CN103194421A - 一种烟草赤星病菌孢子悬浮液及其应用 - Google Patents
一种烟草赤星病菌孢子悬浮液及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种烟草赤星病菌孢子悬浮液及其应用，所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液是通过病菌分离、病菌培养、诱导产孢、制备孢子悬浮液步骤获得的。所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液应用于烟草品种抗感赤星病测定中，或防治烟草赤星病药剂、生防菌或天然产物筛选中，或研究烟草赤星病菌的土壤生态及病菌侵染循环中。本发明采用多点接种方式，培养速度快、培养周期短；利用低温高湿刺激、梯度降温、黑暗诱导等方法的综合作用促进烟草赤星病菌快速、大量的产生孢子，为常规产孢量的50~100倍。本发明方法污染小，培养菌丝、诱导产孢的时间相对固定、集中，同步生长、同步产孢，同批次、不同批次制备孢子量差异小，质量更为稳定。
Description
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种烟草赤星病菌孢子悬浮液及其应用。
背景技术
烟草赤星病（Tobacco Brown Spot）是烟叶成熟期普遍发生的叶部病害，其病原为链格孢菌（Alternaria alternata）。目前，在实验室一般采用平板培养菌丝、自然产孢后制备烟草赤星病菌孢子悬浮液，但其菌丝培养时间通常在10天以上才能长满平板，菌丝老熟、产孢量足以制备孢子悬浮液还需要继续培养5~10天，由于其培养时间长，容易造成培养基干燥，培养物污染，而且不经过诱导菌丝产孢效率低。尽管有个别研究通过紫外光诱导可加快产孢，但紫外剂量与时间难以控制，容易造成变异，也容易导致培养物污染。因此，如何更为有效的制备烟草赤星病菌孢子悬浮液是一个亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种培养快速、产孢量大、质量稳定的烟草赤星病菌孢子悬浮液，第二目的在于提供该烟草赤星病菌孢子悬浮液的应用。
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液是按以下步骤制备的：
A、病菌分离：从发病田块中采集有典型症状的烟草病叶，经过分离、纯化、致病力测定筛选出烟草赤星病菌菌种；
B、病菌培养：将菌种产生孢子的菌丝点接到培养基平板上，每个平板接种3~4点，在18h黑暗6h光照交替条件下，于27~29℃恒温培养4~6d，选择菌丝呈黑褐色、菌丝较致密的培养物用于诱导产孢；
C、诱导产孢：将符合诱导产孢条件的培养基平板密封后置于2~4℃的冰箱内黑暗诱导培养2~3d，然后转入培养箱，黑暗、梯度降温培养，历时2~3d由20℃降温至15℃；
D、制备孢子悬浮液：诱导培养完成后，使用促进孢子萌发溶液将培养基平板上的孢子和菌丝洗下，组织捣碎1~2min，使孢子与菌丝分离、孢子从孢子链断开成单孢，然后过滤除去菌丝，滤液即为赤星病菌孢子悬浮液。
本发明的第二目的是这样实现的，所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液在烟草品种抗感赤星病测定中的应用；或所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液在防治烟草赤星病药剂、生防菌或天然产物筛选中的应用；或所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液在研究烟草赤星病菌的土壤生态及病菌侵染循环中的应用。
本发明采用多点接种方式，能够较快长满平板，比常规中央平板接种方式要缩短3~4天；通常病菌在培养基平板上由于营养耗尽、菌丝老熟而激发和促进自然产孢，产孢时间比较分散，比本发明产孢时间还要延长2~3天以上。本发明缩短培养时间达5~7天，培养周期大大缩短。本发明利用低温高湿刺激、梯度程序降温、黑暗诱导等方法的综合作用促进烟草赤星病菌快速、大量的产生孢子，病菌在前期适温、短时间光照（相当于短日照）培养时，菌丝生长速度快；在2~4℃黑暗冰箱中造成低温高湿刺激，20℃到15℃梯度程序降温、黑暗诱导直接促进了老熟菌丝大量产生孢子；经测算，同样大小的培养基平板，利用本发明方法产孢量为常规产孢量的50~100倍。本发明由于接种量大、病菌前期培养菌丝生长快，诱导产孢时为密封状态，大大降低了培养物被污染的机会，从而保证了培养质量；培养菌丝、诱导产孢的时间相对固定、集中，能够达到同步生长、同步产孢，同一病菌同批次、不同批次间制备的孢子量差异小，所以质量更为稳定。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变更或改进，均属于本发明的保护范围。
本发明所述烟草赤星病菌孢子悬浮液是按以下步骤制备的：
A、病菌分离：从发病田块中采集有典型症状的烟草病叶，经过分离、纯化、致病力测定筛选出烟草赤星病菌菌种；
B、病菌培养：将菌种产生孢子的菌丝点接到培养基平板上，每个平板接种3~4点，在18h黑暗6h光照交替条件下，于27~29℃恒温培养4~6d，选择菌丝呈黑褐色、菌丝较致密的培养物用于诱导产孢；
C、诱导产孢：将符合诱导产孢条件的培养基平板密封后置于2~4℃的冰箱内黑暗诱导培养2~3d，然后转入培养箱，黑暗、梯度降温培养，历时2~3d由20℃降温至15℃（降温速率约每9.6~14.4h降温1℃）；
D、制备孢子悬浮液：诱导培养完成后，使用促进孢子萌发溶液将培养基平板上的孢子和菌丝洗下，组织捣碎1~2min，使孢子与菌丝分离、孢子从孢子链断开成单孢，然后过滤除去菌丝，滤液即为赤星病菌孢子悬浮液。
作为优选实施方式：
B步骤所述的培养基为燕麦培养基（OA）、马铃薯葡萄糖培养基（PDA）、马铃薯蔗糖培养基（PSA）、查彼培养基（Czapek’s medium）或理查培养基（Richard’s medium）。
D步骤所述的促进孢子萌发的溶液为1~2%的灭菌葡萄糖、果糖、蔗糖、蛋白胨溶液中一种或一种以上组合。或者，D步骤所述的促进孢子萌发溶液为2~5%感病品种烟草成熟的新鲜烟叶组织捣碎液，所述的组织捣碎液是经过滤灭菌的。所述的感病品种烟草为K326、云烟85或G140。
D步骤所述的组织捣碎采用的是研钵、捣碎机或研磨机。
D步骤所述的过滤为脱脂棉过滤或4~6层脱脂纱布过滤。
本发明所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液在烟草品种抗感赤星病测定中的应用，是将烟草赤星病菌孢子悬浮液调整浓度、加入分散剂作为烟草赤星病的人工接种物。
或所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液在防治烟草赤星病药剂、生防菌或天然产物筛选中的应用，调整烟草赤星病菌孢子悬浮液浓度涂布平板即可。
或所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液在研究烟草赤星病菌的土壤生态及病菌侵染循环中的应用，调整烟草赤星病菌孢子悬浮液浓度后，吸附于载体上，然后埋入或拌入土壤。
本发明的工作原理：
本发明采用多点接种方式，加快了培养进程，缩短培养周期。本发明利用低温高湿刺激、梯度程序降温、黑暗诱导等方法的综合作用促进烟草赤星病菌快速、大量的产生孢子，产孢量为常规产孢量的50~100倍。本发明由于接种量大、病菌前期培养菌丝生长快，诱导产孢时为密封状态，大大降低了培养物被污染的机会，从而保证了培养质量；培养菌丝、诱导产孢的时间相对固定、集中，能够达到同步生长、同步产孢，同一病菌同批次、不同批次间制备的孢子量差异小，所以质量更为稳定。
实施例1
从发病田块中采集有典型症状的烟草病叶，经过分离、纯化、致病力测定筛选出烟草赤星病菌菌种；将菌种产生孢子的菌丝点接到培养基平板上，每个平板接种3点，在18h黑暗6h光照交替条件下，于27℃恒温培养4d，选择菌丝呈黑褐色、菌丝较致密的培养物用于诱导产孢；将符合诱导产孢条件的培养基平板，在密封状态下置于2℃的冰箱内黑暗诱导培养2d，然转入培养箱黑暗、梯度降温培养，历时2d由20℃降温至15℃（降温速率约每9.6h降温1℃）；诱导培养完成后，以1%的灭菌葡萄糖溶液作为促进孢子萌发溶液，使用促进孢子萌发溶液将培养基平板上的孢子和菌丝洗下，以研钵组织捣碎1min，使孢子与菌丝分离、孢子从孢子链断开成单孢，然后用脱脂棉过滤过滤除去菌丝，滤液即为赤星病菌孢子悬浮液。
实施例2
从发病田块中采集有典型症状的烟草病叶，经过分离、纯化、致病力测定筛选出烟草赤星病菌菌种；将菌种产生孢子的菌丝点接到培养基平板上，每个平板接种4点，在18h黑暗6h光照交替条件下，于29℃恒温培养6d，选择菌丝呈黑褐色、菌丝较致密的培养物用于诱导产孢；将符合诱导产孢条件的培养基平板，在密封状态下置于4℃的冰箱内黑暗诱导培养3d，然转入培养箱黑暗、梯度降温培养，历时3d由20℃降温至15℃（降温速率约每14.4h降温1℃）；诱导培养完成后，以2%的灭菌果糖、蔗糖溶液作为促进孢子萌发溶液，使用促进孢子萌发溶液将培养基平板上的孢子和菌丝洗下，以捣碎机组织捣碎2min，使孢子与菌丝分离、孢子从孢子链断开成单孢，然后用6层脱脂纱布过滤除去菌丝，滤液即为赤星病菌孢子悬浮液。
实施例3
从发病田块中采集有典型症状的烟草病叶，经过分离、纯化、致病力测定筛选出烟草赤星病菌菌种；将菌种产生孢子的菌丝点接到培养基平板上，每个平板接种3点，在18h黑暗6h光照交替条件下，于28℃恒温培养5d，选择菌丝呈黑褐色、菌丝较致密的培养物用于诱导产孢；将符合诱导产孢条件的培养基平板，在密封状态下置于3℃的冰箱内黑暗诱导培养2.5d，然转入培养箱黑暗、梯度降温培养，历时2.5d由20℃降温至15℃（降温速率约每12h降温1℃）；诱导培养完成后，以1.5%的灭菌蔗糖、蛋白胨混合溶液作为促进孢子萌发溶液，使用促进孢子萌发溶液将培养基平板上的孢子和菌丝洗下，以研磨机组织捣碎1.5min，使孢子与菌丝分离、孢子从孢子链断开成单孢，然后用4层脱脂纱布过滤除去菌丝，滤液即为赤星病菌孢子悬浮液。
实施例4
从发病田块中采集有典型症状的烟草病叶，经过分离、纯化、致病力测定筛选出烟草赤星病菌菌种；将菌种产生孢子的菌丝点接到培养基平板上，每个平板接种4点，在18h黑暗6h光照交替条件下，于27℃恒温培养4d，选择菌丝呈黑褐色、菌丝较致密的培养物用于诱导产孢；将符合诱导产孢条件的培养基平板，在密封状态下置于2℃的冰箱内黑暗诱导培养3d，然转入培养箱黑暗、梯度降温培养，历时2d由20℃降温至15℃（降温速率约每9.6h降温1℃）；诱导培养完成后，以经过滤灭菌的3.5%感病品种烟草G140成熟的新鲜烟叶组织捣碎液作为促进孢子萌发溶液，使用促进孢子萌发溶液将培养基平板上的孢子和菌丝洗下，以研钵组织捣碎1min，使孢子与菌丝分离、孢子从孢子链断开成单孢，然后用5层脱脂纱布过滤除去菌丝，滤液即为赤星病菌孢子悬浮液。
实施例5
从发病田块中采集有典型症状的烟草病叶，经过分离、纯化、致病力测定筛选出烟草赤星病菌菌种；将菌种产生孢子的菌丝点接到培养基平板上，每个平板接种4点，在18h黑暗6h光照交替条件下，于29℃恒温培养6d，选择菌丝呈黑褐色、菌丝较致密的培养物用于诱导产孢；将符合诱导产孢条件的培养基平板，在密封状态下置于4℃的冰箱内黑暗诱导培养2d，然转入培养箱黑暗、梯度降温培养，历时3d由20℃降温至15℃（降温速率约每14.4h降温1℃）；诱导培养完成后，以经过滤灭菌的2%感病品种烟草K326成熟的新鲜烟叶组织捣碎液作为促进孢子萌发溶液，使用促进孢子萌发溶液将培养基平板上的孢子和菌丝洗下，以研钵、捣碎机或研磨机组织捣碎2min，使孢子与菌丝分离、孢子从孢子链断开成单孢，然后用脱脂棉过滤过滤除去菌丝，滤液即为赤星病菌孢子悬浮液。
实施例6
从发病田块中采集有典型症状的烟草病叶，经过分离、纯化、致病力测定筛选出烟草赤星病菌菌种；将菌种产生孢子的菌丝点接到培养基平板上，每个平板接种3点，在18h黑暗6h光照交替条件下，于28℃恒温培养5d，选择菌丝呈黑褐色、菌丝较致密的培养物用于诱导产孢；将符合诱导产孢条件的培养基平板，在密封状态下置于3℃的冰箱内黑暗诱导培养2.5d，然转入培养箱黑暗、梯度降温培养，历时2.5d由20℃降温至15℃（降温速率约每12h降温1℃）；诱导培养完成后，以经过滤灭菌的5%感病品种烟草云烟85成熟的新鲜烟叶组织捣碎液作为促进孢子萌发溶液，使用促进孢子萌发溶液将培养基平板上的孢子和菌丝洗下，以研钵、捣碎机或研磨机组织捣碎1.5min，使孢子与菌丝分离、孢子从孢子链断开成单孢，然后用4层脱脂纱布过滤除去菌丝，滤液即为赤星病菌孢子悬浮液。
实施例7
以赤星病菌97Aa003菌株按实施例1的方法制备烟草赤星病菌孢子悬浮液，并以该悬浮液进行品种抗性评价，具体步骤为：
1.材料与方法
1.1 材料
供试品种为NC71、NC297、云烟201、KRK26共4个品种，抗病对照品种为净叶黄，感病对照品种为G140共6个品种。
1.2方法
1.2.1 抗性测定品种的小区布置
试验处理为6个处理，每个品种为1个处理，每处理植烟30株，4次重复。小区随机排列。管理与种植同优质烤烟模式。试验用地约1.5亩。本试验在云南省烟草农业科学研究院研和试验基地进行。
1.2.2 病菌人工接种
封顶去2片脚叶后，将烟草赤星病菌孢子悬浮液用1%的葡萄糖稀释至10万个孢子/ml，按0.2%的质量比加入吐温80、过325目标准筛的硅藻土，搅拌均匀，喷雾处理中下部叶，至叶片布满均匀一层细小水珠为止，接种后在试验田中灌注水至半沟，保湿24~48h。
1.2.3 病情调查
在烟草赤星病菌接种的前一天，进行一次病情基数调查，接种后每7d调查一次病情。调查各处理的叶片，调查记载采用GB/T 23222“烟草病害分级及调查方法”中烟草赤星病害的国家标准。以发病盛期时病情指数的高低，评价抗性。
2. 结果与分析
受试验品种的抗性测定结果见表1。
表1 抗性品种的测定结果（病情基数为0）
| 品种 | 病情指数 | 抗性评价 |
| G140 | 76.28 Aa | 感病（S） |
| 净叶黄 | 14.65 Dd | 抗病（R） |
| NC71 | 51.64 Bb | 中感（MS） |
| 云烟201 | 67.48 ABab | 感病（S） |
| KRK26 | 30.87 Cc | 中抗（MR） |
| NC297 | 54.29 Bb | 中感（MS） |
按GB/T 23224的病情指数范围进行判别评价抗性，可以看出KRK26中抗，NC71、NC297中感，云烟201感病，对照品种净叶黄抗病、G140感病。
实施例8
以赤星病菌97Aa003菌株按实施例3的方法制备烟草赤星病菌孢子悬浮液，并以该悬浮液进行生防菌筛选，具体步骤为：
1. 材料与方法
1.1 材料
采用NA培养基或NB培养基培养根际芽孢杆菌，PDA培养基用于对峙培养。
1.2 方法
1.2.1 平皿拮抗初筛、复筛拮抗菌，采用点接法：初筛取稀释到1000~10000倍的200μl赤星病菌孢子悬浮液均匀涂布于PDA平板，选择5个接种点均匀点接待测细菌，在26~28℃下培养3~4d，观察有无抑菌圈；复筛时，测定同初筛，每个初筛菌株重复5次，选择抑菌圈明显、重现性好的细菌，分别以B1~Bn重新编号、保存。
1.2.2 可产生代谢活性产物拮抗菌的筛选，采用管碟法：将筛选的拮抗细菌活化后接种于NB培养基（液体），150r/m、28℃振荡培养48h，5,000r/m、4℃离心30min，去除菌体，0.22μm滤膜抽滤，滤液即为拮抗菌代谢粗提物。取稀释到1000~10000倍的200μl赤星病菌孢子悬浮液均匀涂布于PDA培养基平板，制备带病菌孢子的平板，选择5个接种点均匀放置管碟，加拮抗菌代谢粗提物20μl于杯碟中，重复5次。
2.结果与分析
试验芽孢杆菌菌株669株，初筛拮抗菌214株，复筛发现其中75株拮抗作用明显，抑菌圈直径在5mm以上。测定代谢粗提物发现，18个菌株能检测到活性，其中9个菌株的抑菌活性较强，抑菌圈直径在10mm以上（见表2）。
表2 抑菌活性较强拮抗芽孢杆菌平板上的抑菌圈尺寸
从分离、筛选根际拮抗芽孢杆菌的结果来看，粗筛率为31.89%，复筛率为11.21%。比较发现：粗筛细菌中仅约1/3的活性稳定，说明一些在原生境中具有拮抗活性的菌株在人工培养条件下逐渐失去活性；复筛细菌中，在液体培养时产生活性代谢产物的细菌占24.00%，表明固体与液体培养筛选产生活性代谢产物的细菌存在显著差异。
实施例9
以赤星病菌97Aa003菌株按实施例6的方法制备烟草赤星病菌孢子悬浮液，并以悬浮液测定不同带菌量土壤对病害发生的影响，具体步骤为：
1.材料与方法
1.1材料
采用感病烟草品种G28测定不同带菌量土壤对病害发生的影响。
1.2方法
1.2.1不同带菌量土壤的制备：将烟草赤星病菌孢子悬浮液用1%的葡萄糖稀释至103、105、107个孢子/ml，按0.2%的质量比加入吐温80、过325目标准筛的硅藻土，搅拌均匀，分别喷雾处理烤烟碎片，中耕后，按每m2撒烤烟碎片5~6g，再培土。每浓度处理烟株10株，3次重复，随机排列。除不使用杀真菌剂外，其他管理与种植同优质烤烟模式。本试验在云南省烟草农业科学研究院研和试验基地进行。
1.2.2病情调查：现蕾时进行一次病情基数调查，以后每7天调查一次病情。调查各处理的下部6片叶片，调查记载采用GB/T 23222“烟草病害分级及调查方法”中烟草赤星病害的国家标准，以发病初期的时间、病情指数评价。
2.结果与分析
不同带菌量土壤对病害发生的影响结果见表3，统计结果可见：土壤带菌量越大，发病初期越早，病情越严重。
表3 不同带菌量土壤对病害发生的影响
| 处理 | 发病初期 | 病情指数 |
| 103个孢子/ml | 7月21日 | 18.28 |
| 105个孢子/ml | 7月14日 | 34.65 |
| 107个孢子/ml | 7月7日 | 58.63 |
| 空白 | 7月21日 | 7.48 |
Claims (10)
1.一种烟草赤星病菌孢子悬浮液，其特征在于所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液是按以下步骤制备的：
A、病菌分离：从发病田块中采集有典型症状的烟草病叶，经过分离、纯化、致病力测定筛选出烟草赤星病菌菌种；
B、病菌培养：将菌种产生孢子的菌丝点接到培养基平板上，每个平板接种3~4点，在18h黑暗6h光照交替条件下，于27~29℃恒温培养4~6d，选择菌丝呈黑褐色、菌丝较致密的培养物用于诱导产孢；
C、诱导产孢：将符合诱导产孢条件的培养基平板密封后置于2~4℃的冰箱内黑暗诱导培养2~3d，然后转入培养箱，黑暗、梯度降温培养，历时2~3d由20℃降温至15℃；
D、制备孢子悬浮液：诱导培养完成后，使用促进孢子萌发溶液将培养基平板上的孢子和菌丝洗下，组织捣碎1~2min，使孢子与菌丝分离、孢子从孢子链断开成单孢，然后过滤除去菌丝，滤液即为赤星病菌孢子悬浮液。
2.根据权利要求1所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液，其特征是：B步骤所述的培养基为燕麦培养基、马铃薯葡萄糖培养基、马铃薯蔗糖培养基、查彼培养基或理查培养基。
3.根据权利要求1所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液，其特征是：D步骤所述的促进孢子萌发的溶液为1~2%的灭菌葡萄糖、果糖、蔗糖、蛋白胨溶液中一种或一种以上组合。
4.根据权利要求1所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液，其特征是：D步骤所述的促进孢子萌发溶液为2~5%感病品种烟草成熟的新鲜烟叶组织捣碎液，所述的组织捣碎液是经过滤灭菌的。
5.根据权利要求4所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液，其特征是：所述的感病品种烟草为K326、云烟85或G140。
6.根据权利要求1所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液，其特征是：D步骤所述的组织捣碎采用的是研钵、捣碎机或研磨机。
7.根据权利要求1所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液，其特征是：D步骤所述的过滤为脱脂棉过滤或4~6层脱脂纱布过滤。
8.一种权利要求1所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液在烟草品种抗感赤星病测定中的应用。
9.一种权利要求1所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液在防治烟草赤星病药剂、生防菌或天然产物筛选中的应用。
10.一种权利要求1所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液在研究烟草赤星病菌的土壤生态及病菌侵染循环中的应用。
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2013
- 2013-03-22 CN CN201310094167.4A patent/CN103194421B/zh active Active
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