CN105255807B - 一种冠突散囊菌的分生孢子的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种冠突散囊菌的分生孢子的制备方法，该方法包括：(1)将冠突散囊菌株培养至产生菌丝但不产生孢子；(2)在高渗、高温和高湿中至少一种条件下继续进行培养。采用本发明的方法能够快速地制备纯的冠突散囊菌的分生孢子，将其作为人工接种物应用于茯砖茶的工业化生产，能够提高茯砖茶产品质量的稳定性。

Description

一种冠突散囊菌的分生孢子的制备方法

技术领域

本发明涉及一种冠突散囊菌的分生孢子的制备方法。

背景技术

“金花菌”，即冠突散囊菌，是茯砖茶生产的优势菌，在茯砖茶上长有大量金黄色颗粒，俗称“金花”。“金花”是茯砖茶独特风味的主要影响因素，长年饮用茯砖茶有调理肠胃、促进消化、降血糖、降血脂、增强人体体质及延缓衰老等功效，而这些功效与“金花菌”的作用是密不可分的。人们通常根据“金花菌”的质量和数量来判断茯砖茶品质的好坏。齐祖同、温琼英等对茯砖茶优势菌进行了培养鉴定，发现该优势菌最主要的特征是具冠状突起及表面明显粗糙具小疣的子囊孢子和具小刺的分生孢子，是产生有性型(子囊孢子阶段)和无性型(分生孢子阶段)孢子的全型真菌，并以子囊孢子和分生孢子为主要依据正式将该菌有性型鉴定为冠突散囊菌。

茯砖茶加工中的“发花”过程是形成茯砖茶独特品质的关键工艺，“发花”的实质是通过控制一定的外界条件，促使微生物优势菌——冠突散囊菌(Eurotium cristatum)的生长繁殖，产生金黄色的闭囊壳。由于冠突散囊菌等微生物的大量参与，形成了特有的菌花香，并由于这些微生物的作用以及在加工过程中的高温高湿作用下，茶多酚的氧化、缩合，蛋白质和纤维素等大分子的分解，氨基酸、糖类和咖啡碱等各成分之间的聚合、缩合等一系列的复杂反应，形成了茯砖茶独特的品质特征。

目前，我国茯砖茶的生产几乎都是靠自然接种发酵，行业内对冠突散囊菌的生物学特性研究并不深入，对此菌的生长发育特性了解不够，发花条件掌握不好，冠突散囊菌无法在培养前期形成优势菌，会造成其他杂菌污染严重(比如黑曲霉、酵母和青霉菌等)，最终产品不能形成大量“金花”，造成产品质量低劣，质量不稳定，不易销售，甚至原料的极大浪费，产量低，周期长等不良现象，为此有必要进行人工接种生产。

人工接种可避免杂菌污染，但需大量接种物(孢子)。刘作易等(1991年，茯砖茶金花菌生长条件研究)研究结果表明，冠突散囊菌的子囊孢子和分生孢子的单孢子均能形成相似菌落，均能产生分生孢子和子囊孢子，孢子的有性型和无性型在特定条件下可以相互转化，证明了该菌为同宗配合菌。当分生孢子作为接种物时，其能够大量快速积累且孢子质量稳定性也较好，所以选择分生孢子作为接种物更加适合。

中国专利申请CN102120964A“冠突散囊菌孢子悬浮液制备方法”中公开了一种冠突散囊菌孢子悬浮液的制备方法，金花孢子颗粒均匀，短期内能制备大量孢子悬浮液，用于茯砖茶的工业化生产。中国专利申请CN102965328A公开了一种金花菌孢子粉的制备方法，获得的金花孢子粉既可以用于茯砖茶的工业化生产，也可以用于金花菌功能性成分的提取，缩短了茯砖茶生产周期，降低了发花失败的风险。以上两篇公开专利均是研究“金花”孢子，实质上是冠突散囊菌的分生孢子和子囊孢子的混合物。

因此，亟待建立一种快速、大量积累纯种分生孢子的培养方法，将其作为人工接种物应用于茯砖茶的工业化生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速、大量积累纯种分生孢子的方法，以用分生孢子作为接种物，克服现有技术中冠突散囊菌的有性孢子遗传不稳定，进而造成茯砖茶产品质量不稳定的缺陷。

本发明的发明人在研究中发现，将冠突散囊菌株培养至产生菌丝但不产生孢子，然后在高渗、高温和高湿中至少一种条件下继续进行培养，即可实现快速、大量积累纯种分生孢子的发明目的。

因此，为了实现上述目的，本发明提供了一种冠突散囊菌的分生孢子的制备方法，该方法包括：

(1)将冠突散囊菌株培养至产生菌丝但不产生孢子；

(2)在高渗、高温和高湿中至少一种条件下继续进行培养。

优选地，在高渗、高温和高湿中的至少两种条件下继续进行培养。

优选地，步骤(2)中，所述高温的条件为30-37℃。

优选地，步骤(2)中，所述高湿的条件为培养的空气湿度为70-95％。

优选地，步骤(2)中，所述高渗的条件包括：当固体培养时，相对于直径为100mm的圆形培养基，通过喷洒10-30mL的NaCl饱和溶液来提供；当液体培养时，通过向液体培养液中添加NaCl饱和溶液来提供，并使得以液体培养液的总重量为基准，NaCl的含量为1-6重量％。

采用本发明的方法能够快速地制备纯的冠突散囊菌的分生孢子，将其作为人工接种物应用于茯砖茶的工业化生产，能够提高茯砖茶产品质量的稳定性。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供了一种冠突散囊菌的分生孢子的制备方法，该方法包括：

(1)将冠突散囊菌株培养至产生菌丝但不产生孢子；

(2)在高渗、高温和高湿中至少一种条件下继续进行培养。

在本发明中，步骤(1)和步骤(2)中的培养可以为固体培养或液体培养，本领域的技术人员应该理解的是，当培养为液体培养时，液体本身就提供了高湿的条件，因此，当培养为液体培养时，步骤(2)中，在高渗、高温和高湿条件中至少一种条件下继续进行培养是指在高渗和/或高温条件下继续进行培养。

在本发明中，步骤(2)中的继续进行培养是指在原来的固体培养基上或液体培养液中继续进行培养，即从步骤(1)的培养到步骤(2)的继续进行培养的过程中，一直不更换培养基。

根据本发明所述的方法，其中，步骤(2)中，只要在高渗、高温和高湿中至少一种条件下继续进行培养即可，但是，为了进一步提高分生孢子的纯度，优选地，在高渗、高温和高湿中的至少两种条件下继续进行培养。

根据本发明所述的方法，其中，步骤(2)中，高温的条件优选为30-37℃，在该高温条件下继续进行培养，能够进一步提高分生孢子的纯度。

根据本发明所述的方法，其中，步骤(2)中，高湿的条件可以为本领域常规的高湿条件，优选地，所述高湿的条件为培养的空气湿度为70-95％，在该湿度条件下继续进行培养，能够进一步提高分生孢子的纯度。

根据本发明所述的方法，其中，步骤(2)中，高渗的条件可以为本领域常规的高渗条件，优选地，所述高渗的条件包括：当固体培养时，直径为100mm的圆形培养基，通过喷洒10-30mL的NaCl饱和溶液来提供；当液体培养时，通过向液体培养液中添加NaCl饱和溶液来提供，并使得以液体培养液的总重量为基准，NaCl的含量为1-6重量％，在上述高渗条件下继续进行固体培养或液体培养，能够进一步提高分生孢子的纯度。

优选地，步骤(2)中，当固体培养时，所述培养的时间为5-8天；当液体培养时，所述培养的条件包括：时间为24-72小时，通气量为0-0.1vvm，搅拌速度为100-200rpm。

根据本发明所述的方法，其中，步骤(1)中，培养的条件可以为本领域常规的用于培养冠突散囊菌的条件，优选地，当固体培养时，培养的条件包括：温度为28-29℃，空气湿度为50-70％，时间为12-72小时；当液体培养时，培养的条件包括：温度为28-29℃，通气量为0.5-1vvm，搅拌速度为200-400rpm，培养时间为培养至1L液体培养液中冠突散囊菌的生物量干重为5-20g，从而能够进一步提高分生孢子的纯度。

根据本发明所述的方法，其中，对冠突散囊菌株的种类没有特殊的限定，例如冠突散囊菌株可以为冠突散囊菌孢子和/或菌体培养物。在本发明中，菌体培养物指的是菌体孢子以外的菌体存活形式。

根据本发明所述的方法，其中，固体培养的固体培养基和液体培养的液体培养液可以为冠突散囊菌所需的常规的培养基或培养液，例如，当固体培养时，固体培养基可以包括：相对于1000g的固体培养基，糖类的含量为5-30g，黑茶提取物的含量为5-50g，琼脂的含量为10-15g，余量为水；当液体培养时，液体培养液可以包括：相对于1000g的液体培养液，糖类的含量为5-30g，黑茶提取物的含量为5-50g，余量为水。

在本发明中，黑茶提取物可以为本领域常规的用于冠突散囊菌培养所需的黑茶提取物，例如可以采用下述方法制备：茯砖茶和水按照质量比1：20进行混合，并在常压下煮沸30分钟，然后过滤取滤液即得，其中，该茯砖茶可以为商购。

本领域的技术人员应该理解的是，在将冠突散囊菌接种于固体培养基上或者液体培养液中前，要对固体培养基和液体培养液进行灭菌，灭菌的条件可以为：温度为115-121℃，时间为10-30min。

在本发明中，可以通过在冠突散囊菌培养过程中是否产生了子囊果来确定最终制得的孢子是否为分生孢子，如果冠突散囊菌培养过程中没有产生子囊果，则表明制得的孢子只为分生孢子，如果在冠突散囊菌培养过程中产生了子囊果，则表明制得的孢子为分生孢子和子囊孢子的混合物。其中，子囊果的确定方法为在显微镜下分辨有无子囊果的产生。

实施例

在以下实施例和对比例中，NaCl饱和溶液中NaCl的质量分数为36重量％。

采用专利申请201410097806.7中的冠突散囊菌，该菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC NO.8730，采用该已保藏的冠突散囊菌进行制备冠突散囊菌孢子，具体的制备方法为：用接种针将置于冷冻试管中的冠突散囊菌原种挑出，并移种于常规PDA平板固体培养基，在28℃条件下置于霉菌培养箱中培养8天，菌种于自然条件下生长。最终，菌体在培养结束后，用无菌生理盐水倒入固体培养表面，洗涤后经八层无菌纱布取滤液即得到冠突散囊菌孢子。

采用上述已保藏的冠突散囊菌进行制备菌体培养物，具体的制备方法为：用接种针将置于冷冻试管中的冠突散囊菌原种挑出移种或者采用孢子悬浮液涂布于PDA固体培养基中，在28℃条件下培养5天，在白色菌落变黄之前收获菌体培养物，用于进一步的培养。

PDA平板固体培养基为：马铃薯300g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，自然pH。

在以下实施例和对比例中，固体培养基为：糖类的含量为20g，黑茶提取物的含量为45g，琼脂的含量为15g，蒸馏水的含量920g。

在以下实施例和对比例中，液体培养液为：糖类的含量为20g，黑茶提取物的含量为45g，蒸馏水的含量为935g。

黑茶提取物的制备：将商购的茯砖茶和蒸馏水按照质量比1：20进行混合，并在常压下煮沸30分钟，然后过滤取滤液即得。

上述固体培养基和液体培养液均在118℃灭菌20min即可。

在以下实施例和对比例中，通过在冠突散囊菌培养过程中是否产生了子囊果来确定最终制得的孢子是否为分生孢子，如果冠突散囊菌培养过程中没有产生子囊果，则表明制得的孢子只为分生孢子，如果在冠突散囊菌培养过程中产生了子囊果，则表明制得的孢子为分生孢子和子囊孢子的混合物。其中，子囊果的确定方法为在显微镜下分辨有无子囊果的产生。

实施例1

本实施例用于说明本发明的冠突散囊菌的分生孢子的制备方法

(1)将1mL冠突散囊菌孢子接种于1L灭菌后的液体培养液中，在温度为28℃，通气量为1vvm，搅拌速度为400rpm条件下，进行液体培养，培养至1L液体培养液中冠突散囊菌的生物量干重为20g；

(2)向步骤(1)的液体培养的培养液中加入NaCl饱和溶液，加入的量使得液体培养液中NaCl的质量分数为4重量％，然后在温度为30℃，通气量为0.1vvm，搅拌速度为200rpm条件下，继续进行培养72小时，然后将含有分生孢子的培养液进行固液分离，并将过滤得到的孢子固体物用100mL的灭菌蒸馏水制成100mL的孢子悬浮液，将该悬浮液在显微镜下进行观测，观测到孢子悬浮液中没有子囊果，即产生的孢子只为分生孢子。

实施例2

本实施例用于说明本发明的冠突散囊菌的分生孢子的制备方法

(1)将1mL冠突散囊菌孢子接种于1L的灭菌后的液体培养液中，在温度为29℃，通气量为0.5vvm，搅拌速度为200rpm条件下，进行液体培养，培养至1L液体培养液中冠突散囊菌的生物量干重为10g；

(2)然后在温度为37℃，通气量为0.1vvm，搅拌速度为100rpm条件下，继续进行培养24小时，然后将含有分生孢子的培养液进行固液分离，并将过滤得到的孢子固体物用100mL的灭菌蒸馏水制备成100mL的孢子悬浮液，将该悬浮液在显微镜下进行观测，观测到孢子悬浮液中没有子囊果，即产生的孢子只为分生孢子。

实施例3

本实施例用于说明本发明的冠突散囊菌的分生孢子的制备方法

(1)将菌落上刮下的菌体培养物接种于面积为100mm的灭菌后的圆形固体培养基上，在温度为28℃，空气湿度为60％条件下，进行固体培养50小时至产生菌丝但不产生孢子；

(2)然后在温度为30℃，空气湿度为95％，向上述固体培养基表面喷洒10mL的NaCl饱和溶液，继续进行培养8天，然后停止培养，用100mL的灭菌蒸馏水冲洗培养基的表面，制备成100mL的孢子悬浮液，将该悬浮液在显微镜下进行观测，观测到孢子悬浮液中没有子囊果，即产生的孢子只为分生孢子。

对比例1

按照实施例3的方法制备冠突散囊菌的分生孢子，不同的是，步骤(2)中，继续在温度为28℃，空气湿度为60％，且不向步骤(1)的固体培养基表面喷洒NaCl饱和溶液，制得100mL的孢子悬浮液，将该悬浮液在显微镜下进行观测，观测到孢子悬浮液中存在大面积的子囊果，即产生的孢子为分生孢子和子囊孢子的混合物。

将实施例1-3与对比例1进行比较可以看出，采用本发明的方法制得的孢子只为分生孢子，而对比例1中由于在培养过程中有大量的子囊果的产生，因此，制得的孢子为分生孢子和子囊孢子的混合物。因此，本发明的方法制备的分生孢子的纯度较高。

因此，采用本发明的方法能够快速地制备冠突散囊菌的分生孢子，将其作为人工接种物应用于茯砖茶的工业化生产，能够提高茯砖茶产品质量的稳定性。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (5)

1.一种冠突散囊菌的分生孢子的制备方法，其特征在于，该方法包括：

(1)将冠突散囊菌株培养至产生菌丝但不产生孢子；

(2)在高渗、高温和高湿中至少两种条件下继续进行培养；

其中，所述高温的条件为30-37℃；

所述高湿的条件为培养的空气湿度为70-95％；

所述高渗的条件包括：当固体培养时，相对于直径为100mm的圆形培养基，通过喷洒10-30mL的NaCl饱和溶液来提供；当液体培养时，通过向液体培养液中添加NaCl饱和溶液来提供，并使得以液体培养液的总重量为基准，NaCl的含量为1-6重量％。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中，当固体培养时，所述培养的条件包括：温度为28-29℃，空气湿度为50-70％，时间为12-72小时；当液体培养时，所述培养的条件包括：温度为28-29℃，通气量为0.5-1vvm，搅拌速度为200-400rpm，培养时间为培养至1L液体培养液中冠突散囊菌的生物量干重为5-20g。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(2)中，当固体培养时，所述培养的时间为5-8天；当液体培养时，所述培养的条件包括：时间为24-72小时，通气量为0-0.1vvm，搅拌速度为100-200rpm。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述冠突散囊菌株为冠突散囊菌孢子和/或菌体培养物。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，当固体培养时，固体培养基包括：相对于1000g的固体培养基，糖类的含量为5-30g，黑茶提取物的含量为5-50g，琼脂的含量为10-15g，余量为水；当液体培养时，液体培养液包括：相对于1000g的液体培养液，糖类的含量为5-30g，黑茶提取物的含量为5-50g，余量为水。