CN1799562A - 一种樟芝菌丝体发酵提取物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种樟芝菌丝体发酵提取物，由乙醇提取并干燥后制得；所用菌株为樟芝(Antrodia camphorata)Ac001，已于2005年9月21日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.1460。所述的樟芝菌丝体发酵提取物在制备对HBsAg、HBeAg及HBV DNA分泌的抑制作用的药物中以及在制备抗癌药物特别是抗肝癌药物中具有广泛的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种樟芝菌丝体发酵提取物及其应用。
背景技术
樟芝(Antrodia camphorata)又称牛樟菇。一般生长在小叶黄樟树的中空心材内壁上，钟状；子实层呈桔红色、味苦。樟芝新品种菌丝体经培养后呈桔红色，肉粉色。显微镜观察，菌丝细长、有隔、具有锁状联合，并有大量的分生孢子，分生孢子因培养条件不同呈桔红色、肉粉色或黄色。
关于樟芝菌丝体培养物的粗提物或是其多糖的药理学或生物活性研究近来取得了一些进展，中国专利01123613.2《樟芝的固体培养方法，所得固体培养物及其产品与用途》；200410008046.4《来自牛樟芝菌丝体的新混合物和化合物及其用途》和200410011142.4《牛樟芝担子菌类的多糖体及其用途》均涉及了樟芝的功效及用途，但是，在所述的专利中，却未见有通过卫星搭载改良品种，以提高其药理功效的报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种樟芝菌丝体发酵提取物及其应用。
本发明涉及的樟芝菌丝体发酵提取物，由下述方法制得：
(1)取樟芝菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2～1/5；
(2)用体积百分比为60～95％的乙醇对上述浓缩的发酵液进行萃取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2～5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60～90％；
(3)50～70℃条件下，加热1～2小时；
(4)以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；
(5)将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5～1/10；
(6)用体积百分比为95％的、4～8倍乙醇浓缩液体积量的乙醇，对上述浓缩乙醇提取液进行12～24小时沉淀处理；
(7)以常规方法分离出沉淀物；
(8)将沉淀物以常规方式真空干燥或低温冷冻干燥，得樟芝菌丝体发酵提取物；
其中，所述樟芝菌丝体为CGMCCNo.1460，该菌株名为樟芝(Antrodia camphorata)Ac001，已于2005年9月21日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.1460。
上述樟芝(Antrodia camphorata)Ac001 CGMCC No.1460是通过樟芝子实体分离到的樟芝菌种，送国家航天航空部东方红宇航中心，对其进行了卫星搭载，搭载的条件为：卫星质量为2100公斤，卫星温度为5～28℃，微重力量级10-3～10-5，近地点高度200～210公里，远地点高度300～400公里，轨道周期为90分钟，航天飞行18天；在卫星搭载诱变后，经多次活化培养后获得的。
上述樟芝(Antrodia camphorata)Ac001 CGMCC No.1460的发酵培养方法是，将樟芝菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20～35℃温度，摇瓶转速为80～280r/min，pH 3～8条件下，震动培养7～15天；培养中当pH值降到2.5～4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20～35℃，发酵罐压力0.1～0.2公斤/平方厘米，pH 3～8，通气量0.5～1.1vvm，搅拌速度100～280转/分的条件，培养7～15天，即可利用樟芝菌丝体发酵全液制备取物。
其中，所述樟芝(Antrodia camphorata)Ac001 CGMCC No.1460的发酵培养方法中，培养温度最适是28～30℃，培养pH最适为6。
其中，上述樟芝菌丝体发酵全液是指菌丝体和发酵液的滤液。
其中，上述种子或发酵培养基配方以克/100毫升计是：
玉米淀粉 1％ 葡萄糖 1％
蛋白胨 0.2％ 酵母膏 0.2％
硫酸镁 0.1％ 磷酸二氢钾 0.05％
本发明所述的樟芝菌丝体发酵提取物在制备对乙型肝炎表面抗原HBsAg、e抗原HBeAg及HBV DNA分泌的抑制作用的药物中的应用。
利用本发明所述的樟芝菌丝体发酵提取物研究其抗乙型肝炎病毒的作用；实验采用乙型肝炎病毒基因转染的人肝癌细胞系2.2.15，研究其对细胞的毒性和对乙型肝炎表面抗原HBsAg、e抗原HBeAg及HBV DNA分泌的抑制效果。
实验结果表明：樟芝菌丝体发酵提取物稀释3倍，加入细胞培养8天，对细胞半数中毒浓度TC50为0.153mg/ml。最大无毒浓度TCO为0.039mg/ml。樟芝发酵液提取物最大无毒浓度0.039mg/ml对HBVDNA的抑制率为59.0％，其半数抑制浓度IC50为0.0086mg/ml，对乙型肝炎表面抗原HBsAg的抑制率为36.1％，其半数抑制浓度IC50为0.026mg/ml，而对e抗原HBeAg的抑制率为49.8％，其半数抑制浓度IC50为0.022mg/ml。
本发明所述的樟芝菌丝体发酵提取物在制备抗癌药物中的应用。
本发明所述的樟芝菌丝体发酵提取物特别在制备抗肝癌药物中的应用。
利用本发明所述的樟芝菌丝体发酵提取物进行抗肿瘤动物试验，结果表明：各计量组的樟芝菌丝体发酵提取物对S180小鼠肉瘤和H22小鼠肝癌细胞的生长均有一定抑制作用，抑瘤活性一般在30～45％之间。其中，对S180小鼠肉瘤的抑制率最高可达43.37％(1000mg/kg体重)，对H22小鼠肝癌细胞的最高抑制率可达48.88％(160mg/kg体重)。通过实验分析，该类受试药物的抑瘤活性可能是通过对免疫系统的调解而产生抑瘤作用。
附图说明
本发明所述的樟芝(Antrodia camphorata)Ac001，已于2005年9月21日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，地址：北京市中关村中国科学院微生物所内，邮政编码为100080，保藏编号为CGMCC No.1460。
图1樟芝Ac001菌株卫星搭载后电镜观察图
图2樟芝Ac001出发菌株电镜观察图
图3樟芝不同菌种菌丝体干重比较
图4樟芝不同品种液体发酵多糖含量比较
图5樟芝不同菌种酯酶(EST)同工酶谱
图6樟芝菌丝体发酵提取物多糖高效液相色谱
图7樟芝菌丝体发酵提取物糖组成分析
具体实施方式
实施例1：
将樟芝(Antrodia camphorata)通过樟芝子实体分离到的樟芝菌种，送国家航天航空部东方红宇航中心，对其进行卫星搭载，搭载的条件为：卫星质量为2100公斤，卫星温度为5～28℃，微重力量级10-3～10-5，近地点高度200～210公里，远地点高度300～400公里，轨道周期为90分钟，航天飞行18天，进行卫星搭载诱变。
樟芝菌种经卫星搭载诱变后，以常规方法对其多次活化培养后，观察形态，比较诱变前后菌株的差异。
①菌丝体形态观察
樟芝菌丝体经平板培养后，通过光镜及环境扫描电镜观察，可以观察到有初生菌丝和次生菌丝存在，初生菌丝壁薄，透明，胞径2.7μm～3.5μm；次生菌丝薄壁、透明微黄，具锁状联合，有分枝，胞径3.1μm～3.9μm；而出发菌株菌丝体宽度仅为2.4～2.7um。
②分生孢子及产孢结构形态观察
通过光镜及ESEM观察发现：樟芝菌丝体在平板培养阶段能够产生分生孢子。
樟芝菌丝体培养阶段产生的分生孢子属内生芽殖型(blastic)中的瓶梗孢子(phialospore)，这类孢子是从一个专门的瓶状产孢细胞上产生的，这个瓶状细胞称为瓶梗(phialide)。产孢细胞的外壁不形成分生孢子的壁。分生孢子淡橘红色，椭圆形，外壁光滑，胞径2.7～3.5μm×5.7～7.7μm；而出发菌株孢子大小仅为4.0～5.2um(见图1、图2)。
可见出发菌株经卫星搭载后，从菌丝形态到孢子大小都产生了较大的变异。
把卫星搭载诱变后樟芝菌株命名为樟芝(Antrodia camphorata)Ac001，送“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏编号为CGMCC No.1460。
上述樟芝Ac001菌株菌丝体培养
平板培养：将樟芝Ac001菌株菌丝体接种于平板上，置28℃培养10天。
摇瓶培养：取平板培养的樟芝菌丝体5～10块(1cm2/块)移入500ml三角瓶内，其中装有用下述培养基配方制作的液体培养基，在28℃、pH 6的条件下，置于旋转摇床上旋转培养7天，转速为110转/分钟。
所述培养基配方以克/100毫升计是：
玉米淀粉 1％ 葡萄糖 1％
蛋白胨 0.2％ 酵母膏 0.2％
硫酸镁 0.1％ 磷酸二氢钾 0.05％
发酵罐培养：
培养基同上。将上述三角瓶培养所得到的菌种接种于50L发酵罐的培养基中，在28℃、pH6、发酵罐压力0.15公斤/平方厘米，通气量以1∶1.0vvw的速率、搅拌速度200转/分钟的条件下，培养7天，即得到樟芝菌丝体发酵全液，其中包括菌丝体及过滤液。
结果：每50升发酵罐发酵完毕后可得发酵全液30～35升。其中菌丝体干重为0.3公斤。发酵全液的比重为1.02。利用樟芝菌丝体发酵全液可制备其提取物。
实施例2：樟芝搭载前与搭载后的菌株培养特性比较
(1)温度比较试验
分析试验结果表明：樟芝Ac001菌丝体的萌发温度范围为6-36℃，比出发菌株(10-32℃)温度范围扩大；樟芝Ac001菌丝体生长的适宜温度范围在24℃-32℃之间(菌落呈橘红色)，而出发菌株适宜的培养温度为28-30℃(菌落呈橘红色)。
(2)pH比较试验
经试验发现；当起始pH在pH3～pH12范围内时，樟芝Ac001菌丝体都能够生长；适宜樟芝菌丝体生长的pH范围是pH5～7；当pH＝7时，培养性状良好。
而出发菌株起始pH在pH4和pH10时菌丝体生长很弱，适宜樟芝菌丝体生长的pH范围是pH6左右。
(3)菌丝体干重比较
樟芝不同品种液体培养过程中，每天取样测其菌丝体干重，结果表明，樟芝Ac001菌株菌丝体日生长量明显高于樟芝原始种，在培养第六、七天两菌株的菌丝体干重达到最高；Ac001菌株平均干重比樟芝原始种高出22.8mg/100ml。(见图3)
(4)多糖含量比较
樟芝不同品种液体培养过程中，每天取样测其多糖含量，结果表明，Ac001菌株在培养第八天多糖含量达到最高峰，而在第十天樟芝原始种才达到高峰；从多糖含量比较看来，Ac001菌株最高可达到28.4mg/ml，樟芝原始种最高只有21.7mg/ml。(见图4)
(5)酯酶同工酶比较
采用樟芝不同品种菌丝体进行酯酶同工酶分析，结果显示，两个品种都具有四条相同的酶带，Rf值分别在0.25、0.55、0.60、0.75期间，Ac001菌株在Rf值0.375处有一条新的酶带。(见图5)
实施例3：樟芝菌丝体发酵提取物的制备
(1)取樟芝菌丝体发酵全液(菌丝体和发酵液的滤液)，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/4；
(2)用体积百分比为70％的乙醇对上述浓缩的发酵液进行萃取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的4倍；
(3)70℃条件下，加热1小时；
(4)以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；
(5)将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5；
(6)用体积百分比为95％的、5倍乙醇浓缩液体积量的乙醇，对上述浓缩乙醇提取液进行20小时沉淀处理；
(7)以常规方法分离出沉淀物；
(8)将沉淀物以常规方式真空干燥或低温冷冻干燥，得樟芝菌丝体发酵提取物。
实施例4：樟芝菌丝体发酵提取物的制备
(1)取樟芝菌丝体发酵全液(菌丝体和发酵液的滤液)，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2；
(2)用体积百分比为75％的乙醇对上述浓缩的发酵液进行萃取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的5倍；
(3)60℃条件下，加热2小时；
(4)以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；
(5)将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5；
(6)用体积百分比为95％的、7倍乙醇浓缩液体积量的乙醇，对上述浓缩乙醇提取液进行16小时沉淀处理；
(7)以常规方法分离出沉淀物；
(8)将沉淀物以常规方式真空干燥或低温冷冻干燥，得樟芝菌丝体发酵提取物。
实施例5：樟芝菌丝体发酵提取物的制备
取樟芝发酵全液30L，在浓缩罐中浓缩至原体积的1/3，接着乘热加入4倍量的80％的乙醇加热萃取，温度控计制在50℃左右，真空度为0.02公斤/平方厘米。
乙醇萃取后，接着采用真空泵将萃取液经180目的过滤器过滤，将原发酵液中的菌丝与液体分离，用纯净水反复冲洗菌丝体3次后，合并滤液，接着在浓缩器中回收萃取液中的乙醇。此时真空度控制在0.02公斤/平方厘米，温度控制在80℃左右。
乙醇回收后剩余的即为樟芝发酵全液萃取液，接着将其进行减压浓缩，浓缩罐温度为50℃，真空度为0.01公斤/平方厘米。将萃取液浓缩至原体积的1/10，比重控制在1.06.
浓缩液冷却至25℃以下时，将其放出，量其体积并置于100L不锈缸桶内，并加入95％的乙醇，加入量是浓缩液体积的6倍，室温下静置24小时。然后用移液管移出乙醇上清液，将固液分离后即可得到樟芝发酵全液乙醇提取物，随即放入真空干燥箱干燥，温度控制在50℃以下，真空度为0.02公斤/平方厘米以下。
干燥后的提取物，粉碎，过200目筛，置低温干燥处保存备用。
上述樟芝菌丝体液体发酵后活性成分的提取与分离是从发酵全液中经萃取后分离所得。
实施例6：樟芝菌丝体发酵提取物多糖分子量及糖组分测试
测试方法：
(1)纯度及分子量测定：
(2)糖组成测定：
取样品10mg溶于2mol/l三氟乙酸中，封管，在氮氧保护下100℃水解2h，水解液加甲醇后真空浓缩至干，再加甲醇如上法再反复两次，少量水溶解，分二部份，一份薄板层析检查有否糖醛酸存在，另一份用硼氢化钠还原，然后乙酰化，气相层析。
测试者：中国科学院上海药物研究所多糖实验室
测试结果：
糖组成分析(见图7)：
樟芝菌丝体发酵提取物样品含阿拉伯糖，木糖，半乳糖及葡糖糖；其摩尔比为1∶1.5∶0.4∶10.5。
样品纯度检测及分子量：
根据HPLC结果(测定条件见图6)该样品至少含五个以上组分；
其中：RT为30.38之分子量为51万
RT为34.05之分子量为7.7万
RT为38.20之分子量为1.7万
RT为38.70之分子量为1.5万
RT为42.07之分子量为0.5万
实施例7：樟芝菌丝体发酵提取物总三萜含量，总生物碱含量测定
测试者：中国科学院上海药物研究所多糖实验室
测定方法：常规方法(略)
测试结果：
总三萜含量(％) 总生物碱含量
樟芝菌丝体发酵提取物 0.32％ 0.22mg/ml
实施例8：樟芝菌丝体发酵提取物氨基酸测定
测试者：莱阳农学院中心实验室
样品处理方法：盐酸水解
分析仪器：日立835-50型高速氨基酸分析仪
测试结果：
ASP天门冬氨酸 2.13％；ILE异亮氨酸 1.54％；THR苏氨酸 1.15％；
LEU亮氨酸 1.72％；SER丝氨酸 1.27％；TYR酪氨酸 0.79％；
GLU谷氨酸 2.84％；PHE苯丙氨酸 0.97％；GLY甘氨酸 1.66％；
LYS赖氨酸 1.08％；ALA丙氨酸 1.53％；NH3氨(不计) 0.59％；
CYS胱氨酸 0.32％；HIS组氨酸 0.40％；VAL缬氨酸 1.20％；
ARG精氨酸 1.26％；MET蛋氨酸 0.61％；PRO脯氨酸 1.27％。
氨基酸总和21.74。
实施例9：应用樟芝菌丝体发酵提取物样品在乙型肝炎病毒转染的人肝癌细胞2.2.15细胞系培养中，检测其对乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)e抗原(HBeAg)分泌和HBV DNA的影响。
测试单位：中国医学科学院医药生物技术研究所
材料和方法：
一.药物：樟芝发酵液提取物是莱阳农学院药用真菌研究所提供的液体制剂，浅棕色混悬液。实验时母液4℃保存，使用时用2.2.15细胞培养液配成所需浓度。
二.2.2.15细胞：乙型肝炎病毒(HBV)DNA克隆转染人肝癌细胞(HepG2)的2.2.15细胞系，美国Mount Sinai医学中心构建，本室引进后自行传代培养。细胞用含胎牛血清10％，3％谷氨酰胺1％，G418 380pg/ml，卡那霉素50U/ml的Eagle’sMEM培养液，在37℃、5％CO2温箱中培养，大约一周传代一次。
三.试剂及仪器：HBsAg，HBeAg固相放射免疫测定盒，购自中国同位素公司北方免疫试剂研究所；放射性同位素α32P dCTP为亚辉生物医学工程公司，比活度：111TBq/nmol；探针标记用的随机引物试剂盒购自Promerga公司。
酶标仪：BIO-RAO 3550型；Y-计数仪为美国DPC公司产品。
四.实验方法：
1.药物对细胞毒性试验
药物樟芝发酵液提取物的母液，用2.2.15细胞培养液10倍稀释配成开始浓度，然后用培养液从开始3倍稀释共8个浓度，加入96孔细胞培养板，每浓度4孔，每4天换同浓度药液，设无药物细胞对照组.以观察细胞病变为指标，8天显微镜下观察细胞病变，完全破坏为4；75％为3；50％为2；25％为1；无病变为0。计算每浓度药液平均细胞病变程度和抑制％。按Reed&Muench法计算半数有毒浓度(TC50)，最大无毒浓度(TC0)
2.药物对HBeAg、HBsAg抑制试验
每毫升10万个2.2.15细胞接种96孔细胞培养板，每孔200ul，37℃5％CO2培养24小时，加无毒浓度以下3倍稀释试验药液，4个稀释度分别为最大无毒浓度及其以下3倍稀释的3个浓度，每浓度4孔，设无药物细胞对照组，37℃ 5％CO2培养，每4天换原浓度药液培养，第8天时收获培养液，-20℃冻存。一批实验同时测定HBsAg和HBeAg。实验设HBsAg、HBeAg阳性和阴性对照及细胞对照。用HBsAg和HBeAg固相放射免疫测定盒测定，方法见说明书，用γ-计数仪测定每孔cpm值，4孔平行孔取均值后计算抑制率。按Reed&Muench法计算半数有毒浓度(IC50)。
A＝log＞50％药物浓度 B＝log＜50％药物浓度 C＝log稀释倍数
3.药物对HBV DNA的抑制试验
各浓度组药液的及各对照组的2.2.15细胞上清夜和细胞按分子克隆实验技术方法提取其HBV DNA、各样品斑点杂交、放射自显影、测量各杂交点的A值后，计算抑制率。按Reed&Muench法计算半数有毒浓度(IC50)。
A＝log＞50％药物浓度B＝log＜50％药物浓度C＝log稀释倍数
4.选择指数(SI)：SI＝TC50/IC50
结果：
(1)樟芝发酵液提取物样品在2.2.15细胞培养中的细胞毒性
为观察樟芝发酵液提取物样品对乙型肝炎病毒基因转染的人肝癌2.2.15细胞的毒性，在接种2.2.15细胞后24小时加3倍稀释药液，同时设正常细胞对照。4天换一次药液，维持8天，用显微镜观察细胞病变，按公式计算半数有毒浓度(TC50)，最大无毒浓度(TC0)，做一批实验结果见表1。
表1.樟芝发酵液提取物样品在2.2.15细胞培养内的毒性
| 药物樟芝发酵液提取物 | 起始浓度3.2mg/ml | TC500.153mg/ml | TC00.039mg/ml |
注：细胞病变完全破坏为4；75％为3；50％为2；25％为1；无病变为0
(2)样品在2.2.15细胞培养中对HBeAg和HBsAg分泌的抑制作用
样品最大无毒浓度及其以下3倍稀释的3个浓度，加入2.2.15细胞中培养，第8天对HBsAg和HBeAg的抑制效果见表2和表3。
表2.樟芝发酵液提取物样品在2.2.15细胞中第8天对HBsAg的抑制作用
| 药物 | 药物浓度(mg/ml) | cpm(X±SD) | HBsAg | |
| 抑制(％) | IC50(mg/ml) | |||
| 樟芝发酵液提取物 | 0.03930.01310.00440.0015 | 67527364694510959 | 49.834.124.5- | 0.022 |
| 细胞对照 | 10570 | |||
| 阳性对照 | 62678 | |||
| 阴性对照 | 392 |
表3.樟芝发酵液提取物样品在2.2.15细胞中第8天对HBeAg的抑制作用
| 约物 | 药物浓度(mg/ml) | cpm(X±SD) | HBeAg | |
| 抑制(％) | IC50(mg/ml) | |||
| 樟芝发酵液提取物 | 0.03930.01310.00440.0015 | 2136280432145226 | 49.834.124.5- | 0.022 |
| 细胞对照 | 4255 | |||
| 阳性对照 | 55246 | |||
| 阴性对照 | 477 | |||
(3)樟芝发酵液提取物样品在2.2.15细胞培养中对HBV DNA的抑制作用
樟芝发酵液提取物样品最大无毒浓度及其以下3倍稀释的3个浓度，加入2.2.15细胞中培养8天，樟芝发酵液提取物样品对HBV DNA作用的结果见表4。
表4.樟芝发酵液提取物样品在2.2.15细胞中第8天对HBV DNA的抑制作用
| 药物 | 药物浓度(mg/ml) | OD值 | HBVDNA | |
| 抑制(％) | IC50(mg/ml) | |||
| 樟芝发酵液提取物 | 0.03930.01310.00440.0015 | 0.2110.2790.2540.335 | 58.945.750.634.8 | 0.0086 |
| 3TC 1μM细胞对照 | 0.2380.514 | 46.4 | ||
结论：
樟芝发酵液提取物样品对2.2.15细胞毒性和在2.2.15细胞培养内对HBV DNA的抑制作用的结果见表5。阳性药1μM的拉米夫定(3TC)在2.2.15细胞培养内对HBV DNA的抑制率为46。4％。樟芝发酵液提取物样品在2.2.15细胞培养内对HBeAg和HBsAg分泌的抑制作用见表6，7。
表5.樟芝发酵液提取物样品对2.2.15细胞毒性和HBV DNA的抑制作用总结表
| 药物 | 细胞毒性 | HBV DNA | ||
| TC50 | TC0 | IC50 | SI | |
| 樟芝发酵液提取物 | 0.153mg/ml | 0.039mg/ml | 0.0086mg/ml | 17.8 |
表6.樟芝发酵液提取物样品对2.2.15细胞毒性和对HBsAg的抑制作用总结表
| 药物 | 细胞毒性 | HBsAg | ||
| TC50 | TC0 | IC50 | SI | |
| 樟芝发酵液提取物 | 0.153mg/ml | 0.039mg/ml | 0.026mg/ml | 5.9 |
表7.樟芝发酵液提取物样品对2.2.15细胞毒性和对HBeAg的抑制作用总结表
| 药物 | 细胞毒性 | HBsAg | ||
| TC50 | TC0 | IC50 | SI | |
| 樟芝发酵液提取物 | 0.153mg/ml | 0.039mg/ml | 0.022mg/ml | 7.0 |
实施例10：应用樟芝菌丝体发酵提取物样品进行体内抗肿瘤活性检测：
测试单位：山东大学药学院新药药理研究所
1.材料
1.1受试样品：
樟芝菌丝体发酵提取物，为褐色粉末状，由莱阳农学院药用真菌研究所提供，干燥保存。实验时以蒸馏水制成混悬液。
呋喃氟脲嘧啶(T207)：齐鲁制药厂产品，批号：0306007。
1.2肿瘤细胞株：S180小鼠肉瘤，H22小鼠肝癌，来源于山东省医科学院药物研究所。腹水传代保存。
1.3动物：昆明种小鼠，体重19～22g，雌雄兼用，由山东大学实验动物中心提供，生产许可证：生产许可(鲁)20030004。
2.方法：
无菌抽取传代后5～7天的小鼠肿瘤腹水，经过稀释、计数后调整细胞数至2～5×106/ml(H22为1～2×107/ml)，每只小鼠右侧腹部皮下接种0.2ml。小鼠随机分组，每组10只，分别为大计量组(1000mg/kg)，中计量组(400mg/kg)，小剂量组(160mg/kg)，阳性对照组(FT207 120ml/kg)，对照组动物数14～18只。种瘤后次日给药，灌胃体积0.8ml/只，对照组给与同等体积蒸馏水。每日上午给药，连续12～15天，末次给药24h后处死小鼠，取瘤称重，计算抑瘤率。
3.结果：
以樟芝提取物，分别对S180小鼠肉瘤和H22小鼠肝癌进行不同批次抑瘤试验，总结结果。
4.结果说明：
(1)连续灌胃樟芝菌株提取物12～15天。各计量组对动物的一般状况及体重增长均明显好于阳性对照组。
(2)各计量组的樟芝菌株提取物对S180小鼠肉瘤和H22小鼠肝癌细胞的生长均有一定抑制作用，抑瘤活性一般在30～45％之间。其中，对S180小鼠肉瘤的抑制率最高可达43.37％(1000mg/kg体重)，对H22小鼠肝癌细胞的最高抑制率可达48.88％(160mg/kg体重)。通过实验分析，该类受试药物的抑瘤活性可能是通过对免疫系统的调解而产生抑瘤作用。
Claims (8)
1.一种樟芝菌丝体发酵提取物，由下述方法制得：
(1)取樟芝菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2～1/5；
(2)用体积百分比为60～95％的乙醇对上述浓缩的发酵液进行萃取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2～5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60～90％；
(3)50～70℃条件下，加热1～2小时；
(4)以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；
(5)将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5～1/10；
(6)用体积百分比为95％的、4～8倍乙醇浓缩液体积量的乙醇，对上述浓缩乙醇提取液进行12～24小时沉淀处理；
(7)以常规方法分离出沉淀物；
(8)将沉淀物以常规方式真空干燥或低温冷冻干燥，得樟芝菌丝体发酵提取物；
其中，所述樟芝菌丝体为CGMCCNo.1460，该菌株名为樟芝(Antrodia camphorata)Ac001，已于2005年9月21日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.1460。
2.如权利要求1所述的樟芝菌丝体发酵提取物，其特征是，所述樟芝(Antrodiacamphorata)Ac001 CGMCC No.1460的发酵培养方法是，将樟芝菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20～35℃温度，摇瓶转速为80～280r/min，pH 3～8条件下，震动培养7～15天；培养中当pH值降到2.5～4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20～35℃，发酵罐压力0.1～0.2公斤/平方厘米，pH 3～8，通气量0.5～1.1vvm，搅拌速度100～280转/分的条件，培养7～15天，即可利用樟芝菌丝体发酵全液制备取物。
3.如权利要求2所述的樟芝菌丝体发酵提取物，其特征是，所述樟芝(Antrodiacamphorata)Ac001 CGMCC No.1460的发酵培养方法中，培养温度是28～30℃，培养pH为6。
4.如权利要求1、2或3所述的樟芝菌丝体发酵提取物，其特征是，所述樟芝菌丝体发酵全液是指菌丝体和发酵液的滤液。
5.如权利要求2或3所述的樟芝菌丝体发酵提取物，其特征是，所述种子或发酵培养基配方以克/100毫升计是：
玉米淀粉 1％ 葡萄糖 1％
蛋白胨 0.2％ 酵母膏 0.2％
硫酸镁 0.1％ 磷酸二氢钾 0.05％。
6.权利要求1所述的樟芝菌丝体发酵提取物在制备对乙型肝炎表面抗原HBsAg、e抗原HBeAg及HBV DNA分泌的抑制作用的药物中的应用。
7.权利要求1所述的樟芝菌丝体发酵提取物在制备抗癌药物中的应用。
8.权利要求7所述的樟芝菌丝体发酵提取物在制备抗肝癌药物中的应用。
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