactttg ggaaactgaa gctaataccg catgacacct gagggtcaaa 120

ggcgcaagtc gcctgtggag gaacctgcgt tcgattagct agttggtggg gtaaaggcct 180

accaaggcga tgatcgatag ctggtctgag aggatgatca gccacactgg gactgagaca 240

cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg gacaatgggc gcaagcctga 300

tccagcaatg ccgcgtgtgt gaagaaggtt ttcggattgt aaagcacttt cagcggggac 360

gatgatgacg gtacccgcag aagaagcccc ggctaacttc gtgccagcag ccgcggtaat 420

acgaaggggg caagcgttgc tcggaatgac tgggcgtaaa gggcgcgtag gcggttgaca 480

cagtcagatg tgaaattcct gggcttaacc tgggggctgc atttgatacg tggcgactag 540

agtgtgagag agggttgtgg aattcccagt gtagaggtga aattcgtaga tattgggaag 600

aacaccggtg gcgaaggcgg caacctggct catgactgac gctgaggcgc gaaagcgtgg 660

ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgctgta aacgatgtgt gctggatgtt 720

gggtgacttt gtcattcagt gtcgtagtta acgcgataag cacaccgcct ggggagtacg 780

gccgcaaggt tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg 840

tttaattcga agcaacgcgc agaaccttac cagggcttga catgcggagg ccgtgtccag 900

agatgggcat ttctcgcaag agacctccag cacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg 960

tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac cctcgccttt agttgccatc 1020

acgtctgggt gggcactcta aaggaactgc cggtgacaag ccggaggaag gtggggatga 1080

cgtcaagtcc tcatggccct tatgtcctgg gctacacacg tgctacaatg gcggtgacag 1140

tgggaagcca ggtagcgata ccgagccgat ctcaaaaagc cgtctcagtt cggattgcac 1200

tctgcaactc gagtgcatga aggtggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt 1260

gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagttg gtttgacctt 1320

aagccggtga gcgaacc 1337

<210> 10

<211> 439

<212> DNA

<213> Gluconacetobacter nataicola

<400> 10

tggccgacga gttcaagcgc gagcagggta tcgacctgcg tcaggacaag ctggccctgc 60

agcgcctgaa ggaagcggcg gaaaaggcga agatcgaact ctcctcctcc aaggagaccg 120

agatcaacct gccgttcatt accgctgatg catccggccc caagcacctt gtggtcaagc 180

tgagccgtgc gaagctcgaa agcctggtcg atgacctgat ccagcgcacg ctcgagccct 240

gccgcgcggc gatgaaggat gcgtcggttt cggctggcga gatcgacgaa gtcatcctcg 300

tgggcggcat gacccgcatg cccaaggtga tcgaggccgt caaagagttc tttggcaagg 360

aacccgcccg caacgtgaac cccgacgaag tggtcgccat cggcgccgcc gtgcagggtg 420

cggtgctgca gggtgacgt 439

<210> 11

<211> 724

<212> DNA

<213> Gluconacetobacter nataicola

<400> 11

gatgcgtgag gtcgcctcca agaccaacga catcgcgggt gacggcacca ccacggcaac 60

cgtgctggcg caggccatcg tgcgcgaagg cgccaaggcc gttgccgccg gcatgaaccc 120

gatggacctc aagcgcggca tcgacaaggc ggttggcgtt gtcgttgaag agctgaagaa 180

gaacgccaag aagatcacca ccccggccga gaccgcacag gtcggcacga tttccgccaa 240

tggcgagcat gaaatcggcg agatgatctc caaggcgatg cagaaggtcg gctccgaggg 300

cgtgatcacg gtggaagagg ccaagggcct gcacaccgag ctcgacgtgg tcgagggcat 360

gcagttcgac cgtggttaca tctccccgta tttcgtgacg aatgcggaga agatgaccgt 420

cgatctggac agcccctaca tcctgatcca cgagaagaag ctctcctcgc tccagcccat 480

cctgccgctg cttgaagctg ttgtgcagtc cggccgtccg ctgctgatca tcgctgaaga 540

tgtcgatggc gaagcgctgg cgaccctggt ggtcaacaag ctgcgtggtg gcctgaagat 600

cgccgccgtc aaggcgccgg gctttggcga ccgtcgcaag gccatgctgg aagacatcgc 660

gatcctgacc ggtggtcagg tcatcagcga agacctcggc atcaagctcg agagcgtgac 720

gctg 724

<210> 12

<211> 698

<212> DNA

<213> Gluconacetobacter nataicola

<400> 12

gtcattccct atcgtggctc gtggcttgat ttcgagttcg acagcaagga cctgatctac 60

gtccgtatcg accgcaagcg caagctgccg gtcacgacgc tgctgtacgc cctcgaaggc 120

gctgcctccg aggccgcccg cgccgccaag gccgccgagg gcggggatgt ggagtcgatg 180

gaaatccagg gcatggaccc tgatgagatc ctgtcctact tctacggcaa ggttgagttc 240

accaagaccg agaagggctg ggcgcgccgt ttcgatgccg aagccttccg tggccagaag 300

ctgctcgaac cgctgatcga cgcccagacc ggcgaggaag tggcgccggc cgatgccaag 360

ctgaccgcgc gcatggtccg caagatcgcc gagaccacca aggaggtgct tgtcggcccc 420

gcagggctga tcggccgctt cattgcaagc gatatcgtca acgagcacac cggtgagatc 480

tatgccgagg ctggcgacga gctgaccgag cagaagcttg aggaactcga gagcgaaggc 540

ctgaccacgc tgaccacgct ggcggtggac gcggccaatg gcccgtggat ccgcaatacg 600

ctggcggtgg acaagaacgc ctcacgcgag gaagcgctga ccgacatcta ccgtgtcatg 660

cgccccggcg agccgcccac gcccgagacg gcggaagc 698

Claims

1.一株产细菌纤维素菌株，其特征在于，所述的产细菌纤维素菌株为纳塔葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter nataicola)HEC-004，保藏号为CGMCC No.11588。

2.一种根据权利要求1所述菌株的鉴定方法，其特征在于，利用16S rDNA，dnaK，groEL和rpoB保守基因序列分析，鉴定菌株的确切种属。

3.一种根据权利要求1所述菌株生产纤维素膜的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(Ⅰ)发酵种子液的培养：取纳塔葡糖酸醋杆菌HEC-004，接种于50～100mL液体种子培养基中，25～30℃160～200rpm振荡培养24～48h；

(Ⅱ)细菌纤维膜的培养：在圆柱形或者方形发酵容器中加入发酵培养基，使液面高度为0.4～6cm，将步骤(Ⅰ)发酵种子液按4～6％接种量进行接种，容器敞口面用6～8层纱布覆盖，将发酵容器置于25～30℃，培养2～7天即可。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，以质量百分比计，步骤(Ⅰ)所述的液体种子培养基成分为：蔗糖2％～4％，(NH₄)₂SO₄ 0.4％～0.8％，MgSO₄·7H₂O 0.03％～0.05％，CaCl₂ 0.02％～0.04％，七水硫酸亚铁0.00002％～0.0005％，NaAC 0.06％～0.10％，酵母膏0.05％～0.2％。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，以质量百分比计，步骤(Ⅱ)所述的发酵培养基成分为：KH₂PO₄ 0.2％～0.4％，Na₂HPO₄·12H₂O 0.2％～0.4％，MgSO₄ 0.02％～0.05％，柠檬酸0.2％～0.4％，蔗糖2％～5％，大豆蛋白胨1％～3％。