CN103923865A - 细菌纤维素产生菌及利用该菌株发酵细菌纤维素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株细菌纤维素产生菌及利用该菌株发酵细菌纤维素的方法。该菌株为木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)BC13，于2014年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2014124。所述的发酵细菌纤维素的方法为：采用深层动态与浅层静态交替进行发酵，由于深层动态发酵时间较短，不会形成絮状或球形的细菌纤维素，最终又以浅层静态方式完成发酵，最终产物为膜片状的细菌纤维素。与现有技术相比，本发明可明显缩短生产周期，并较大幅度地提高细菌纤维素的产量。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一株细菌纤维素产生菌及利用该菌株发酵细菌纤维素的方法。
背景技术
细菌纤维素(bacterial cellulose)是由微生物(主要是细菌)利用液态培养基发酵产生的细胞外纤维素，为了与植物来源的纤维素相区别，将其称为细菌纤维素或微生物纤维素。与植物纤维素相比，它具有高结晶度、高化学纯度、高抗张强度、高弹性模量、吸水性强和生物相容性好等优点。这些优点使其在食品、生物医药、组织工程支架材料、声学器材、化妆品、膜过滤材料、造纸等领域具有巨大的应用潜力，并成为国内外生物材料的研究热点。但是，当前的细菌纤维素应用仍以食品领域为主，其它领域用量十分有限，其主要原因主要有两方面：其一，生物医药、组织工程支架材料等领域尚存在较多亟需解决的技术问题；其二，细菌纤维素生产效率较低、生产成本较高，限制了化妆品、造纸等领域的广发应用。
细菌纤维素于1886年被Brown发现，此后，国内外众多研究人员在菌种选育、原料选择、发酵工艺等方面进行了大量的研究。研究发现，发酵过程中的气流和搅拌对细菌纤维素凝胶膜的完整性有影响，浅层静态发酵是目前获得膜片状细菌纤维素的最好方法。由于食品工业的原料是细菌纤维素的主要应用方向，这方面的应用对细菌纤维素的膜片形状有较高的要求，决定了目前的细菌纤维素生产主要采用浅层静态发酵工艺。但是，浅层静态发酵工艺存在占地面积大、发酵周期长、劳动强度较大、发酵条件难控制等缺点。中国专利CN200710030072.0公开了深层与浅层静态偶联发酵生产高纤椰果的方法，可克服上述部分缺点，但是，仍存在不足，主要体现为：深层静态发酵阶段的时间较长，导致整个生产周期仍较长，生产效率仍有较大的提高空间。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株细菌纤维素产生菌。
本发明的另一目的在于提供上述菌株的应用。
本发明的再一目的在于提供利用上述菌株发酵细菌纤维素的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一株细菌纤维素产生菌，命名为木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)BC13，于2014年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2014124；
所述的细菌纤维素产生菌从自然发酵的椰子水中分离纯化得到；
所述的细菌纤维素产生菌具有如下形态特性和生理生化特性：
a、采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，所筛选的细菌纤维素产生菌革兰氏染色为阴性，在透射电镜(×7000)和扫描电镜(×10000)下观察，菌体呈椭圆的杆状，大小约为(0.4～0.6)μm×(1.3～2.8)μm，周生鞭毛；
b、菌落的形态特征为：该菌株在固体培养基(葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，琼脂20g/L，新鲜椰子水50％(v/v)，调节pH5.5，121℃灭菌20min)上30℃恒温培养72h，菌落形状为边缘整齐、中央凸起的圆形，颜色为乳白色，表面能形成皮革状的菌膜；
ｃ、主要的生理生化特征如表1所示：
表1生理生化试验结果
注：+表示阳性，-表示阴性；
该菌株可以产生细菌纤维素，从而可以用其作为发酵菌株生产细菌纤维素。
一种发酵细菌纤维素的方法，包含如下步骤：
(1)深层动态发酵
在深层培养器中，对发酵培养基进行加热灭菌，冷却至28～32℃，接入细菌纤维素菌种的摇瓶种子液，接种量为0.05％～10％(体积百分比)，启动搅拌和通入无菌空气进行动态发酵；
(2)浅层静态发酵
将步骤(1)得到的深层培养器中的发酵液泵送至无菌的浅层培养器内，进行静态发酵，至发酵液表面覆盖一层厚度为2～3mm的凝胶膜；
(3)深层动态与浅层静态交替发酵
①“分别静态发酵和动态发酵”：将步骤(2)中凝胶膜下面的大部分发酵液从浅层培养器泵送至深层培养器内，使浅层培养器中残留发酵液的液位为2～4mm，残留发酵液继续进行静态发酵8～12h；在深层培养器中，将无菌的新鲜发酵培养基添加到发酵液(从浅层培养器转入)中，添加量为初始动态发酵培养基体积的10％～20％，并用无菌的碱液调节pH至5.5～6.5，然后进行动态发酵8～12h；
②“合并静态发酵”：将步骤①中深层培养器内的发酵液泵送至浅层培养器内与浅层培养器内的发酵液合并，合并发酵液后进行静态发酵8～12h；
③重复步骤①、②，“分别静态发酵和动态发酵”和“合并静态发酵”交替进行，发酵液分开进行发酵累计4～6次；
(4)最后的浅层静态发酵
最后一次合并发酵液，在浅层培养器内继续静态发酵36～60h，即可结束整个发酵过程。
步骤(1)中所述的细菌纤维素菌种为木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacterxylinus)BC13、木醋杆菌(Acetobacter xylinus)(CGMCC1.1812)等，但不限于这些菌种；优选为木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)BC13，该菌种于2014年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2014124；
为了更好地实现本发明，步骤(1)中所述的发酵培养基的初始pH宜调节至5.0～6.0；
步骤(1)中所述的动态发酵的条件为搅拌转速为100～200rpm，发酵温度为28～32℃，通气量为0.05～0.15L/(min·L发酵液)，发酵时间为12～24h；
步骤(2)中浅层培养器首次装发酵液的液层高度应控制为15～20mm；
步骤(2)中所述的所述的静态发酵的条件为发酵温度为28～32℃，发酵时间为48～60h；
步骤(3)中所述的动态发酵的条件为搅拌转速为100～200rpm，温度为28～32℃，通气量为0.05～0.15L/(min·L发酵液)；
步骤(3)、(4)中所述的静态发酵的温度为28～32℃；
步骤(3)中所述的碱液优选氢氧化钠溶液或碳酸钠溶液，碱液浓度优选为50～100g/L，但不限于此浓度范围；
步骤(3)中将深层培养器内的发酵液泵送至浅层培养器时，应从浅层培养器底部缓慢进液，尽量避免液流搅动顶部的细菌纤维素凝胶膜；
本发明生产的细菌纤维素可以广泛应用于食品、生物医药、组织工程支架材料、声学器材、化妆品、造纸等领域。在食品工业中，细菌纤维素可以作为一种高纤维素、低脂肪、低热量的食品辅料，增强食品的稠度、弹性、韧性、咀嚼性和持水性等，并具有清肠道、防便秘等功效。在医学材料领域，细菌纤维素可以用于制作人造皮肤、生物敷料、人工血管、组织工程血管支架等。在声学器材领域，细菌纤维素可以用于制作超级音响、麦克风和耳机的振动膜，有利于提高音质。在化妆品领域，细菌纤维素可以作为化妆品的辅料，提高化妆品的润肤、保湿等功效。在造纸工业中，细菌纤维素可广泛应用各种特种纸的制造，例如流通货币特殊纸，提高纸张的强度、耐用性和抗膨胀性等。
本发明原理在于：细菌纤维素发酵属于好氧发酵，适宜发酵的pH范围一般为5.0～6.0。深层动态发酵有利于满足菌种对溶氧的需求，但不利于细菌纤维素膜片状产物的形成。浅层静态发酵有利于菌种产生细菌纤维素膜片状产物，但随着膜片状产物厚度的增加，发酵液中溶氧难以满足菌种的需求；同时由于酸类物质的代谢生成，发酵液的pH下降幅度很大，当pH下降至4.0以下时，会严重影响细菌纤维素的合成。而且，在静态的发酵液中，凝胶膜漂浮在液面，菌体容易与凝胶膜交织在一起，远离凝胶膜的液体区域所含菌体浓度较低。本发明将浅层培养器中大部分发酵液转入深层培养器，补充营养(新鲜培养基)和调节pH，通过较短时间的动态发酵，既可补充溶氧，又可提高发酵液中的菌体浓度；再将发酵液转入浅层培养器，对残留在浅层培养器内的残留物料起着调节pH、补充营养、补充溶氧、补充菌体等作用，有利于提高浅层静态发酵的细菌纤维素产量，也有利于缩短生产周期(图5)。
本发明相对于现有技术，具有如下优点和有益效果：
(1)本发明获得了一株可以发酵细菌纤维素的新菌株木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)BC13；
(2)本发明提供了一种利用上述菌株发酵细菌纤维素的方法：采用深层动态与浅层静态交替进行发酵，由于深层动态发酵时间较短，不会形成絮状或球形的细菌纤维素，最终又以浅层静态方式完成发酵，因而最终产物为膜片状的细菌纤维素。本发明与浅层静态法在膜片完整性方面的效果是一样的，而深层动态法只能形成絮状或球形的细菌纤维素产物。
(3)与浅层静态发酵法相比，本发明的生产周期可缩短20％～25％，细菌纤维素产量可提高20％～25％，有利于提高细菌纤维素的生产效率。
附图说明
图1菌种BC13在透射电镜下的菌体形态(×7000)图。
图2菌种BC13在扫描电镜下的菌体形态(×10000)图。
图3菌种BC13产物的傅里叶红外光谱图。
图4菌种BC13产物的超微结构图。
图5是本发明的发酵系统示意图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1细菌纤维素产生菌木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)BC13的筛选、驯化及分离
本发明所述的细菌纤维素产生菌木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacterxylinus)BC13分离筛选自然发酵产膜的椰子水(采样于海南省)。具体的筛选、驯化、分离以及产物鉴定方法如下：
(1)平板分离
固体培养基：葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，琼脂20g/L，新鲜椰子水50％(v/v)，调节pH5.5，121℃灭菌20min。按固体培养基配方制备平板，备用。在无菌操作条件下，将表面的菌膜从自然发酵椰子水中取出，剪取2g放入无菌试管中，加入10mL无菌水，置于涡旋振荡器上振荡5min，再将悬液进行梯度稀释，涂布于平板培养基上，于30℃恒温培养72h，观察菌落形态，然后挑取颗粒饱满的单个菌落，接入斜面培养基进行培养和保藏。
(2)发酵筛选
液体培养基：葡萄糖50g/L，酵母膏10g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，新鲜椰子水50％(v/v)，调节pH5.5，121℃灭菌20min。将液体培养基分装至250mL三角瓶中，每瓶装液100mL，121℃灭菌20min，冷却后，将挑取菌落的斜面菌种接入液体培养基，每瓶接入1环，恒温30℃静止培养240h，观察各菌株的产膜情况，并测定各瓶的细菌纤维素产量，根据测定结果优选出目标菌株，并进行菌种鉴定。
(3)产物定性的分析
用清水将目标菌株的凝胶膜状产物洗干净，浸泡于0.1mol/L的NaOH溶液中煮沸30min，用蒸馏水漂洗至中性，再置于105℃下进行干燥。产物的初步定性分析采用蒽酮显色法，即称取干燥后的产物0.1g，加入2～4℃的60％硫酸溶液100mL，于冰浴中消化2h，然后在比色管中分别加入消化液4mL和2％蒽酮1mL，观察显色结果。另外，产物特征官能团的分析采用傅里叶红外光谱(FTIR)法，即将干燥后的产物与KBr混合，研磨成粉末，经压片，通过傅里叶红外光谱仪在4000cm-1～400cm-1区间内进行扫描，测定产物的红外吸收光谱，分析产物的官能团特征。
(4)产物结构的分析
参照扫描电镜法，利用扫描电镜观察产物的微结构。
将纯化得到的菌落进行鉴定，鉴定结果如下：
a、采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，所筛选的细菌纤维素产生菌革兰氏染色为阴性，在透射电镜(×7000)和扫描电镜(×10000)下观察，菌体呈椭圆的杆状，大小约为(0.4～0.6)μm×(1.3～2.8)μm，周生鞭毛(图1和图2)；
b、菌落的形态特征为：该菌株在固体培养基(葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，琼脂20g/L，新鲜椰子水50％(v/v)，调节pH5.5，121℃灭菌20min)上30℃恒温培养72h，菌落形状为边缘整齐、中央凸起的圆形，颜色为乳白色，表面能形成皮革状的菌膜；；
ｃ、主要的生理生化特征如表2所示：
表2生理生化试验结果
注：+表示阳性，-表示阴性；
菌种BC13的凝胶膜状产物在0.1mol/L的NaOH溶液中煮沸30min，没有发生溶解；其干燥物经60％硫酸消化和蒽酮试剂显色，呈绿色，这与蒽酮显色法鉴定纤维素的原理吻合，可以初步判断凝胶膜状产物的主要成分为纤维素。发酵产物的红外光谱如图3所示，3584cm-1处的吸收峰是由O-H伸缩振动所致，2896cm-1处的吸收峰是大分子中C-H伸缩振动所致，1664cm-1处的吸收峰是由纤维素4′端的半缩醛基的伸缩振动所致，1555cm-1、1427cm-1和1336cm-1处的吸收谱带是C-H的弯曲振动所产生，1205cm-1和1061cm-1处的吸收谱带是由C-O的伸缩振动所产生。图3表明，发酵产物可能含有与纤维素结构相符合的基团，其红外光谱的特征与相关文献中细菌纤维素的红外光谱基本一致，因而可进一步推断发酵产物是细菌纤维素。在扫描电镜(×8000)下观察，产物的超微结构如图4所示。由于经过碱水煮沸处理，几乎没有发现菌体残留在产物中。产物呈现出由微纤维相互缠绕形成的致密的网状结构，纤维丝直径不足100nm。
经形态、生理生化和16S rDNA分子鉴定，该目标菌株为木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)BC13，于2014年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2014124。
实施例2
细菌纤维素菌种为木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)BC13，于2014年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2014124；
(1)种子扩大培养
种子扩大培养基配制：葡萄糖2g，酵母膏0.8g，MgSO4·7H2O0.02g，椰子水(新鲜椰子，破壳取水)50mL，纯净水50mL，调节pH5.5，装入500mL三角瓶，用8层纱布包扎瓶口，121℃灭菌20min，冷却至30℃，接入1环斜面菌种(用常规接种环进行接种)，置于振荡培养箱恒温30℃、150r/min振荡培养16h，得到种子液；
(2)深层动态发酵
发酵培养基配制：葡萄糖75g，酵母膏12g，NH4Cl1.5g，MgSO4·7H2O0.3g，椰子水(新鲜椰子，破壳取水)500mL，纯净水1000mL，调节pH5.0，装入深层培养器，于121℃灭菌20min，冷却至28℃；
将0.75mL种子液接入发酵培养基，启动搅拌和通入无菌空气，控制搅拌转速为100rpm，温度为28℃，通气量为0.075L/min，动态发酵24h；
(3)浅层静态发酵
将深层培养器中的发酵液泵送至无菌的浅层培养器内，液层高度为15mm，控制温度为28℃，静态发酵60h，至发酵液表面覆盖一层厚度为2mm的凝胶膜；
(4)深层动态与浅层静态交替发酵
①“分别静态发酵和动态发酵”：将步骤(3)中凝胶膜下面的大部分发酵液从浅层培养器泵送至深层培养器内，使浅层培养器中残留发酵液的液位为2mm，残留发酵液继续进行静态发酵，发酵温度为28℃，发酵时间为8h；在深层培养器中，将300mL无菌的新鲜培养基(与步骤(2)发酵培养基组分相同)加入到发酵液中，并用无菌的100g/L的氢氧化钠溶液调节pH至5.5，然后进行动态发酵，其中搅拌转速为100rpm，温度为28℃，通气量为0.075L/min，发酵时间为8h；
②“合并静态发酵”：将步骤①中深层培养器内的发酵液泵送至浅层培养器内，合并发酵液后进行静态发酵8h；
③重复步骤①、②，“分别静态发酵和动态发酵”和“合并静态发酵”交替进行，每隔8h操作一次，每次分开时都添加300mL无菌的新鲜培养基并调节pH至5.5，发酵液分开进行发酵累计5次；
(5)最后的浅层静态发酵
最后一次合并发酵液，在浅层培养器内继续静态发酵48h，发酵温度为28℃；整个发酵周期累计212h，获得厚度为24.5mm的细菌纤维素凝胶膜(片状)。
实施例3
细菌纤维素菌种为木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)BC13，于2014年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2014124；
(1)种子扩大培养
种子扩大培养基配制：葡萄糖4g，酵母膏1.6g，MgSO4·7H2O0.04g，椰子水(新鲜椰子，破壳取水)100mL，纯净水100mL，调节pH5.5，装入500mL三角瓶，用8层纱布包扎瓶口，121℃灭菌20min，冷却至30℃，接入1环斜面菌种(用常规接种环进行接种)，置于振荡培养箱恒温30℃、150r/min振荡培养16h，得到种子液；
(2)深层动态发酵
发酵培养基配制：葡萄糖100g，酵母膏14.4g，NH4Cl2g，MgSO4·7H2O0.4g，椰子水(新鲜椰子，破壳取水)600mL，纯净水1200mL，调节pH6.0，装入深层培养器，于121℃灭菌20min，冷却至30℃；
将200mL种子液接入发酵培养基，启动搅拌和通入无菌空气，控制搅拌转速为200rpm，温度为30℃，通气量为0.3L/min，动态发酵12h；
(3)浅层静态发酵
将深层培养器中的发酵液泵送至无菌的浅层培养器内，液层高度为20mm，控制温度为30℃，静态发酵48h，至发酵液表面覆盖一层厚度为3mm的凝胶膜；
(4)深层动态与浅层静态交替发酵
①“分别静态发酵和动态发酵”：将步骤(3)中凝胶膜下面的大部分发酵液从浅层培养器泵送至深层培养器内，使浅层培养器中残留发酵液的液位为4mm，残留发酵液继续进行静态发酵，发酵温度为30℃，发酵时间为12h；在深层培养器中，将300mL无菌的新鲜培养基(与步骤(2)培养基组分相同)加入到发酵液中，并用无菌的50g/L的氢氧化钠溶液调节pH至6.5，然后进行动态发酵，其中搅拌转速为200rpm，温度为30℃，通气量为0.3L/min，发酵时间12h；
②“合并静态发酵”：将步骤①中深层培养器内的发酵液泵送至浅层培养器内，合并发酵液后进行静态发酵12h；
③重复步骤①、②，“分别静态发酵和动态发酵”和“合并静态发酵”交替进行，每隔12h操作一次，每次分开时都添加300mL无菌的新鲜培养基并调节pH至6.5，发酵液分开进行发酵累计4次；
(5)最后的浅层静态发酵
最后一次合并发酵液，在浅层培养器内继续静态发酵60h，发酵温度为30℃；整个发酵周期累计216h，获得厚度为26mm的细菌纤维素凝胶膜(片状)。
实施例4
细菌纤维素菌种为木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)BC13，于2014年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2014124；
(1)种子扩大培养
种子扩大培养基配制：葡萄糖2g，酵母膏0.8g，MgSO4·7H2O0.02g，椰子水(新鲜椰子，破壳取水)50mL，纯净水50mL，调节pH5.5，装入500mL三角瓶，用8层纱布包扎瓶口，121℃灭菌20min，冷却至30℃，接入1环斜面菌种(用常规接种环进行接种)，置于振荡培养箱恒温30℃、150r/min振荡培养16h，得到种子液；
(2)深层动态发酵
发酵培养基配制：葡萄糖100g，酵母膏15.2g，NH4Cl2g，MgSO4·7H2O0.4g，椰子水(新鲜椰子，破壳取水)650mL，纯净水1250mL，调节pH5.5，装入深层培养器，于121℃灭菌20min，冷却至32℃；
将100mL种子液接入发酵培养基，启动搅拌和通入无菌空气，控制搅拌转速为150rpm，温度为32℃，通气量为0.2L/min，动态发酵16h；
(3)浅层静态发酵
将深层培养器中的发酵液泵送至无菌的浅层培养器内，液层高度为20mm，控制温度为32℃，静态发酵54h，发酵液表面产生一层厚度为2.5mm的凝胶膜；
(4)深层动态与浅层静态交替发酵
①“分别静态发酵和动态发酵”：将步骤(3)中凝胶膜下面的大部分发酵液从浅层培养器泵送至深层培养器内，使浅层培养器中残留发酵液的液位为3mm，残留发酵液继续进行静态发酵，发酵温度为32℃，发酵时间为9h；在深层培养器中，将200mL无菌的新鲜培养基(与步骤(2)培养基组分相同)加入到发酵液中，用无菌的80g/L的氢氧化钠溶液调节pH至6.0，然后进行动态发酵条件，其中搅拌转速为150rpm，温度为32℃，通气量为0.2L/min，发酵时间为9h；
②“合并静态发酵”：将步骤①中深层培养器内的发酵液泵送至浅层培养器内，合并发酵液后进行静态发酵9h；
③重复步骤①、②，“分别静态发酵和动态发酵”和“合并静态发酵”交替进行，每隔9h操作一次，每次分开时都添加200mL无菌的新鲜培养基并调节pH至6.0，发酵液分开进行发酵累计6次；
(5)最后的浅层静态发酵
最后一次合并发酵液，在浅层培养器内继续静态发酵36h，发酵温度为32℃；整个发酵周期累计214h，获得厚度为26.5mm的细菌纤维素凝胶膜(片状)。
实施例5
细菌纤维素菌种为木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)BC13，于2014年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2014124；
(1)种子扩大培养
种子扩大培养基配制：葡萄糖4g，酵母膏1.6g，MgSO4·7H2O0.04g，椰子水(新鲜椰子，破壳取水)100mL，纯净水100mL，调节pH5.5，装入500mL三角瓶，用8层纱布包扎瓶口，121℃灭菌20min，冷却至30℃，接入1环斜面菌种(用常规接种环进行接种)，置于振荡培养箱恒温30℃、150r/min振荡培养16h，得到种子液；
(2)深层动态发酵
发酵培养基配制：葡萄糖87.5g，酵母膏12.8g，NH4Cl1.75g，MgSO4·7H2O0.35g，椰子水(新鲜椰子，破壳取水)500mL，纯净水1100mL，调节pH5.5，装入深层培养器，于121℃灭菌20min，冷却至30℃；
将150mL种子液接入发酵培养基，启动搅拌和通入无菌空气，控制搅拌转速为150rpm，温度为30℃，通气量为0.2L/min，动态发酵16h；
(3)浅层静态发酵
将深层培养器中的发酵液泵送至无菌的浅层培养器内，液层高度为17.5mm，控制温度为30℃，静态发酵48h，发酵液表面产生一层厚度为2.2mm的凝胶膜；
(4)深层动态与浅层静态交替发酵
①“分别静态发酵和动态发酵”：将步骤(3)中凝胶膜下面的大部分发酵液从浅层培养器泵送至深层培养器内，使浅层培养器中残留发酵液的液位为3mm，残留发酵液继续进行静态发酵，发酵温度为30℃，发酵时间为10h；在深层培养器中，将280mL无菌的新鲜培养基(与步骤(2)培养基组分相同)加入到发酵液中，用无菌的100g/L的氢氧化钠溶液调节pH至6.0，然后进行动态发酵条件，其中搅拌转速为150rpm，温度为30℃，通气量为0.2L/min，发酵时间为10h；
②“合并静态发酵”：将步骤①中深层培养器内的发酵液泵送至浅层培养器内，合并发酵液后进行静态发酵10h；
③重复步骤①、②，“分别静态发酵和动态发酵”和“合并静态发酵”交替进行，每隔10h操作一次，每次分开时都添加280mL无菌的新鲜培养基并调节pH至6.0，发酵液分开进行发酵累计5次；
(5)最后的浅层静态发酵
最后一次合并发酵液，在浅层培养器内继续静态发酵48h，发酵温度为30℃；整个发酵周期累计212h，获得厚度为25.5mm的细菌纤维素凝胶膜(片状)。
对比实施例1(浅层静态发酵)
细菌纤维素菌种为木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)BC13，于2014年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2014124；
(1)种子扩大培养
种子扩大培养基配制：葡萄糖4g，酵母膏1.6g，MgSO4·7H2O0.04g，椰子水(新鲜椰子，破壳取水)100mL，纯净水100mL，调节pH5.5，装入500mL三角瓶，用8层纱布包扎瓶口，121℃灭菌20min，冷却至30℃，接入1环斜面菌种(用常规接种环进行接种)，置于振荡培养箱恒温30℃、150r/min振荡培养16h，得到种子液；
(2)浅层静态发酵
发酵培养基配制：葡萄糖160g，酵母膏24.3g，NH4Cl3.2g，MgSO4·7H2O0.64g，椰子水(新鲜椰子，破壳取水)1040mL，纯净水2000mL，调节pH6.0，121℃灭菌20min，装入无菌的浅层培养器中，冷却至30℃；
将160mL种子液接入发酵培养基，液层高度约为32mm，控制温度为30℃，静态发酵280h，获得厚度为20.2mm的细菌纤维素凝胶膜(片状)。
对比实施例2(深层与浅层静态偶联发酵)
细菌纤维素菌种为木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)BC13，于2014年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2014124；
(1)种子扩大培养
种子扩大培养基配制：葡萄糖4g，酵母膏1.6g，MgSO4·7H2O0.04g，椰子水(新鲜椰子，破壳取水)100mL，纯净水100mL，调节pH5.5，装入500mL三角瓶，用8层纱布包扎瓶口，121℃灭菌20min，冷却至30℃，接入1环斜面菌种(用常规接种环进行接种)，置于振荡培养箱恒温30℃、150r/min振荡培养16h，得到种子液；
(2)深层静态发酵
发酵培养基配制：葡萄糖160g，酵母膏24.3g，NH4Cl3.2g，MgSO4·7H2O0.64g，椰子水(新鲜椰子，破壳取水)1040mL，纯净水2000mL，调节pH6.0，装入深层培养器，121℃灭菌20min，冷却至30℃。
将160mL种子液接入发酵培养基，进行深层静态发酵84h。发酵过程中，在发酵液面的空间连续通入无菌空气，无菌空气流量为0.1L/min，使发酵罐内压力为0.01～0.02MPa，以防杂菌污染；同时，温度控制为30℃；
(3)浅层静态发酵
将经深层静态发酵的发酵液转入到浅层培养器中，液层高度约为32mm，控制温度为28～32℃，静态发酵190h，整个发酵周期累计274h，获得厚度为20.4mm的细菌纤维素凝胶膜(片状)。
与对比实施例1和对比实施例2相比，本发明的生产周期可缩短20％～25％，细菌纤维素产量可提高20％～25％，有利于提高细菌纤维素的生产效率。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一株细菌纤维素产生菌，其特征在于：该菌为木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)BC13，于2014年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称：CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2014124。
2.权利要求1所述的细菌纤维素产生菌在发酵细菌纤维素中的应用。
3.一种发酵细菌纤维素的方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)深层动态发酵
在深层培养器中，对发酵培养基进行加热灭菌，冷却至28～32℃，接入细菌纤维素菌种的摇瓶种子液，接种量为体积百分比0.05％～10％，启动搅拌和通入无菌空气进行动态发酵；
(2)浅层静态发酵
将步骤(1)得到的深层培养器中的发酵液泵送至无菌的浅层培养器内，进行静态发酵，至发酵液表面覆盖一层厚度为2～3mm的凝胶膜；
(3)深层动态与浅层静态交替发酵
①“分别静态发酵和动态发酵”：将步骤(2)中凝胶膜下面的大部分发酵液从浅层培养器泵送至深层培养器内，使浅层培养器中残留发酵液的液位为2～4mm，残留发酵液继续进行静态发酵8～12h；在深层培养器中，将无菌的新鲜发酵培养基添加到发酵液中，添加量为初始动态发酵培养基体积的10％～20％，并用无菌的碱液调节pH至5.5～6.5，然后进行动态发酵8～12h；
②“合并静态发酵”：将步骤①中深层培养器内的发酵液泵送至浅层培养器内与浅层培养器内的发酵液合并，合并发酵液后进行静态发酵8～12h；
③重复步骤①、②，“分别静态发酵和动态发酵”和“合并静态发酵”交替进行，发酵液分开进行发酵累计4～6次；
(4)最后的浅层静态发酵
最后一次合并发酵液，在浅层培养器内继续静态发酵36～60h，即可结束整个发酵过程；
步骤(1)中所述的细菌纤维素菌种为权利要求1所述的木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)BC13，于2014年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称：CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2014124。
4.根据权利要求3所述的发酵细菌纤维素的方法，其特征在于：
步骤(1)所述的发酵培养基的初始pH调节至5.0～6.0。
5.根据权利要求3所述的发酵细菌纤维素的方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的动态发酵的条件为搅拌转速为100～200rpm，发酵温度为28～32℃，通气量为0.05～0.15L/(min·L发酵液)，发酵时间为12～24h。
6.根据权利要求3所述的发酵细菌纤维素的方法，其特征在于：
步骤(2)中浅层培养器首次装液的液层高度应控制为15～20mm。
7.根据权利要求3所述的发酵细菌纤维素的方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的所述的静态发酵的条件为发酵温度为28～32℃，发酵时间为48～60h。
8.根据权利要求3所述的发酵细菌纤维素的方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的动态发酵的条件为搅拌转速为100～200rpm，温度为28～32℃，通气量为0.05～0.15L/(min·L发酵液)。
9.根据权利要求3所述的发酵细菌纤维素的方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的碱液为氢氧化钠溶液或碳酸钠溶液，碱液浓度为50～100g/L。
10.根据权利要求3所述的发酵细菌纤维素的方法，其特征在于：
步骤(3)、(4)中所述的静态发酵的温度为28～32℃；
步骤(3)中将深层培养器内的发酵液泵送至浅层培养器时，从浅层培养器底部缓慢进液。
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