CN105708869B - 樟芝菌丝体活性物质及保护神经细胞的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种樟芝菌丝体活性物质及保护神经细胞的组合物。所述樟芝菌丝体活性物质在50μM的无细胞毒性浓度下，可抑制由10μM淀粉样蛋白(Amyloidβ_(25‑35))引起的细胞毒性，亦能够抑制1‑甲基‑4‑苯基吡啶(MPP⁺)造成的粒线体断裂所引起的细胞凋亡；因此本发明所述樟芝菌丝体活性物质具有预防神经退化疾病的潜力。

Description

樟芝菌丝体活性物质及保护神经细胞的组合物

技术领域

本发明涉及菌丝体活性物质，特别是涉及樟芝菌丝体活性物质及保护神经细胞的组合物。

背景技术

神经退化性疾病(Neurodegenerative Diseases)：

神经退化性疾病(neurodegenerative diseases)是一种大脑及中枢神经系统中神经元细胞逐渐失去功能的症状。脑部及脊髓是由各种神经元所构成，各自负责不同功能，例如控制运动、处理接收讯息、进行判定。而脑区中的海马回(Hippocampus)主要是负责学习与记忆的枢纽，海马回上的神经细胞受损则会导致失智及学习能力的缺陷。由于神经元的恶化或负责传递讯息的髓鞘随着时间而失去功能，都可能会造成神经退化性疾病。因为脑部和脊髓的神经细胞不易再生，只要受到损伤可能造成永久性的伤害。神经退化疾病的患者需要经过一段长时间后，症状才会逐渐出现。病患可能要经过数个月或数年才能感受到其影响。通常是在许多脑室内神经细胞死亡或是细胞功能停止，以及大量神经死亡影响脑室的功能之后，症状出现才会被注意到。其明显的特征即是：(1)某特定脑区的神经细胞缓慢渐进地死亡；(2)神经讯息传递功能丧失；(3)常好发于中老年人身上，且随着时间症状会更加严重。由于患者在发病期间会逐渐与社会隔离，再加上目前相关的医药知识匮乏不足，所以社会大众很少了解和注意。随着人口结构的老化，神经退化病患也日益增加，对家属、患者和社会大众而言，无论是经济、心里和生活形态的冲击、着实是难以估计和承担的。常见的神经退化性疾病包括帕金森氏症(Parkinson's disease)、阿兹海默症(Alzheimer's disease)以及亨丁顿氏症(Huntington's disease)等。

阿兹海默症(Alzheimer's disease)：

阿兹海默症是老年人口中最常见的神经退化性疾病，主要病变在大脑皮质(cortex)和海马回(hippocampus)的神经细胞，许多病理上出现大脑异常老年斑(senileplaque)，神经纤维纠结(neurofibrillary tangle)以及β型类淀粉(β-Amyloid)的沉积。老年斑是一种复杂的病变结构，在疾病初期是由淀粉样β型类淀粉逐渐堆积形成。它是由大约40至42个胺基酸所组成。β型类淀粉蛋白存在于身体各器官，在脑部的各区域也都有分泌。然而，单一的β型类淀粉蛋白是无害的，只有聚合的β型类淀粉蛋白才具有毒性，形成衰老斑而破坏细胞的正常运作。虽然单一的β型类淀粉蛋白在脑部各区域皆有分泌，但具有毒性的衰老斑最密集的地方是在海马回。堆积成熟的类淀粉斑块(amyloid plaques)经常围绕在许多功能不良的轴突(axons)跟树突(dendrites)周围，使的这些神经突增厚，成熟的类淀粉斑块亦能够活化微胶细胞(microglia)来帮助引起发炎反应及清除类淀粉斑块。在大脑皮质跟海马回中累积大量的老年班和类淀粉斑块病理是判断阿兹海默症状最好的标的。阿兹海默症在生理上主要的症状包括认知功能退化(例如记忆力变差，对时间、人物、地点感到混淆)、行为功能退化(例如处理日常生活的能力减退)、及精神状态退化(例如出现忧郁、妄想及异常行为等等)。目前用来治疗阿兹海默症的药物仅能延缓病人的症状，并无法治愈。

帕金森氏症(Parkinson's disease)：

另一个常见的神经退化疾病为帕金森氏症，好发于五、六十岁以上的人口，主要是肇因于一种叫做多巴胺(dopamine)化学物质的缺乏。而多巴胺是由脑干中一处叫黑质(substantia nigra)的神经细胞所制造。中脑黑质的多巴胺神经元退化无法制造足够的神经引导物质多巴胺来指挥肌肉的活动；神经元之间讯息传递必需仰赖多巴胺才能使身体的动作来的流顺，缺乏足够的多巴胺就产生各种活动障碍。表现的症状以肢体静止型颤抖、肌肉僵硬、动作迟缓、姿态不稳导致平衡失调为主。而早期症状常出现有单手规律性颤抖，动作变慢，肌肉僵硬逐渐地蔓延全身，到了末期几乎都要靠轮椅才能行动。由于帕金森氏症是由于多巴胺的缺乏导致，疾病初期并没有明显特征，到确定病例时往往都已经过五年，且目前并没有有效药物来治疗。粒线体功能丧失及氧化压力已被证实 是导致帕金森氏症的重要致病机转，而MPP⁺(1-甲基-4-苯基吡啶)是一个带正电的化合物。它是粒线体complex I的抑制剂，能够抑制粒线体中的氧化磷酸化，造成ATP耗尽及细胞死亡，因此具有毒性。在小鼠实验中，MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)能够通过血脑屏障(Blood-brainbarrier，BBB)，并被大脑中的神经胶细胞转化成MPP⁺，而MPP⁺会引起黑质的发炎反应并杀死黑质致密部中产生多巴胺的神经细胞，使动物产生类似帕金森氏症的症状。MPP⁺会在引发产生多巴胺神经细胞死亡上具有高度的选择性。它是通过一个在神经末梢中负责再吸收多巴胺的转运蛋白，多巴胺转运蛋白(dopamine transporter)在这个过程中将MPP⁺会转运至细胞中。

内质网压力(Endoplasmic Reticulum Stress)：

老化过程中，神经细胞接收到过多的氧化压力，过量氧化物的累积造成神经细胞损伤或死亡，以及神经胶质细胞异常活化或死亡，则称之为氧化神经毒性(oxidativeneurotoxicity)，而此种氧化毒性的逐渐累积便是神经退化性疾病的发生的原因。Tunicamycin(衣霉素，TM)能经由抑制蛋白质N端的醣化作用(N-linked glycoproteins)来引起大量未折叠蛋白的产生，并使细胞停留在G1期，导致内质网压力(EndoplasmicReticulumStress)。过去研究指出，内质网压力跟神经退化性疾病有相关，内质网压力是主要诱导神经细胞凋亡的路径，因此利用TM引起神经细胞压力后能当作筛选模式。

樟芝(Antrodia camphorata)：

樟芝的型态棒芝又名牛樟菇、樟菰、樟窟内菰，中国台湾有称阴阳对口菇。樟芝子实体属多年生，具有强烈冲鼻的樟树香气，此与一般灵芝类有很大的差异，其外型呈板状或钟状。板状型态者，面为橘红(黄)色，整面全有菌孔，板底层有浅黄白色的木栓质，藉此木栓质附着在牛樟树中空心材内壁上生长。钟状型态者，子实层(钟面)亦呈橘(黄)色，充满菌孔(4-5个菌孔/毫米)，内有孢子味极苦，新鲜时为橘红色，之后会成为橘褐色或褐色，钟体则呈暗绿褐色的皮壳。以显微镜观察其担孢子，其型态为平滑无色之透明微弯柱形。

野生的樟芝是生长在牛樟树干中空内壁上，因为这个特性，造成很多牛樟 树倒伏。文献记载，樟芝是在牛樟树上目前唯一发现的木材腐杉菌，病征为褐色腐朽，故为褐腐菌。但是樟芝的病原性并不强，因此牛樟树很少因此死亡。虽然樟芝对牛樟树而言是病原菌，但因樟芝价格昂贵，超过牛樟树的经济价值，因此是不是牛樟树的病原菌已经不重要了。

樟芝的培养，人工栽培的技术，仍有待努力。所以，目前仍是以深山采集的方式来获得。但是采集樟芝不是件容易的事，因为首先要寻找牛樟树的产地。常有的困难是牛樟树与冇樟，两者极为相似，不易分辨。目前最直接的方法已由藤田安二提出，冇樟干油是以黄樟油(Saforle)与十五烧醛为主，因而有沙士中黄樟素的味道，牛樟干油则以松油醇(d-terpinenol)为主，而有樟脑油的味道，藉此即可区别牛樟与冇樟；第二个困难是要从大片树林中找到有中空洞的树干才行，此相当不易。空洞中若有樟芝，则可定期采集。由于找寻中空洞的牛樟树干不易，不肖商人干脆将牛樟树砍倒，以期日后能长出樟芝，进而收集贩卖。因此，为环保及经济上的考虑，发展人工栽培樟芝是首要进行的方向。可惜的是人工栽培樟芝技术一直无法突破。樟芝在牛樟木屑上生长极为缓慢，甚至停滞。因此，若能改以现代生物技术，来培养樟芝菌丝体，将是最经济、最符合环保的人工培育法。

过去研究发现樟芝子实体甲醇萃取物能保护大鼠的大脑皮质细胞(primarycortical neuron culture)免于由淀粉样蛋白(Amyloidβ_(25-35))引起的神经毒性，但是由于樟芝子实体的取得不易、样品的来源也不固定，且容易随培养用的椴木基质改变而影响其有效成分的组成，亦容易受到来源不明椴木造成的污染，而增加食用上的风险。

因此现有的樟芝的培养存在如下缺点：

1、樟芝为一寄于牛樟木的生物种，牛樟木属于保育类一级木树种，且空心的牛樟木不易取得；

2、用来培养樟芝的椴木基质来源较不固定，且基质改变亦影响其有效成分的组成。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种樟芝菌丝体活性物质及其组合物。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种樟芝菌丝体活性物质，由如下步骤制备得到：

发酵:樟芝菌丝体于28℃下发酵12天，以形成菌丝体发酵液；

冷冻干燥:将所述菌丝体发酵液冷冻干燥，以形成菌丝体冻干粉；

萃取:将所述菌丝体冻干粉以其10-30倍体积的有机溶剂萃取，其中所述萃取是以10-250rpm于15-25℃震荡萃取24小时，以形成上清液；

浓缩干燥:将所述上清液减压浓缩至干燥，最后得所述樟芝菌丝体活性物质。

在其中一个实施例中，所述樟芝菌丝体为寄存于财团法人食品工业发展研究所，登录号码:CCRC 35396的樟芝菌丝体。

在其中一个实施例中，所述有机溶剂为甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)或乙酸乙酯(ethyl ethanoate,EA)。

在其中一个实施例中，所述樟芝菌丝体活性物质是用以拮抗淀粉样蛋白(Amyloidβ_(25-35))引起的细胞毒性。

在其中一个实施例中，所述樟芝菌丝体活性物质是用以拮抗1-甲基-4-苯基吡啶(MPP⁺)引起的细胞毒性。

本发明的另一目的在提供一种保护神经细胞的组合物，所述组合物包含上述樟芝菌丝体活性物质，以及药学上可接受的载体。

在其中一个实施例中，所述组合物是用以拮抗Amyloidβ_(25-35)引起的细胞毒性。

在其中一个实施例中，所述组合物是用以拮抗MPP⁺引起的细胞毒性。

本发明所述的所有科学性及技术性用语，除非另有定义，否则皆为本领域技术人员可通晓的定义。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明所述樟芝菌丝体活性物质，采用液态培养菌丝体的方法，经验证具有抑制神经毒性之功效，且液态培养菌丝体能固定培养基质的组成分，大大降低污染的风险。

附图说明

图1为芝麻素(Sesamin)的化合物结构。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。

实施例1

(一)有机体的来源

本发明所使用的菌株A.camphorataCCRC-35396是购买自财团法人食品工业发展研究所。

(二)有机体的发酵

将CCRC-35396菌株接种到1L的培养基(medium)(1.0％葡萄糖，0.5％黄豆粉状物，0.5％消化蛋白质，0.01％MgSO₄，0.01％去沫剂(KM-72antifoam)，pH4.0)于2-L Hinton烧瓶中，在28℃下旋转振荡十天。培养出的樟芝菌丝体，于无菌室中转移到内含120L上述培养基的200-L酦酵器，在28℃下发酵十二天。

(三)有机体的萃取

将发酵完所得的菌丝体发酵液进行冷冻干燥，冷冻干燥后的菌丝体冻干粉以其10-30倍体积的100％乙醇萃取，并以摇瓶进行震荡萃取，以10-250rpm于15-25℃震荡萃取24小时，可重复萃取数次，上清液减压浓缩至干燥，得樟芝菌丝体活性物质，并以适当溶剂回溶并定量至适当浓度，置于4℃保存备用。

另外，亦可以其它有机溶剂，如水、甲醇、乙酸乙酯、正己烷等，进行萃取，取菌丝体发酵液进行冷冻干燥，冷冻干燥后的菌丝体冻干粉以10-30倍体积 的有机溶剂萃取，并以摇瓶进行震荡萃取，以10-250rpm于15-25℃震荡萃取24小时，可重复萃取数次，上清液减压浓缩至干燥，得樟芝菌丝体活性物质，并以适当溶剂回溶并定量至适当浓度，置于4℃保存备用。

将上述樟芝菌丝体活性物质以乙酸乙脂与水进行分液萃取，将乙酸乙脂层抽取液减压浓缩除去溶剂后，残余的乙酸乙脂层抽出物吸附于硅胶(silica gel)并干燥后，以硅胶管柱层析作初步分离，依序以正己烷-乙酸乙酯(95:5→0:100)冲提，共得10个分划。属于正己烷-乙酸乙酯(80:20)冲提得到的部分，以硅胶及Sephadex LH-20管柱层析作进一步分离，得到化合物，芝麻素(Sesamin)(图1)。

实施例2

实施例1所述樟芝菌丝体活性物质的神经细胞毒性损伤及保护神经细胞分析。

1、拮抗Amyloidβ_(25-35)引起的大脑皮质神经细胞(primary cortical neuron)毒性

取出生一天的Sprague-Dawley大鼠的大脑皮质(primary brain cortex)，利用0.5mg/ml木瓜酵素(papain)将皮质组织打碎并过滤后铺设在前一天先利用多聚赖氨酸溶液(poly-l-lysine)覆层的24孔平底组织培养盘上，密度为5000cells/ml-well；六天后，每个细胞适当的贴覆其上；最后这些细胞再以检测样品(实施例1所述樟芝菌丝体活性物质)来测试。检测样品利用二甲基亚砜(DMSO)作为溶剂，分别溶解在浓度为10、20、40和50mM的DMSO中。培养基(medium)中DMSO的浓度维持在不大于1μl/ml，以确保它不会影响到cortical neuron细胞的生长；在以检测样品处理细胞两小时后，以10μM淀粉样蛋白(Amyloidβ(_25-35))加入神经细胞；两天后，移走培养基并加入300μl/well的MTT溶液(浓度为0.5mg/ml)；将细胞放入37℃，5％CO₂的培养箱中反应1小时后，移去24-well培养基的混合液；最后加入200μl/well的DMSO到细胞中，并以分光比色计(ELISA reader)，于600nm吸光波长下，测定吸光值来获得实验结果；而和 DMSO溶剂控制组比较可计算其存活率百分比(％)，存活率百分比＝[样品的吸光值(600nm)/DMSO的吸光值(600nm)]×100。

如表1所示，在含有10μM Amyloidβ_(25-35)的对照组的皮质神经细胞，细胞存活率为53.53±0.21％；而在神经细胞先以20μ/ml樟芝菌丝体活性物质处理两小时的实验组存活率则升高为61.65±0.50％，存活率比对照组高8％。在乙酸乙酯分液的实验组(樟芝-乙酸乙酯组)中亦能使存活率增加7％。进一步纯化萃取出的化合物Sesamin在10μM浓度下，存活率比对照组高10％，而在50μM浓度下，存活率甚至比对照组高15％。(*p value<0.05，t-test)

表1 樟芝菌丝体活性物质对淀粉样蛋白引起大脑皮质神经细胞毒性的存活率分析

2.拮抗MPP⁺引起的NG108-15细胞株毒性

将NG108-15的细胞株铺设在密度为2×10⁴cells/ml-well的96孔平底组织培养盘；24小时后，每个细胞适当的贴覆其上；最后这些细胞再以检测样品(樟芝菌丝体活性物质)来测试。检测样品利用二甲基亚砜(DMSO)作为溶剂，分别溶解在浓度为20和40mM的DMSO中。培养基(medium)中DMSO的浓度维持在不大于1μl/ml，以确保它不会影响到NG108-15细胞的生长；在以检测样品处理细胞2天后，分别以浓度20、40、60、80μM MPP⁺(1-甲基-4-苯基吡啶)处理NG108-15细胞；四天后，移走培养基并加入100μl/well的MTT溶液(浓度为0.5mg/ml)；将细胞放入37℃，5％CO₂的培养箱中培养1小时后，移去96-well培养基的混合液；最后加入30μl/well的DMSO到细胞中，并以分光比色计 (ELISA reader)，于570nm吸光波长下，测定吸光值来获得实验结果；而和DMSO溶剂控制组比较可计算其存活率百分比(％)，存活率百分比＝[样品的吸光值(570nm)/DMSO的吸光值(570nm)]×100。

在细胞存活率的数据中显示(表2)，在樟芝-乙酸乙酯的实验组中，对低浓度20μMMPP⁺造成的细胞毒性，其存活率为明显由66.19％增加到87.61％；而在高浓度MPP⁺的毒性下则没有显著差异；而樟芝菌丝体活性物质的实验组中，对不同浓度MPP⁺引起的细胞毒性都有明显保护的效果，在20μM MPP⁺浓度下可使存活率增加23％，40μM MPP⁺浓度下可使存活率增加20％。(*p value<0.05，**p value<0.01，t-test)

表2 樟芝活性物质对MPP⁺引起NG108-15细胞株毒性的存活率分析

本发明所述樟芝活性物质，是用天然药用真菌发酵而成，故相较于化学药物，除更具安全性，亦具有治疗及改善神经退化疾病的潜力。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种樟芝菌丝体活性物质，其特征在于，由如下步骤制备得到：

(a)发酵:樟芝菌丝体于28℃下发酵12天，以形成菌丝体发酵液；

(b)冷冻干燥:将所述菌丝体发酵液冷冻干燥，以形成菌丝体冻干粉；

(c)萃取:将所述菌丝体冻干粉以其10-30倍体积的乙醇萃取，其中所述萃取是以10-250rpm于15-25℃震荡萃取24小时，以形成上清液；

(d)浓缩干燥:将所述上清液减压浓缩至干燥，得所述樟芝菌丝体活性物质；

所述樟芝菌丝体为寄存于财团法人食品工业发展研究所，登录号码:CCRC 35396的樟芝菌丝体。

2.一种保护神经细胞的组合物，其特征在于，包含如权利要求1所述的樟芝菌丝体活性物质，以及药学上可接受的载体。

3.权利要求1所述樟芝菌丝体活性物质或权利要求2所述的组合物在制备具有保护神经细胞的功效的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述保护神经细胞是指拮抗淀粉样蛋白引起的细胞毒性。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述保护神经细胞是指拮抗Amyloidβ_(25-35)引起的大脑皮质神经细胞毒性。

6.权利要求3所述的应用，其特征在于，所述保护神经细胞是指拮抗1-甲基-4-苯基吡啶引起的细胞毒性。

7.权利要求6所述的应用，其特征在于，所述保护神经细胞是指拮抗1-甲基-4-苯基吡啶引起的NG108-15细胞毒性。

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