CN105580642A - 一种利用连续培养过程生产牛樟芝菌体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于发酵技术领域，特别涉及一种利用连续培养过程生产牛樟芝菌体的方法。该方法在传统液体培养法的基础上，通过加入一定的载体使牛樟芝菌体生长其上，待菌体生长到一定的程度，在无菌条件下刮下菌体，更换新的培养基继续培养，以实现牛樟芝菌体的连续培养，最终利用该发明中培养方法，以孔径为2-8mm的化纤网布为菌体生长层，以孔径为2-8mm的刚性网状材料为支撑层，单次培养牛樟芝可获得菌体干重9-12g/L，连续培养5批后可获得菌体干重42-50g/L。该方法是一种利用连续培养过程获得牛樟芝菌体的新方法。

Description

一种利用连续培养过程生产牛樟芝菌体的方法
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种利用连续培养过程大量生产牛樟芝菌体的方法。
背景技术
樟芝，别名牛樟芝和牛樟菇，主要产于中国台湾地区海拔450-2000米之间的山地，生于牛樟树的心材内壁。牛樟芝含有多种生理活性物质，包括三萜类物质、杂多糖、SOD、腺苷、麦角固醇、维生素、烟碱酸、核酸凝集素、几丁质、木质素等，这些物质都具有极高的药用价值，具有保肝、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、解毒、抗炎等功效，有很好的药用价值，是一种极具开发潜力和应用前景的药用真菌，近年来成为国内外研究和开发的热点。
然而，野生牛樟芝寄主专一，牛樟树是樟芝的唯一寄主，由于牛樟树是台湾地区的特有树种且数量稀少，加上野生樟芝子实体生长极其缓慢，盗伐者更是有增无减，使得野生牛樟芝子实体市场供应严重失衡，台湾已经立法将牛樟树列为国家一级保护树种，不能随意砍伐，因此野生樟芝子实体更难取得。
许多学者以人工培养方式来改善这种状况。液体培养法能缩短牛樟芝的培养周期，已有文献报导利用液体深层培养法培养牛樟芝，研究发现液体培养的菌体中含有5种三萜类物质，夏永军等发现牛樟芝固态培养的菌体中活性产物的种类较液态培养的要丰富许多，但是由于培养方式的改变，也带来不同的合成代谢途径，使得樟芝液态培养中产生新的活性物质，这些活性物质同样具有良好的生理活性，因此牛樟芝的液态培养同样具有较大的研究意义。
由于液态培养中大量的活性物质集中于牛樟芝菌体中，因此液态培养的研究热点也在于获得牛樟芝的菌体。目前已有文献报导了通过液态培养来获得牛樟芝菌体的方法，Fan-ChiangYang等液体培养牛樟芝，利用牛樟芝丝状真菌的特性使其长成小球形态，最终通过优化培养条件最终使得液态培养牛樟芝7天，菌体干重达21.64g/L，此结果为目前实验室水平获得菌体干重最高的。目前所报导的文献中都是以此方法来实现牛樟芝的液态培养，而将牛樟芝菌体附着在载体上上生长的液态培养方法目前还没有报导。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够实现连续培养牛樟芝菌体的生产方法，在传统液体培养的基础上，利用牛樟芝丝状真菌的特性，通过加入特定载体，牛樟芝菌体能够生长其上，待菌体生长到一定程度后，无菌条件下刮下载体上的菌体，并加入新的培养基继续培养，以此继续获得新的菌体，实现牛樟芝菌体的连续培养，大大缩短了牛樟芝的培养时间，获取了更多的牛樟芝菌体。本发明为了实现上述目的采取的技术方案如下：
一种通过连续培养生产牛樟芝菌体的方法，包括如下步骤：
(1)扩大培养：利用挖块接种法，将牛樟芝菌种接种至新的固体培养基中，扩大培养；
(2)制备孢子悬液：无菌水洗下经扩大培养后的新菌落上的孢子，制备孢子悬液；
(3)制备载体：载体由菌体生长层和支撑层组成，以化纤类大孔材质为菌体生长层，以刚性网状材质为支撑层，将菌体生长层固定在支撑层上，放入液体培养基中作为培养牛樟芝菌的载体；
(4)单次培养：向放置了载体的液体培养基中接种孢子悬液，为使菌丝体均匀分布于载体上，置于180-220rpm，25-35℃的恒温摇床中培养2-4天，大量菌体均匀附着于载体上生长，无菌条件下，倒掉残留培养基，加入去离子水冲洗菌体3-4次，抽滤除去去离子水，获取菌体；
(5)连续培养：按上述步骤(4)方法培养2-4天后，无菌条件下倒掉残留培养基，刮下菌体，加入无菌水冲洗菌体3-4次，倒干无菌水，加入新的灭菌后的液体培养基，为减小培养中的离心力，加速菌体生长，连续培养过程置于110-160rpm，25-35℃的恒温摇床中培养2-4天，重复此步骤即可实现牛樟芝菌的连续培养；
(6)完成单次培养或连续培养后，获取牛樟芝菌体，烘干，测定菌体干重。
为了更好地实现本发明目的，本发明还进一步提供以下技术方案：
进一步地，所述步骤(1)中固体培养基组成为：葡萄糖10-30g/L，蛋白胨2-5g/L，麦芽浸粉10-30g/L，琼脂10-30g/L，避光培养20-25天。
进一步地，所述步骤(2)中孢子悬液中的孢子数为106-108个/mL。
进一步地，所述步骤(4)中孢子悬液的接种量为2％-6％。
进一步地，所述液体培养基的组成为：葡萄糖15-25g/L，蛋白胨5-15g/L，KH2PO40.5-1.5g/L，MgS04·7H2O0.1-0.8g/L，116℃灭菌25min。
进一步地，所述步骤(3)中菌体生长层为化纤类大孔材质，支撑层为无毒性的刚性网状材质。
更进一步地，所述菌体生长层裁剪成(10-30cm)×(3-15cm)大小的条状，所述支撑层裁剪成(15-25cm)×(3-8cm)大小的条状。
更进一步地，所述化纤类大孔材质优选涤纶大孔、锦纶大孔、腈纶大孔或丙纶大孔等材质中的至少一种。
更进一步地，所述刚性网状材质优选不锈钢、铝合金或锌合金。
更进一步地，所述化纤类大孔材质的孔径优选为2-8mm，所述刚性网状材质的孔径优选为2-8mm。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
(1)与其他培养方法相比，本发明所使用的方法将牛樟芝单次培养的培养周期缩短至2-4天；
(2)与其他培养方法相比，本发明所使用的方法更加快速有效的获得牛樟芝菌体；单次培养获得菌体干重达9-12g/L，连续培养5批最终获得菌体干重达42-50g/L。
(3)本发明所使用的连续培养的方法减少了牛樟芝培养中孢子悬液制备过程，缩减了培养工艺。
具体实施方式
下面结合具体实例进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。下述实施例中的方法，如无特殊说明，均为常规方法。本发明的范围仅由权利要求书限定。
实施例1
以250mL的三角瓶发酵为例，利用本发明中所述方法，制备牛樟芝孢子悬液。
1、牛樟芝扩大培养
利用挖块接种法，将牛樟芝菌接种至新的固体培养基中，固体培养基组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨2.5g/L，麦芽浸粉20g/L，琼脂25g/L，避光培养20-25天后，新的圆形菌落形成，直径约5cm，菌落中心呈橙色，边缘呈白色，保存于4℃备用。
2、牛樟芝孢子悬液的制备
经扩大培养后的新菌落可用于制备孢子悬液。4℃保存的菌种于室温中放置1-2h后，无菌条件下加入10mL无菌水，用玻璃棒轻轻刮下菌落表面的孢子，最终菌悬液呈浑浊的橙色，其中孢子数为106-108个/mL。
实施例2
以装液量250mL的三角瓶发酵为例，利用本发明中所述方法，单次培养牛樟芝的操作工艺如下。
1、载体制备
加入培养基的载体由两部分构成，分别是菌体生长层和支撑层。菌体生长层的材质为大孔涤纶材质，其孔径为2mm，裁剪成20cm×5cm大小的条状；支撑层为不锈钢网状材质，其孔径为2mm大小，裁剪成15cm×5cm大小的条状；将菌体生长层固定在支撑层上，放入250mL三角瓶中作为培养牛樟芝菌的载体。
2、本发明所述方法单次培养牛樟芝
将培养基加入带有载体的三角瓶中，装液量为100mL/250mL，培养基组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，KH2PO40.8g/L，MgS04·7H2O0.5g/L，116℃灭菌25min。
加入2mL按实施例1中方法制备好的牛樟芝孢子悬液，置于180rpm，25℃的恒温摇床中培养4天，菌体附着于涤纶材质的载体上生长，菌体较多，分布均匀，倒掉残留培养基，加入去离子水冲洗菌体3-4次，抽滤除去去离子水，置于一定温度下烘干菌体至恒重，测得菌体干重为12g/L。
实施例3
1、载体制备
以250mL的三角瓶发酵为例，利用本发明中所述方法，连续培养3批次牛樟芝的操作工艺如下：
加入培养基的载体中，菌体生长层的材质为大孔锦纶材质，其孔径为4mm，裁剪成10cm×3cm大小的条状；支撑层为铝合金网状材质，其孔径为5mm大小，裁剪成15cm×3cm大小的条状；将菌体生长层固定在支撑层上，放入250mL三角瓶中作为培养牛樟芝菌的载体。
2、本发明所述方法连续培养牛樟芝
将培养基加入带有载体的三角瓶中，装液量为100mL/250mL，培养基组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨5g/L，KH2PO40.5g/L，MgS04·7H2O0.1g/L，116℃灭菌25min。
加入2mL按实施例1中方法制备好的牛樟芝孢子悬液，置于185rpm，35℃的恒温摇床中培养2天，菌体附着于涤纶材质的载体上生长，菌体较多，分布均匀，倒掉残留培养基，加入去离子水冲洗菌体3-4次，倒干无菌水，加入新的灭菌后的培养基，继续置于110rpm，35℃的恒温摇床中培养2d，重复此操作2次即可实现牛樟芝菌的3批次连续培养。
收集从载体上刮下的牛樟芝菌体，去离子水冲洗3-4次，抽滤除去离子水，置于一定温度下烘干菌体至恒重，测得连续培养3批后收集菌体干重达19.77g/L。
实施例4
1、载体制备
以250mL的三角瓶发酵为例，利用本发明中所述方法，连续培养5批次牛樟芝的操作工艺如下：
加入培养基的载体中，菌体生长层的材质为大孔锦纶材质，其孔径为6mm，裁剪成25cm×6cm大小的条状；支撑层为不锈钢网状材质，其孔径为4mm大小，裁剪成25cm×6cm大小的条状；将菌体生长层固定在支撑层上，放入250mL三角瓶中作为培养牛樟芝菌的载体。
2、本发明所述方法连续培养牛樟芝
将培养基加入带有载体的三角瓶中，装液量为100mL/250mL，培养基组成为：葡萄糖18g/L，蛋白胨12g/L，KH2PO40.8g/L，MgS04·7H2O0.5g/L，116℃灭菌25min。
加入2mL按实施例1中方法制备好的牛樟芝孢子悬液，置于200rpm，28℃的恒温摇床中培养4天，菌体附着于涤纶材质的载体上生长，菌体较多，分布均匀，倒掉残留培养基，加入去离子水冲洗菌体3-4次，倒干无菌水，加入新的灭菌后的培养基，继续置于110rpm，25℃的恒温摇床中培养4d，重复此操作3次即可实现牛樟芝菌的4批次连续培养。
收集从载体上刮下的牛樟芝菌体，去离子水冲洗3-4次，抽滤除去去离子水，置于一定温度下烘干菌体至恒重，测得连续培养4批后收集菌体干重达40.6g/L。
实施例5
1、载体制备
以250mL的三角瓶发酵为例，利用本发明中所述方法，连续培养5批次牛樟芝的操作工艺如下：
加入培养基的载体中，菌体生长层的材质为大孔丙纶材质，其孔径为6mm，裁剪成25cm×5cm大小的条状；支撑层为不锈钢网状材质，其孔径为3mm大小，裁剪成25cm×5cm大小的条状；将菌体生长层固定在支撑层上，放入250mL三角瓶中作为培养牛樟芝菌的载体。
2、本发明所述方法连续培养牛樟芝
将培养基加入带有载体的三角瓶中，装液量为100mL/250mL，培养基组成为：葡萄糖18g/L，蛋白胨12g/L，KH2PO40.8g/L，MgS04·7H2O0.5g/L，116℃灭菌25min。
加入2mL按实施例1中方法制备好的牛樟芝孢子悬液，置于200rpm，32℃的恒温摇床中培养3天，菌体附着于涤纶材质的载体上生长，菌体较多，分布均匀，倒掉残留培养基，加入去离子水冲洗菌体3-4次，倒干无菌水，加入新的灭菌后的培养基，继续置于140rpm，30℃的恒温摇床中培养3d，重复此操作4次即可实现牛樟芝菌的5批次连续培养。
收集从载体上刮下的牛樟芝菌体，去离子水冲洗3-4次，抽滤除去去离子水，置于一定温度下烘干菌体至恒重，测得连续培养5批后收集菌体干重达42.3g/L。
实施例6
1、载体制备
以250mL的三角瓶发酵为例，利用本发明中所述方法，连续培养5批次牛樟芝的操作工艺如下：
加入培养基的载体中，菌体生长层的材质为大孔腈纶材质，其孔径为6mm，裁剪成25cm×10cm大小的条状；支撑层为锌合金网状材质，其孔径为5mm大小，裁剪成25cm×8cm大小的条状；将菌体生长层固定在支撑层上，放入250mL三角瓶中作为培养牛樟芝菌的载体。
2、本发明所述方法连续培养牛樟芝
将培养基加入带有载体的三角瓶中，装液量为100mL/250mL，培养基组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨15g/L，KH2PO41.0g/L，MgS04·7H2O0.8g/L，116℃灭菌25min。
加入4mL按实施例1中方法制备好的牛樟芝孢子悬液，置于200rpm，35℃的恒温摇床中培养4天，菌体附着于涤纶材质的载体上生长，菌体较多，分布均匀，倒掉残留培养基，加入去离子水冲洗菌体3-4次，倒干无菌水，加入新的灭菌后的培养基，继续置于150rpm，32℃的恒温摇床中培养4d，重复此操作4次即可实现牛樟芝菌的5批次连续培养。
收集从载体上刮下的牛樟芝菌体，去离子水冲洗3-4次，抽滤除去去离子水，置于一定温度下烘干菌体至恒重，测得连续培养5批后收集菌体干重达42g/L。
实施例7
1、载体制备
以500mL的三角瓶发酵为例，利用本发明中所述方法，连续培养5批次牛樟芝的操作工艺如下：
加入培养基的载体中，菌体生长层的材质为大孔腈纶材质，其孔径为8mm，裁剪成30cm×15cm大小的条状；支撑层为不锈钢网状材质，其孔径为8mm大小，裁剪成25cm×8cm大小的条状；将菌体生长层固定在支撑层上，放入500mL三角瓶中作为培养牛樟芝菌的载体。
2、本发明所述方法连续培养牛樟芝
将培养基加入带有载体的三角瓶中，装液量为160mL/500mL，培养基组成为：葡萄糖25g/L，蛋白胨15g/L，KH2PO41.5g/L，MgS04·7H2O0.8g/L，116℃灭菌25min。
加入6mL按实施例1中方法制备好的牛樟芝孢子悬液，置于220rpm，30℃的恒温摇床中培养4天，菌体附着于涤纶材质的载体上生长，菌体较多，分布均匀，倒掉残留培养基，加入去离子水冲洗菌体3-4次，倒干无菌水，加入新的灭菌后的培养基，继续置于160rpm，28℃的恒温摇床中培养4d，重复此操作4次即可实现牛樟芝菌的5批次连续培养。
收集从载体上刮下的牛樟芝菌体，去离子水冲洗3-4次，抽滤除去去离子水，置于一定温度下烘干菌体至恒重，测得连续培养5批后收集菌体干重达50g/L。

Claims (9)

1.一种通过连续培养生产牛樟芝菌体的方法，包括如下步骤：
(1)扩大培养：利用挖块接种法，将牛樟芝菌种接种至新的固体培养基中，扩大培养；
(2)制备孢子悬液：无菌水洗下经扩大培养后的新菌落上的孢子，制备孢子悬液；
(3)制备载体：载体由菌体生长层和支撑层组成，以化纤类大孔材质为菌体生长层，以刚性网状材质为支撑层，将菌体生长层固定在支撑层上，放入液体培养基中作为培养牛樟芝菌的载体；
(4)单次培养：向放置了载体的液体培养基中接种孢子悬液，为使菌丝体均匀分布于载体上，置于180-220rpm，25-35℃的恒温摇床中培养2-4天，大量菌体均匀附着于载体上生长，无菌条件下，倒掉残留培养基，加入去离子水冲洗菌体3-4次，抽滤除去去离子水，获取菌体；
(5)连续培养：按上述步骤(4)方法培养2-4天后，无菌条件下倒掉残留培养基，刮下菌体，加入无菌水冲洗菌体3-4次，倒干无菌水，加入新的灭菌后的液体培养基，为减小培养中的离心力，加速菌体生长，连续培养过程置于110-160rpm，25-35℃的恒温摇床中培养2-4天，重复此步骤即可实现牛樟芝菌的连续培养；
(6)完成单次培养或连续培养后，获取牛樟芝菌体，烘干，测定菌体干重。
2.如权利要求1所述的一种通过连续培养生产牛樟芝菌体的方法，其特征在于，所述步骤(1)中固体培养基组成为：葡萄糖10-30g/L，蛋白胨2-5g/L，麦芽浸粉10-30g/L，琼脂10-30g/L，避光培养20-25天。
3.如权利要求1所述的一种通过连续培养生产牛樟芝菌体的方法，其特征在于，所述步骤(2)中孢子悬液中的孢子数为106-108个/mL。
4.如权利要求1所述的一种通过连续培养生产牛樟芝菌体的方法，其特征在于，所述步骤(4)中孢子悬液的接种量为2％-6％。
5.如权利要求1所述的一种通过连续培养生产牛樟芝菌体的方法，其特征在于，所述液体培养基的组成为：葡萄糖15-25g/L，蛋白胨5-15g/L，KH2PO40.5-1.5g/L，MgS04·7H2O0.1-0.8g/L，116℃灭菌25min。
6.如权利要求1所述的一种通过连续培养生产牛樟芝菌体的方法，其特征在于，所述步骤(3)中菌体生长层裁剪成(10-30cm)×(3-15cm)大小的条状，所述支撑层裁剪成(15-25cm)×(3-8cm)大小的条状。
7.如权利要求1或6所述的一种通过连续培养生产牛樟芝菌体的方法，其特征在于，所述化纤类大孔材质的孔径为2-8mm，所述刚性网状材质的孔径为2-8mm。
8.如权利要求7所述的一种通过连续培养生产牛樟芝菌体的方法，其特征在于，所述化纤类大孔材质为涤纶大孔、锦纶大孔、腈纶大孔或丙纶大孔中的至少一种。
9.如权利要求7所述的一种通过连续培养生产牛樟芝菌体的方法，其特征在于，所述刚性网状材质为不锈钢、铝合金或锌合金。
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