CN108998404B - 一种诱导炭疽菌产生分生孢子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种诱导炭疽菌分生孢子产生的方法，属于植物保护技术领域；它包括如下步骤：(1)炭疽菌活化：将炭疽菌接种于培养基上进行活化培养，即得活化后的炭疽菌；(2)诱导产生孢子：取步骤(1)中活化后的炭疽菌放入烘箱进行高温培养，然后取出置于27℃恒温培养箱进行恒温培养7d，即可诱导分生孢子的产生；本发明首次将炭疽菌先进行高温培养再进行恒温培养，实现简便和大量诱导炭疽菌产生大量孢子，对于炭疽菌的致病力测定、其杀菌剂生物活性测定以及品种的抗病性鉴定等研究具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于植物保护技术领域，具体地说，涉及一种诱导炭疽菌产生分生孢子的方法。
背景技术
农作物炭疽病是由炭疽菌(Colletotrichum sp.)引起的真菌性病害，除侵染大田作物外，还可为害无花果、桃、梨、葡萄和柑橘等多种果树和花卉，随着生产水平的提高和气候的变化，该病发生日益严重，成为影响作物产量和品质的主要病害。为了用于炭疽菌致病力测定、杀菌剂的生物活性测定以及品种的抗病性鉴定等研究，常规的炭疽菌的诱导产生孢子方法为自然产孢法和酵母PDA诱导法：
自然产孢法：挑取4℃下保存的菌丝置于PDA平板培养基上，于27℃恒温培养箱中活化培养一段时间后，等待其产孢；该方法诱导炭疽菌产孢很慢，产孢不稳定，甚至可能不会产孢；
酵母PDA诱导法：挑取4℃下保存的菌丝置于加酵母的PDA平板培养基上，于27℃恒温培养箱中活化培养一段时间后，等待其产孢；但该方法诱导炭疽菌产孢量较小。
发明内容
1、要解决的问题
针对现有的炭疽菌尚无有效诱导产生孢子方法的问题，本发明提供一种诱导炭疽菌产生分生孢子的方法，它可以有效诱导炭疽菌孢子的大量产生。
2、技术方案
为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
一种诱导炭疽菌产生分生孢子的方法，包括如下步骤：
(1)炭疽菌活化：将炭疽菌接种于培养基上进行活化培养，即得活化后的炭疽菌；
(2)诱导产生孢子：取步骤(1)中活化后的炭疽菌放入烘箱进行高温培养，然后取出置于恒温培养箱进行恒温培养，即可诱导产生分生孢子。
优选地，步骤(1)中所述的炭疽菌为胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides(Penz.)Sacc.)。
优选地，步骤(1)中炭疽菌的保藏温度为4℃；步骤(1)中培养基为PDA平板培养基。
优选地，步骤(1)中所述的活化培养的条件为26℃-30℃温度下黑暗培养5d。
优选地，步骤(1)中所述的活化培养的条件为27℃温度下。
优选地，步骤(2)中高温培养的温度为35℃-55℃，优选地，所述的高温培养的温度为50℃。
优选地，步骤(2)中高温培养的时间为1h-4h。
优选地，步骤(2)中高温培养的时间为3h。
优选地，步骤(2)中恒温培养的温度为27℃，恒温培养的时间为7d。
3、有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)产孢量大：本发明的方法可以在7d内获得大量的炭疽菌的分生孢子，较自然产孢法相比，产孢量大且稳定；较酵母PDA诱导方法相比，其产孢量远大于酵母PDA诱导法；
(2)简便：烘箱是实验室常用必备仪器之一，烘菌方便快速，且产孢量巨大。
附图说明
图1为实施例1中自然产孢法的产孢情况；
图2为实施例1中酵母PDA诱导法的产孢情况；
图3为实施例1中高温诱导法(35℃、1h)的产孢情况；
图4为实施例1中高温诱导法(35℃、2h)的产孢情况；
图5为实施例1中高温诱导法(35℃、3h)的产孢情况；
图6为实施例1中高温诱导法(35℃、4h)的产孢情况；
图7为实施例1中高温诱导法(40℃、1h)的产孢情况；
图8为实施例1中高温诱导法(40℃、2h)的产孢情况；
图9为实施例1中高温诱导法(40℃、3h)的产孢情况；
图10为实施例1中高温诱导法(40℃、4h)的产孢情况；
图11为实施例1中高温诱导法(45℃、1h)的产孢情况；
图12为实施例1中高温诱导法(45℃、2h)的产孢情况；
图13为实施例1中高温诱导法(45℃、3h)的产孢情况；
图14为实施例1中高温诱导法(45℃、4h)的产孢情况；
图15为实施例1中高温诱导法(50℃、1h)的产孢情况；
图16为实施例1中高温诱导法(50℃、2h)的产孢情况；
图17为实施例1中高温诱导法(50℃、3h)的产孢情况；
图18为实施例1中高温诱导法(50℃、4h)的产孢情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1
一种诱导炭疽菌产生分生孢子的方法，包括如下步骤：
(1)胶孢炭疽菌活化：在超净工作台上，将4℃保藏的胶孢炭疽菌(菌株从中国农业微生物菌种保藏管理中心购买，菌株编号：ACCC 31200)接种于PDA平板培养基上进行活化培养，所述的活化培养的条件为27℃温度下黑暗培养5d，即得活化后的胶孢炭疽菌；
(2)自然诱导产生孢子(自然产孢法)：取步骤(1)中活化后的胶孢炭疽菌放入恒温培养箱进行恒温培养，具体步骤如下：在超净工作台上，用直径为0.5cm的打孔器在PDA平板培养基的菌落边缘处打孔，取菌丝块(即活化后的胶孢炭疽菌)置于直径为9cm的无菌培养皿(无菌培养皿中预先配制PDA平板培养基)中，并将其放入恒温培养箱进行恒温培养，恒温培养的温度为27℃，恒温培养的时间为7d，观察其产孢情况。
(3)酵母诱导产生孢子(酵母PDA诱导法)：前序步骤基本同步骤(1)，所不同的在于：步骤(1)中所述的PDA平板培养基为加入酵母粉配制而成的PDA培养基(1g酵母粉/1000ml PDA)；取步骤(1)中活化后的胶孢炭疽菌放入恒温培养箱进行恒温培养，具体步骤如下：在超净工作台上，用直径为0.5cm的打孔器在PDA平板培养基的菌落边缘处打孔，取菌丝块(即活化后的胶孢炭疽菌)置于直径为9cm的无菌培养皿(无菌培养皿预先配制上述“加入酵母粉配制而成的PDA培养基(1g酵母粉/1000ml PDA)”)中，并将其放入恒温培养箱进行恒温培养，恒温培养的温度为27℃，恒温培养的时间为7d，观察其产孢情况。
(4)高温诱导产生孢子(高温诱导法)：取步骤(1)中活化后的胶孢炭疽菌放入烘箱进行高温培养后再放入恒温培养箱进行恒温培养，具体步骤如下：在超净工作台上，用直径为0.5cm的打孔器在PDA平板培养基的菌落边缘处打孔，取菌丝块(即活化后的胶孢炭疽菌)置于直径为9cm的无菌培养皿(无菌培养皿预先配制PDA平板培养基)中，并将其放入烘箱中进行高温培养，高温培养的温度分别为35℃、40℃、45℃、50℃及55℃，相应的高温培养的时间分别为1h、2h、3h及4h，然后取出置于27℃恒温培养箱进行恒温培养，恒温培养的温度为27℃，恒温培养的时间为7d，观察其产孢情况。
由表1及图1-图18可知，自然产孢法不会产孢；酵母PDA诱导法产孢量低；高温诱导法虽然产孢时间比酵母PDA诱导法晚，但在恒温培养第7天时产孢总量巨大(图中红色的部分表示胶孢炭疽菌的孢子)，同时还可以得出当高温培养的温度为50℃且高温培养的时间为3h时，其为胶孢炭疽菌高温诱导产生孢子的最佳条件。但高温培养的温度为35℃、40℃和45℃时且高温培养的时间为1h和2h时，胶孢炭疽菌均不产生孢子；此外，高温培养的温度为55℃时，高温培养的时间分别为1h-4h，均未观察到产孢现象，且菌丝本身也不继续生长。
表1三种方法产孢情况比较
以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。
Claims (2)
1.一种诱导炭疽菌产生分生孢子的方法，其特征在于：包括如下步骤： (1)炭疽菌活化：将炭疽菌接种于培养基上进行活化培养，即得活化后的炭疽菌； (2)诱导产生孢子：取步骤(1)中活化后的炭疽菌放入烘箱进行高温培养，然后取出置于恒温培养箱进行恒温培养，即可诱导产生分生孢子；
步骤(1)中所述的炭疽菌为胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides(Penz.) Sacc.)；
步骤(1)中炭疽菌的保藏温度为4℃；步骤(1)中培养基为PDA平板培养基；
步骤(1)中所述的活化培养的条件为26℃-30℃温度下黑暗培养5d-7d；
步骤(2)中高温培养的温度为50℃；
步骤(2)中高温培养的时间为3h-4h；
步骤(2)中恒温培养的温度为27℃，恒温培养的时间为7d。
2.根据权利要求1所述的诱导炭疽菌产生分生孢子的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的活化培养的条件为27℃温度下。
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