KR101420135B1 - 학습 장애, 기억력 장애 또는 치매의 예방 또는 치료용 두충 추출물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 학습 장애, 기억력 장애 또는 치매의 예방 또는 치료용, 또는 학습 또는 기억력 증진용 두충 조추출물 또는 그의 분획층을 제공한다. 또한, 본 발명은 두충피 조추출물 또는 그의 분획층을 유효성분으로 포함하는, 학습 장애, 기억력 장애 또는 치매의 예방 또는 치료용, 또는 학습 또는 기억력 증진용 약학 조성물 또는 학습 또는 기억력 증진용 기능성 식품을 제공한다.
기억력, 학습, 치매, 두충

Description

학습 장애, 기억력 장애 또는 치매의 예방 또는 치료용 두충 추출물{Extract of Eucommiae ulmoides for preventing or treating of learning or memory disorder, or dementia}
본 발명은 학습 장애, 기억력 장애 또는 치매의 예방 또는 치료용, 또는 학습 또는 기억력 증진용 두충 조추출물 또는 그의 분획층에 관한 것이다. 또한 본 발명은 두충 조추출물 또는 그의 분획층을 유효성분으로 포함하는, 학습 장애, 기억력 장애 또는 치매의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 또는 학습 또는 기억력 증진용 약학 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 두충 조추출물 또는 그의 분획층을 유효성분으로 포함하는, 학습 또는 기억력 증진용 기능성 식품에 관한 것이다.
기억이란 주위환경으로부터 얻은 새로운 정보나 학습된 경험, 지식을 습득하여 이를 뇌의 특정부위에 부호화하여 저장하고 이를 다시 회상하는 과정을 말한다 (William F Ganong; Ganong's 생리학, 서울, 한우리, p289, p291-292, 1999). 기억의 과정은 습득, 부호화, 강화, 유지, 회상의 여러 단계로 구분된다.
현대사회는 복잡하고 전문화되는 추세이며 그에 따라 많은 정보량과 학습량이 요구되므로 효과적인 두뇌활동이 필요하게 된다. 또한 많은 사람들이 노화 및 질병에 의한 기억력의 감퇴로 고통받고 있으며 인간의 수명이 연장되어 감에 따라고도의 정신활동이 요구되고 있다. 이러한 상황에 적절히 대처하기 위하여 두뇌를 맑게 하고 기억력을 증진시켜 정신활동을 필요로 하는 등의 노력이 다양하게 시도되고 있고, 이러한 기능을 효과적으로 증진시킬 수 있는 의약품, 기능성 식품 등의 개발이 당업계에 요구되고 있다.
치매는 크게 알츠하이머형 치매와 혈관성 치매로 나뉘는데, 알츠하이머형 치매는 서구에서 많이 관찰되는 치매의 형태로 뇌의 특정 부위에 아밀로이드베타가 축적되어 콜린성 뉴런이 파괴되어 나타나는 병이다. 혈관성 치매는 고혈압, 뇌졸중, 고지혈증 등으로 인해 뇌로 가는 혈관의 이상으로 허혈 상태가 발생하여 해마 및 변연계통의 신경이 사멸하여 나타나는 치매로 서구에서보다는 동양에서 많이 나타나기 때문에 연구가 미미한 실정이다. 이들 두 치매의 원인은 다르나 결과적으로 기억력 전달 신경물질로 알려진 아세틸콜린의 작용을 감소시켜 기억력 손상을 가져온다는 부분에서는 동일한 기전을 갖는다.
4급 아민구조를 갖는 아세틸콜린은 신경전달물질이며 아세틸콜린에스테라제는 아세틸콜린을 가수분해하여 콜린으로 만든다. 치매 환자의 경우 신경전달물질인 아세틸콜린의 농도가 저하되며, 아세틸콜린에스테라제를 억제할 경우 뇌의 아세틸콜린의 농도가 상승하여 치매환자의 증상이 개선되는 것이 보고되었다.
FDA의 승인을 받아 치매치료제로 개발되어 사용되고 있는 의약품으로는 타크린(tacrine), 도네페질(donepezil), 갈란타민(galanthamine), 리바스티그 민(rivastigmine) 네 가지가 있는데 이들은 모두 아세틸콜린에스테라제 억제제이다.　　　
두충피(Eucommiae Cortex.)는 두충나무(Eucommiae ulmoides Oliver, Eucommiaceae)의 수피를 지칭하는 생약이며 두충엽은(Eucommiae Folium)은 두충나무(Eucommiae ulmoides Oliver, Eucommiaceae)의 가지에 달린 잎을 말한다.　두충나무는 낙엽성 교목으로 높이 10m에 달하며, 잎은 타원형이고 끝이 뾰족하며 고르지 않은 톱니가 있다. 꽃은 4~5월경 엷은 녹색으로 피며 자웅이주로서 수꽃은 적갈색이며 6~10개의 짧은 수술이 있고, 암꽃은 짧은 자루에 1개씩 붙는다 (육창수, 원색 한국약용식물도감, 데미서적, 서울, pp. 134, 1989). 우리나라의 중남부에서 재배되나 중국이 원산지이며 중국 남부에서 대량 재배되고 있다. 식용 및 약용으로는 주로 수피가 사용되며, 잎은 식용으로 사용가능하다. 두충의 효능으로는 강장, 요통, 관절통, 관절염, 진정, 이뇨 등이 알려져 있다 (김재길, 원색 천연약물대사전, 남산당, 서울, pp. 439, 1984). 두충의 성분에 관한 연구로는 오쿠빈(aucubin), 하르파기드 아세테이트(harpagide acetate), 아주고시드(ajugoside), 렙토시드(reptoside), 유코미올(eucommiol), 울모시드(ulmoside), 유코미오시드 I(eucommioside I), 제니포시드산(geniposidic acid), 제니포시드(geniposide) 및 4-데옥시유코미올(4-deoxyeucommiol) 등의 이리도이드(iridoid) 유도체와 메디오레시놀 디-O-β-D-글루코피라노시드(medioresinol di-O-β-D-glucopyranoside), 올리빌 디-O-β-글루코피라노시드(olivil di-O-β-glucopyranoside), 피노레시놀 디-O-β-글루코피라노시드(pinoresinol di-O-β-glucopyranoside), 유코민 A(eucommin A), 리리오덴드린(liriodendrin), 시린가레시놀 디-O-β-글루코피라노시드(syringaresinol di-O-β-glucopyranoside) 등의 리그닌(lignin) 배당체가 주성분으로 보고된 바 있고 (Bianco, A. et al., Gazz. Chim. Ital. pp. 17-20, 1978; Deyama, T. et al., Chem. Pharm. Bull, pp. 4933-4938, 1986; Gewali, M. et al., Shoyakugaku Zasshi . pp. 247-248, 1988; Hattori, M. et al., Shoyakugaku Zasshi. pp. 76-80, 1988; Takeshi, D. et al., Chem . Pharm . Bull . pp. 2993-2997, 1983; Takeshi, D. et al., Chem . Pharm . Bull . pp. 3651-3657, 1985; Takeshi, D. et al., Chem . Pharm . Bull . pp. 523-527, 1986; Takeshi D. et al., Chem Pharm . Bull . pp. 1785-1789, 1987), 활성에 관해서는 피노레시놀-디-O-β-D-글루코피라노시드(pinoresinol-di-O-β-D-glucopyranoside)의 혈압강하작용 (Shi O. et al., J. Am. Chem. Soc. pp. 5412-5413, 1976), 제니포시드산(geniposidic acid)와 오쿠빈(aucubin)의 콜라겐(collagen) 합성 증진작용 (Yanmei L. et al., Biol. Pharm . Bull . pp. 1306-1310, 1998), 제니포시드(geniposide)의 저혈당작용 (Toshihiro M. et al., Biol . Pharm . Bull . pp. 160-161, 1996) 및 간보호작용 (Chang H. M. et al., World Scientific Publ. Co., Singapore, pp. 221, 1985) 등이 보고된 바 있다.　
따라서 이에 본 발명자들은, 두충 조추출물 및 그의 분획층의 효과를 알아보기 위해, 기억력 감퇴 동물모델을 이용한 학습 및 기억력 증진, 개선 실험 및 아세틸콜린에스테라제 억제 실험을 통하여 본 발명의 조추출물, 극성용매 및 비극성용매 가용추출물이 기억력을 증진 및 개선시키고, 아세틸콜린에스테라제 억제 효과를 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명자들은 안전성이 확보된 천연물에 대하여 광범위한 연구를 수행한 결과, 두충피와 두충엽 추출물이 기억력 증진 효과 및 치매를 유발하는 베타 아밀로이드 억제 효과를 통한 치매의 예방 또는 치료 효과를 갖는다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 학습 장애, 기억력 장애 또는 치매의 예방 또는 치료용, 또는 학습 또는 기억력 증진용 두충 조추출물 또는 그의 분획층을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 두충 조추출물 또는 그의 분획층을 유효성분으로 포함하는,　학습 장애, 기억력 장애 또는 치매의 예방 또는 치료용, 또는 학습 또는 기억력 증진용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 두충 조추출물 또는 그의 분획층을 유효성분으로 포함하는, 학습 또는 기억력 증진용 기능성 식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 학습장애, 기억력 장애 또는 치매 질환의 예방 또는 치료용, 또는 학습 또는 기억력 증진용 두충 조추출물 또는 그의 분획층이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, 두충 조추출물 또는 그의 분획층을 유효성분으로 포함하는, 학습 장애, 기억력 장애, 또는 치매의 예방 또는 치료용 약학 조 성물이 제공되며, 약학 조성물에는 약제학적으로 허용되는 담체가 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, 두충 조추출물 또는 그의 분획층은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 50 중량%의 비율로 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, 두충 조추출물 또는 그의 분획층을 유효성분으로 포함하는, 학습 또는 기억력 증진용 기능성 식품이 제공되며, 기능성 식품에는 통상의 식품첨가제가 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, 두충 조추출물 또는 그의 분획층은 기능성 식품의 총 중량에 대하여 0.01 내지 95 중량%의 비율로 포함될 수 있다.
본 명세서에서, "학습(learning)" 이라 함은 자신의 행동을 지각하고 변화시킬 수 있는 능력 또는 행동을 말하며, 공간지각력, 인지력, 집중력 등을 포함한다.
"학습 장애(learning disorder 혹은 learning disability)"라 함은 지능 지수와 관계없이 다양한 원인, 예를 들어 우울증, 불안증, 강박증, 사회환경적 요인(가정불화, 빈곤, 결손가정, 스트레스) 등에 의해 "학습" 능력이 정상인에 비해 낮아진 상태를 말하며, 공간지각력 저하, 인지력 저하, 집중력 저하, 아동 등의 학업 성취도 저하 등을 포함한다.
"기억" 또는 "기억력" 이라 함은 주위 환경으로부터 얻은 새로운 정보나 학습된 경험, 지식을 습득하여 뇌의 특정부위에 부호화하여 저장하고 이를 다시 회상할 수 있는 능력을 말한다.
"기억력 장애(memory disorder 혹은 memory deficiency)" 라 함은 외상, 주 의력 결핍, 노화, 질병 등의 다양한 원인에 의하여 상기 "기억력"이 정상인에 비해낮아진 상태를 말하며, 건망증(amnesia), 집중력 장애, 공간지각력 손실, 학습능력의 둔화, 인지력 상실 등을 포함한다.
상기 조추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 및 이들의 혼합용매로부터 선택된 극성용매, 바람직하게는 물에 가용한 추출물을 포함한다.
또한, 본 발명은 두충의 조추출물로부터 비극성용매 또는 극성용매 가용추출물을 포함하고 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 뇌신경계 관련 기억력 증진과 건망증의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 비극성용매 가용추출물은 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 클로로포름, 헥산, 아세톤, 디클로로메탄 또는 사염화탄소로부터 선택된 비극성 용매, 바람직하게는 에틸아세테이트에 가용한 추출물을 포함한다.
또한, 본 발명은 두충의 극성용매 가용추출물을 포함하고 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 뇌신경계 관련 기억력 증진과 건망증의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 극성용매 가용추출물은, 상기 조추출물로부터 비극성용매 가용부를 제외한 추출물로서, 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 및 이들의 혼합용매로부터 선택된 극성용매, 바람직하게는 물 또는 저급알코올, 좀더 바람직하게는 부탄올에 가용한 추출물을 포함한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 두충 추출물은 음건하여 세절한 뿌리부위를 그 중량의 약 1 내지 10배, 바람직하게는 약 2 내지 5배 부피의 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10, 바람직하게는 1:0.2 내지 1:3의 혼합비를 갖는 혼합용매로 20 내지 100℃, 바람직하게는 30 내지 70℃의 추출 온도에서 약 1 시간 내지 2일, 바람직하게는 2 시간 내지 1일 동안 열수 추출, 환류냉각 추출, 초음파 추출 등의 추출방법, 바람직하게는 초음파 추출의 추출방법으로 1회 내지 5회, 바람직하게는 2회 내지 3회 반복하여 추출물을 수득한 후, 감압여과하고 여과한 추출물을 혼합하여 회전진공농축기로 20 내지 100℃, 바람직하게는 50 내지 70℃에서 감압 농축하여 용매를 제거하여 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매에 따른 가용추출물인 조추출물을 얻을 수 있다.
또한, 비극성 용매 가용추출물은 상기 조추출물을 물에 현탁한 후 이들 현탁액의 약 1 내지 10배, 바람직하게는 약 1 내지 5배 부피의 에틸아세테이트를 가하여 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 4회 분획하여 에틸아세테이트 가용성 분획부와 수가용성 분획부로 분리한 후 각각의 용매 분획부를 회전 진공 농축기로 감압농축하여 용매를 제거하여 각각의 추출물을 얻을 수 있다.
또한, 극성용매 가용추출물은 비극성 용매 가용성분 추출과정을 거친 수가용성 분획부에 약 1 내지 10배, 바람직하게는 약 1 내지 5배 부피의 부탄올을 가하여 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 4회 분획하여 부탄올 가용성 분획부와 수가용성 분획부를 수득할 수 있으며, 용매 분획부를 회전 진공 농축기로 감압농축시켜 용매를 제거하여 각각의 추출물을 얻을 수 있다.
또한, 비극성 용매 가용추출물 및 극성용매 가용 추출물은 상기 추출분리 공 정 이외에도, 인체에 유해한 유기용매로부터의 노출을 방지하기 위하여, 직접 상기의 조추출물에 이온교환 크로마토그래피(Ion Exchange Chromatography)법을 수행할 수 있고, 상기 방법에서, 정지상으로 사용한 충진제는 SP207, HP20SS 또는 HP 20을 사용할 수 있으나, HP 20 충진제를 사용하는 것이 바람직하며, 이동상 용매로는 먼저, 극성이 가장 큰 물을 이동시킨 후, 순차적으로 극성이 낮은 용매로 치환시키는 단계를 수행하는데, 예를 들어 물, 물:메탄올 혼합용매, 메탄올 또는 추가적으로 좀더 비극성 용매인 아세톤 등의 용매로 전환시키는 단계를 통하여 각 전개용매에 따라 유출된 분획물을 수득할 수 있다.
또한 본 발명은 기억력 증진 및 건망증 개선 효능을 갖는 두충의 조추출물로부터 상기한 바와 같은 추출분리 공정을 통한 비극성 용매 가용추출물 및 극성용매 가용 추출물을 포함하고 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 뇌신경계 관련 기억력 증진과 건망증의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 상기 제조방법에 따라 얻어진 두충 조추출물, 비극성용매 가용추출물 또는 극성용매 가용추출물을 포함한다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 % 중량으로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하여 약학 조성물로 제제화될 수 있으며, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화될 수 있다.
상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한다. 또한, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 포함한다. 경구용 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 포함할 수 있으며, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등을 포함할 수 있다. 경구용 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 포함하며, 물, 리퀴드 파라핀 등의 희석제, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 비경구용 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제를 포함하며, 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르류 등을 포함한다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학조성물에 함유되는 두충 조추출물 또는 그의 분획층의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 두충 조추출물과 그 의 분획층은 1일 0.01 내지 500 mg/kg으로, 바람직하게는 10 내지 100 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 두충 조추출물과 그의 분획층을 0.001 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 50 중량%의 비율로 포함할 수 있다.
본 발명은 두충 조추출물과 그의 분획층 및 유효성분으로 포함하는, 학습 장애, 기억력 장애, 또는 치매의 예방 또는 치료보조용 식품 조성물 및 학습 또는 기억력 증진용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 기능성 식품은 건강기능식품으로서 사용될 수 있다. "건강기능식품"이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 기능성 식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, "식품 첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안정청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품 첨가물 공전"에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰 로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.
본 발명의 기능성 식품은 학습 또는 기억력 증진을 목적으로, 조성물 총 중량에 대하여 두충 조추출물과 그의 분획층을 0.01 내지 95 %, 바람직하게는 1 내지 80 % 중량백분율로 포함할 수 있다. 또한, 학습 또는 기억력 증진을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
예를 들어, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 두충 조추출물과 그의 분획층을 부형제, 결합제, 붕해제, 및 다른 첨가제와의 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축성형할 수 있다. 또한, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수 있으며, 필요에 따라 적당한 제피제로 제피할 수도 있다.
캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질캅셀제는 통상의 경질캅셀에 두충 조추출물과 그의 분획층을 부형제 등의 첨가제와의 혼합물 또는 그의 입상물 또는 제피한 입상물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질캅셀제는 두충 조추출물과 그의 분획층 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물을 젤라틴 등 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 두충 조추출물과 그의 분획층을 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 성형하여 제조할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 적당한 제피제로 제피를, 또는 전분, 탈크 또는 적당한 물질로 환의 를 입힐 수도 있다.
과립형태의 건강기능식품은 상기 두충 조추출물과 그의 분획층을 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
본원 발명의 상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다 (대한약전 해설편, 문성사, 한국약학대학협의회, 제 5 개정판, p33-48, 1989).
두충피 또는 두충엽 조추출물 또는 그 분획물을 투여한 경우, 아세틸콜린에스테라제를 현저히 억제하는 효과 및 우수한 자유라디컬 소거능을 나타냈고, 두충피 또는 두충엽 조추출물을 투여한 경우 스코폴아민에 의해 유도된 건망증에 대하여 현저히 증가된 학습 및/또는 기억력을 나타냈으며, 전기 충격에 의한 체재시간 측정 시험에서 두충피 및 두충엽 조추출물을 투여한 마우스가 현저히 우수한 학습 또는 기억력 증진 효과를 나타내는 등, 본 발명의 두충 조추출물 및 그의 분획층은 학습 장애, 기억력 장애 및 치매의 예방 또는 치료에 효과를 나타냈으며, 또한 학습 또는 기억력을 증진시키는 것이 새롭게 발견되었다.
이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 시험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 두충피 및 두충엽 조추출물의 제조
건조된 두충피(Eucommiae Cortex) 및 두충엽(Eucommiae Floium)를 사용하였다 (경동시장 (Seoul, Korea)에서 구입). 건조된 두충피(Eucommiae Cortex) 및 두충엽(Eucommiae Floium)을 완전히 건조시킨 후 각각 분쇄하여 두충피 및 두충엽 각1kg을 물에 넣고 끓여서 추출한 후, 이를 여과지(Whatman사, 미국)로 여과한 다음 이를 감압농축기(EYELA사, N-1000, 일본)로 감압농축하고, 동결 건조하여 각각 100g, 150g 중량의 두충피 및 두충엽의 조추출물을 수득하였다.
실시예 2. 두충피의 에틸아세테이트 가용추출물의 제조
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 두충피 1kg 에서 얻은 두충피 조추출물 2L를 에틸아세테이트(EtOAc) 2L로 3회에 걸쳐 분획하였으며 에틸아세테이트 가용 추출물 5g을 수득하였다.
실시예 3. 두충피의 부탄올 가용추출물의 제조
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 두충피 1kg 에서 얻은 두충피 조추출물 2L를 부탄올(BuOH) 2L에 3회에 걸쳐 분획하여 부탄올 가용 추출물 20g을 수득하였다.
실시예 4. 두충피의 물 가용추출물의 제조
상기 실시예 3에서 얻은 두충피 부탄올 가용추출물을 분획을 하고 난 물층을 농축하여 물 가용추출물 170g을 수득하였다. 두충엽의 에틸아세테이트, 부탄올, 및 물 가용추출물도 상기와 같은 방법으로 수득하였으며, 상기 두충피 및 두충엽 추출물들은 열수 처리하여 감압 농축하여 추출물로 제조되었다 (경희대학교에서 제공).
참고예 1. 실험에 사용된 약물 및 시약, 실험동물 및 통계처리방법
스코폴아민, 베타아밀로이드(25-35) 및 아세틸티오콜린 아이오다이드 그리고 DTNB는 시그마사 (Sigma-Aldrich Chemistry Co.)에서 구입하여 사용하였으며, 두충피 그리고 두충엽은 경동시장 (Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다.
6주령의 ICR계 수컷 마우스(25 - 30 g)를 대한바이오링크 LTD (음성, 대한민국)에서 공급받아 성균관대학교 약학대학의 동물사육실에서 1주일 이상 사육하여 적응시켜 사용하였으며, 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 하였고, 온도 (23 ± 2 ℃), 습도 (55 ± 10 %) 및 명암주기 (12 시간)는 자동으로 조절되도록 하였다.
모든 실험 결과는 ANOVA(two 그리고 one way analysis of variance)를 이용하여 통계처리하였고, 유의성이 검증될 경우 Newman-keul 및 Dunnett를 사용하여 p<0.05 수준 이하에서 유의성 검정을 실시하였다.
　　　　　　　실시예 5. 두충피 조추출물, 그 분획물의 아세틸콜린에스테라제 억제 효과
　　　　　　　마우스의 전뇌를 균질기(homogenizer)를 이용하여 균일하게 갈아준 뒤, 0.1M, pH 7.4 인산화용액에 2 mg/mL로 희석하여 효소시료로서 사용한다. 두충피 조추출물, 부탄올 추출물, 물 가용추출물 및 에틸아세테이트 가용추출물을 각각 5.5, 27.5, 55, 110, 220 및 440 ㎍/mL의 농도가 되게 인산화용액에 충분히 희석시킨 뒤, 2.6 mL의 인산화용액에 1.5 mL의 시료를 넣고, 75 mM 아세틸티오콜린 아이오다이드 20 ㎕ 및 엘만(Ellman) 시약 100㎕를 넣고 30분동안 실온에서 반응시킨 후 효소시료 400㎕를 넣고 412nm에서 측정하였다. 측정된 흡광도 값은 다음 수학식을 이 용하여 억제능을 계산하였다.
억제능(%) = [1-(시험군 O.D. - 시험군 blank O.D.)/(대조군 O.D - 대조군 blank O.D.)]×100
시험 결과는 도 1에 도시된 바와 같다.
두충피 조추출물, 두충피 부탄올 추출물, 두충피 물 가용 추출물 및 두충피 에틸아세테이트 가용추출물의 아세틸콜린에스테라제 억제능은 모두 용량의존적으로 증가하였으며, 각각 45 % 이상, 54 % 이상,　45% 이상, 및 100% 이상의 아세틸콜린에스테라제 억제능을 나타냈다.
　　　　　　　실시예 6. 두충피 조추출물, 그 분획물의 자유라디컬 소거능 실험
　　　　　　　DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, Sigma D9132)을 0.1mM로　99.5% 에탄올에 용해시켜 만든다. 두충피 조추출물, 부탄올 추출물, 및 물 가용추출물을 에탄올에 5, 10, 25, 50, 100 및 200 μg/mL의 농도로, 에틸아세테이트 가용추출물을 에탄올에 0.1, 1, 2.5, 5, 10 및 20 μg/mL의 농도로 희석하였다. 시료 200㎕에 DPPH 1.8 mL을 넣고 10초동안 충분히 섞어준 뒤 상온에서 30분 동안 반응시켰으며, 혼합물의 흡광도를 517nm에서 측정하였다.
다음 수학식을 이용하여 억제능을 계산하였으며, 시험 결과는 도2에 도시한 바와 같다.
억제능(%) = [(대조군 O.D.- 시험군 O.D.)/대조군 O.D.]×100
두충피 조추출물, 부탄올 가용추출물, 물 가용추출물 및 에틸아세테이트 가용추출물의 자유라디컬 소거능은 용량의존적으로 증가하였으며, 각 추출물은 각각 81% 이상, 100% 이상, 39% 이상 및 100% 이상의 자유라디컬 소거능을 나타냈다.
실시예 7. 두충피 조추출물의 Y-미로실험에서 작업기억력 증진 효과
마우스를 각 군당 10 마리씩 4 군으로 나누었다. 제1군은 증류수 투여군, 제2군, 제3군 및 제4군은 각각 두충피 조추출물 5, 10 및 25 mg/kg 투여군으로 하였다.
두충피 조추출물을 증류수에 용해시켜 5, 10 및 25 mg/kg의 용량으로 마우스에 경구투여하고, 1시간 후에 마우스를 Y-미로에 넣어 A, B 그리고 C 각 가지에 마우스가 자유롭게 각 가지에 들어가는 것을 측정하였다. 이때 새로운 각 가지에 들어가면 1점을 주게 되며(실제변경), 교차행동에 대한 % 수학식은 다음과 같다.
교차행동 % = (실제변경) / (각가지에 들어간 총횟수 - 2) × 10
시험 결과는 도 3과 같다.
대조군의 마우스는 시험일에 52% 교차행동을 나타내었으며, 두충피 5 mg/kg 투여군은 58%를 나타내어 교차행동을 6% 증가시켰으며, 10 mg/kg 투여군은 60%를 나타내어 마우스의 교차행동을 8% 증가시켰으며 한편 25 mg/kg 투여군은 63%를 나타내어 교차행동을 11% 증가시키는 것으로 나타나, 두충피 투여군 마우스의 경우, 작업기억력이 현저히 증가되는 효과를 나타냈다.
실시예 8. 두충피 조추출물의 수동회피실험에서 학습 및 기억력 증진 효과
마우스를 각 군당 20 마리씩 4 군으로 나누었다. 제1군은 증류수 투여군, 제2군, 제3군 및 제4군은 각각 두충피 조추출물 5, 10 및 25 mg/kg 투여군으로 하였다.
두충피 조추출물을 증류수에 용해시켜 5, 10 및 25 mg/kg의 용량으로 마우스에 경구투여하고, 1시간 후에 마우스를 스텝-스루(step-through) 장치에 넣어 어두운 상자로 들어가면 0.15 mA (2 초)의 전기 충격을 가하여 학습(training)시켰다. 24 시간 후에 마우스를 다시 밝은 상자에 넣어 검은 상자에 들어가기까지의 체재시간을 측정하여 학습 및 기억력의 지표로 하였다. 이때 마우스의 컷-오프 시간(cut-off time)은 300초로 하여 대조군과 비교하였다. 시험 결과는 도 4와 같다.
대조군의 마우스는 시험일에 30초의 체재시간을 나타내었으며, 두충피 5 mg/kg 투여군은 44초를 나타내어 체재시간을 14초 증가시켰으며, 10 mg/kg 투여군은 86초를 나타내어 마우스의 체재시간을 56초 증가시켰으며(p<0.01) 한편 25 mg/kg 투여군은 55초를 나타내어 체제시간을 25초 증가시켰다. 따라서 마우스의 학습 및 기억력을 현저히 증가시켰다.
실시예 9. 두충피 조추출물의 Y-미로실험에서 스코폴아민 유도 건망증 작업기억력개선 효과
마우스를 각 군당 8 마리씩 5 군으로 나누었다. 제1군(대조군)은 증류수 투여군, 제2군은 식염수 및 스콜폴아민 투여군, 제3군 내지 제5군은 각각 두충피 5, 10, 25 mg/kg 및 스코폴아민 투여군으로 하였다.
두충피 조추출물을 증류수에 용해시켜 5, 10, 20 mg/kg의 용량으로 마우스에 경구투여하고, 30분 후에 스코폴아민 0.25 mg/kg을 피하주사 하였다. 1시간 후에 마우스를 Y-미로에 넣어 A, B 그리고 C 각 가지에 마우스가 자유롭게 각 가지에 들어가는 것을 측정하였다. 이때 새로운 각 가지에 들어가면 1점을 주게 되며(실제변 경), 교차행동에 대한 % 수학식은 다음과 같다.
교차행동 % = (실제변경) / (각가지에 들어간 총횟수 - 2) × 10
시험 결과는 도 5과 같다.
대조군은 59%를 나타내어 공간기억력이 유지되고 있으나 스코폴아민 투여 대조군은 시험일에 45% 교차행동을 나타내어 건망증이 현저히 유도되었으며(p<0.05), 두충피 조추출물 5mg/kg 투여군은 48%를 나타내어 교차행동을 3% 증가시켰으며, 10 mg/kg 투여군은 60%를 나타내어 마우스의 교차행동을 15% 증가시켰다(p<0.05). 25 mg/kg 투여군은 46%를 나타내어 마우스의 교차행동을 1% 증가시켰다. 따라서 두충피의 투여는 저하된 마우스의 작업기억력을 현저히 증가시켰다.
실시예 10. 두충피 조추출물의 수동회피실험에서 스코폴아민 유도 건망증
개선 효과
마우스를 각 군당 12 마리씩 5 군으로 나누었다. 제1군(대조군)은 증류수 투여군, 제2군은 식염수 및 스콜폴아민 투여군, 제3군 내지 제5군은 각각 두충피 5, 10, 25 mg/kg 및 스코폴아민 투여군으로 하였다.
두충피 조추출물을 증류수에 용해시켜 5, 10, 20 mg/kg의 용량으로 마우스에 경구투여하고, 30분 후에 스코폴아민 0.25 mg/kg을 피하주사 하였다. 30분 후에 마우스를 스텝-스루(step-through) 장치에 넣어 어두운 상자로 들어가면 0.4 mA (2 초)의 전기 충격을 가하여 학습(training)시켰다. 24 시간 후에 마우스를 다시 밝은 상자에 넣어 검은 상자에 들어가기까지의 체재시간을 측정하여 스코폴아민 유도 건망증에 대한 학습 및 기억력의 지표로 하였다. 이때 마우스의 컷-오프 시간(cut- off time)은 300초로 하여 대조군과 비교하였다. 시험 결과는 도 6와 같다.
대조군은 134초를 나타내어 기억력이 유지되고 있으나 스코폴아민 투여 대조군은 시험일에 33초의 체재시간을 나타내어 건망증이 현저히 유도되었으며(p<0.001), 두충피 조추출물 5mg/kg 투여군은 67초를 나타내어 체재시간이 34초 증가하였고(p<0.05), 10 mg/kg 투여군은 95초를 나타내어 마우스의 체재시간이 62초 증가하였으며(p<0.001). 25 mg/kg 투여군은 76초를 나타내어 마우스의 체재시간이 43초 증가하는 것으로 나타났다(p<0.05). 따라서 두충피 조추출물을 투여함으로써 저하된 마우스의 학습 및 기억력을 현저히 증가시킬 수 있음을 알 수 있다.
실시예 11. 두충피 조추출물의 수중미로실험에서 스코폴아민 유도 건망증 개선 효과
마우스를 각 군당 6 마리씩 5 군으로 나누었다. 제1군(대조군)은 증류수 투여군, 제2군은 식염수 및 스콜폴아민 투여군, 제3군 내지 제5군은 각각 두충피 5, 10, 25 mg/kg 및 스코폴아민 투여군으로 하였다. 지름 100 cm, 높이 45 cm인 원형 풀밖 벽에 각각 별, 네모, 세모, 원의 네가지 표지를 벽에 붙이고 지름 4.5cm, 높이 14.5 cm의 플랫폼 (platform)을 두었다. 플랫폼보다 0.5 cm 윗부분까지 물을 채우고, (수온 21 ± 1 ℃), 식용색소를 이용하여 물을 흐리게 하여 수면에서 플랫폼이 보이지 않게 하였다. 마우스를 동일한 위치에서 머리가 수조벽면을 향하게 한 후 입수시켜 플랫폼까지 찾아가는데 걸리는 탈출시간을 기록하였으며, 이때 마우스의 컷-오프 시간(cut-off time)은 120초이다. 15분후 마우스를 다시 입수시켜 다시 플랫폼을 찾아가는데 걸리는 탈출시간을 기록하여, 대조군과 비교하였다. 시험 결 과는 도 7과 같다.
대조군의 마우스는 시험일에 48초의 탈출시간을 나타냈고, 스코폴아민 투여 대조군은 83초의 탈출시간을 나타내어 건망증이 현저히 유도되었다(p<0.05). 두충피 5 mg/kg 투여군은 62초를 나타내어 탈출시간이 21초 감소하였고, 10 mg/kg 투여군은 52초를 나타내어 마우스의 탈출시간이 31초 감소하였으며 한편 25 mg/kg 투여군은 46초를 나타내어 탈출시간이 38초 감소되는 것으로 나타났다. 두충피가 마우스의 학습 및 기억력을 현저히 증가시킴을 알 수 있다.
실시예 12. 두충피 조추출물의 Y-미로실험에서 베타아밀로이드 유도 치매 작업기억력개선 효과
마우스를 각 군당 10 마리씩 5 군으로 나누었다. 제1군(대조군)은 증류수 투여군, 제2군은 증류수 및 베타아밀로이드 투여군, 제3군 내지 제5군은 각각 두충피 5, 10, 20 mg/kg 및 베타아밀로이드 군으로 하였다.
베타아밀로이드는 수동회피 실험 7일전에 37℃에서 4일동안 인큐베이션 된 베타아밀로이드를 6 nmol의 농도로 마우스 뇌의 좌측 뇌간에 2.5mm 깊이로 5㎕를 주사하였고, 매일 두충피 조추출물을 증류수에 용해시켜 5, 10, 20 mg/kg의 용량으로 마우스에 경구투여하고, 1시간 후에 마우스를 Y-미로에 넣어 A, B 그리고 C 각 가지에 마우스가 자유롭게 각 가지에 들어가는 것을 측정하였다. 이때 새로운 각 가지에 들어가면 1점을 주게 되며(실제변경), 교차행동에 대한 % 수학식은 다음과 같다.
교차행동 % = (실제변경) / (각가지에 들어간 총횟수 - 2) × 10
시험 결과는 도 8와 같다.
대조군은 67%를 나타내어 공간기억력이 유지되고 있으나 베타아밀로이드 투여 대조군은 시험일에 57% 교차행동을 나타내어 건망증이 현저히 유도되었다(p<0.01). 두충피 조추출물 5mg/kg 투여군은 69% 교차행동을 나타내어 교차행동이 12% 증가하였고, 10 mg/kg 투여군은 67%를 나타내어 마우스의 교차행동이 10% 증가하였으며(p<0.05), 25 mg/kg 투여군은 69%를 나타내어 마우스의 교차행동이 12% 증가하는 것으로 나타났다. 따라서 두충피의 투여는 저하된 마우스의 작업기억력을 현저히 증가시킴을 알 수 있다.
실시예 13. 두충피 조추출물의 수동회피실험에서 베타 아밀로이드　유도 치매 개선 효과
마우스를 각 군당 10 마리씩 5 군으로 나누었다. 제1군(대조군)은 증류수 투여군, 제2군은 증류수 및 베타아밀로이드 투여군, 제3군 내지 제5군은 각각 두충피 5, 10, 20 mg/kg 및 베타아밀로이드 투여군으로 하였다.
베타아밀로이드는 수동회피 실험 8일전에 37℃에서 4일동안 인큐베이션 된 베타아밀로이드를 6nmol의 농도로 마우스 뇌의 좌측 뇌간에 2.5mm 깊이로 5㎕를 주사하였고, 매일 두충피 조추출물을 증류수에 용해시켜 5, 10, 20 mg/kg의 용량으로 마우스에 경구투여 하였다. 1시간 후에 마우스를 스텝-스루(step-through) 장치에 넣어 어두운 상자로 들어가면 0.6 mA (3 초)의 전기 충격을 가하여 학습(training)시켰다. 24 시간 후에 마우스를 다시 밝은 상자에 넣어 검은 상자에 들어가기까지의 체재시간을 측정하여 베타아밀로이드 유도 치매에 대한 학습 및 기억력의 지표 로 하였다. 이때 마우스의 컷-오프 시간(cut-off time)은 300초로 하여 대조군과 비교하였다. 시험 결과는 도 9과 같다.
대조군은 192초를 나타내어 기억력이 유지되고 있으나, 베타아밀로이드 투여 대조군은 시험일에 36초의 체재시간을 나타내어 건망증이 현저히 유도되었다(p<0.001). 두충피 조추출물 5mg/kg 투여군은 55초를 나타내어 체재시간이 19초 증가하였고, 10 mg/kg 투여군은 132초를 나타내어 마우스의 체재시간이 96초 증가하였으며(p<0.05), 20 mg/kg 투여군은 67초를 나타내어 마우스의 체재시간이 12초 증가하는 것으로 나타났다. 따라서 두충피의 투여는 저하된 마우스의 학습 및 기억력을 현저히 증가시킴을 알 수 있다.
실시예 14. 두충피 조추출물의 수중미로실험에서 베타아밀로이드 유도 치매 개선 효과
마우스를 각 군당 10 마리씩 5 군으로 나누었다. 제1군(대조군)은 증류수 투여군, 제2군은 증류수 및 베타아밀로이드 투여군, 제3군 내지 제5군은 각각 두충피 5, 10, 20 mg/kg 및 베타아밀로이드 투여군으로 하였다.
베타아밀로이드는 수동회피 실험 9일전에 37℃에서 4일동안 인큐베이션 된 베타아밀로이드를 6 nmol의 농도로 마우스 뇌의 좌측 뇌간에 2.5mm 깊이로 5㎕를 주사하였고, 매일 두충피 조추출물을 증류수에 용해시켜 5, 10, 20 mg/kg의 용량으로 마우스에 경구투여 하였다. 지름 100 cm, 높이 45 cm인 원형 풀밖 벽에 각각 별, 네모, 세모, 원의 네가지 표지를 벽에 붙이고 지름 4.5cm, 높이 14.5 cm의 플랫폼 (platform)을 두었다. 플랫폼보다 0.5 cm 윗부분까지 물을 채우고, (수온 21 ± 1 ℃), 식용색소를 이용하여 물을 흐리게 하여 수면에서 플랫폼이 보이지 않게 하였다. 마우스를 동일한 위치에서 머리가 수조벽면을 향하게 한 후 입수시켜 플랫폼까지 찾아가는데 걸리는 탈출시간을 기록하였으며, 이때 마우스의 컷-오프 시간(cut-off time)은 120초이다. 15분 후 마우스를 다시 입수시켜 다시 플랫폼을 찾아가는데 걸리는 탈출시간을 기록하여, 대조군과 비교하였다. 시험 결과는 도 10과 같다.
대조군의 마우스는 시험일에 48초의 탈출시간을 나타냈고, 베타아밀로이드 투여 대조군은 94초의 탈출시간을 나타내어 치매가 현저히 유도되었으며(p<0.05), 두충피 5 mg/kg 투여군은 69초를 나타내어 탈출시간을 25초 감소시켰고 (p<0.05), 10 mg/kg 투여군은 60초를 나타내어 마우스의 탈출시간을 34초 감소시켰으며 한편 20 mg/kg 투여군은 59초를 나타내어 탈출시간을 35초 감소시켰다(P<0.05). 따라서 두충피의 투여는 마우스의 학습 및 기억력을 현저히 증가시킴을 알 수 있다. 또한, 수중미로가 끝나는 14일째에 목표구획에서 머무른 시간을 측정하였으며, 그 결과 대조군의 마우스는 18초동안 머물렀고, 베타아밀로이드 투여 대조군은 13초동안 머물러 치매가 현저히 유도되었으며 (P<0.05), 두충피 5 mg/kg 투여군은 19초를 나타내어 머무른 시간을 6초 증가시켰고 (p<0.01), 10 mg/kg 투여군은 20초를 나타내어 마우스의 머무른 시간을 7초 증가시켰으며 (p<0.01) 한편 20 mg/kg 투여군은 19초를 나타내어 머무른 시간을 6초 증가시켰고, (P<0.01) 각 군의 수영속도에는 유의적인 변화가 없었다. 따라서 두충피의 투여로 인하여 마우스의 학습 및 기억력이 현저히 증가됨을 알 수 있다. 　　　　
실시예 15. 두충피 조추출물의 베타아밀로이드 유도 치매 아세틸콜린에스테라제 억제 효과
마우스를 각 군당 10 마리씩 5 군으로 나누었다. 제1군(대조군)은 증류수 투여군, 제2군은 증류수 및 베타아밀로이드 투여군, 제3군 내지 제5군은 각각 두충피 5, 10, 20 mg/kg 및 베타아밀로이드 투여군으로 하였다.
베타아밀로이드는 수동회피 실험 6일전에 37℃에서 4일동안 인큐베이션 된 베타아밀로이드를 6 nmol의 농도로 마우스 뇌의 좌측 뇌간에 2.5mm 깊이로 5㎕를 주사하였고, 매일 두충피 조추출물을 증류수에 용해시켜 5, 10, 20 mg/kg의 용량으로 마우스에 경구투여 하였다. 1시간 후 마우스의 전뇌피질과 해마를 적출하여 pH 7.4의 0.1mM의 인산화용액 200㎕에　균질화했으며, 10,000g에서 10분동안 원심분리를 하여 상층액을 시료로서 사용하였다. 인산화용액 1mL에 Ellman 시약 100㎕, 아세틸티오콜린 아이오다이드 28㎕를 넣고 마지막으로 시료 8㎕를 넣은뒤 20분간 상온에서 반응시켜 412nm의 흡광도에서 억제효과를 측정하였으며, 실험결과는 도 11과 같다.
아세틸콜린에스테라제 억제 효과 실험에서 전뇌피질과 해마 대조군은 각각 1.237 그리고 1.243의 아세틸콜린에스테라제 억제능을 나타냈으며, 베타아밀로이드 대조군은 1.337 그리고 1.337로, 아세틸콜린에스테라제가 대조군의 마우스보다 0.1 그리고 0.094로 유의적으로 증가하였다 (p<0.001). 두충피 5 mg/kg 투여군은 1.26 그리고 1.297를 나타내어 억제를 0.077 및 (p<0.001) 0.04 감소시켰고, 10 mg/kg 투여군은 1.243 그리고 1.237를 나타내어 마우스의 아세틸콜린에스테라제 억제를 0.094 및 0.1 감소시켰으며 (p<0.001), 한편 20 mg/kg 투여군은 1.273 그리고 1.253을 나타내 아세틸콜린에스테라제 억제를 0.064 그리고 0.084 감소시켰다 (P<0.001). 두충피 투여는 마우스의 아세틸콜린에스테라제를 현저히 억제시키는 것으로 나타났다.
실시예 16. 두충피 조추출물의 수동회피실험에서 뇌허혈성 　유도 치매 개선 효과
마우스를 각 군당 10 마리씩 5 군으로 나누었다. 제1군(대조군)은 증류수 투여군, 제2군은 증류수 및 경동맥 결찰군, 제3군 내지 제5군은 각각 두충피 5, 10, 20 mg/kg 및 경동맥 결찰군으로 하였다.
마우스를 1.0% 이소플루란으로 마취시킨 뒤, 양 경동맥을 신경과 조직으로부터 조심스럽게 분리하였다. 마우스는 뇌동맥류 경부 결찰 클립을 이용하여 양경동맥을 15분 동안 결찰한 뒤 재관류시키고, 상기 방법과 같은 수술을 실시하되 양 경동맥 결찰의 과정을 겪지 않은 군을 샴 (Sham)군이라 명하였다. 수술 후 한 시간 뒤에 6일동안 두충피 조추출물을 증류수에 용해시켜 5, 10, 25 mg/kg의 용량으로 마우스에 경구투여 하였다. 7일 뒤 1시간 후에 마우스를 스텝-스루(step-through) 장치에 넣어 어두운 상자로 들어가면 0.5 mA (3 초)의 전기 충격을 가하여 학습(training)시켰다. 24 시간 후에 마우스를 다시 밝은 상자에 넣어 검은 상자에 들어가기까지의 체재 시간을 측정하여 베타아밀로이드 유도 치매에 대한 학습 및 기억력의 지표로 하였다. 이때 마우스의 컷-오프 시간(cut-off time)은 300초로 하여 대조군과 비교하였다. 시험 결과는 도 12과 같다.
대조군은 244초를 나타내어 기억력이 유지되고 있으나 경동맥 결찰 대조군은 시험일에 88초의 체재시간을 나타내어 치매가 현저히 유도되었으며 (p<0.01), 두충피 조추출물 5mg/kg 투여군은 98초를 나타내어 체재시간을 10초 증가시켰고, 10 mg/kg 투여군은 141초를 나타내어 마우스의 체재시간을 53초로 증가시켰다. 25 mg/kg 투여군은 211초를 나타내어 마우스의 체재시간을 123초 증가시켰다 (p<0.05). 따라서 두충피의 투여로 저하된 마우스의 학습 및 기억력이 현저히 증가됨을 알 수 있다.
실시예 17. 두충피 조추출물의 뇌신경보호 효과
마우스를 각 군당 10 마리씩 5 군으로 나누었다. 제1군(대조군)은 증류수 투여군, 제2군은 증류수 및 경동맥 결찰군, 제3군 내지 제5군은 각각 두충피 5, 10, 20 mg/kg 및 경동맥 결찰군으로 하였다.
8일째 수동회피 실험이 끝난 뒤 펜토바비탈 60 mg/kg으로 마취를 시켰고, 0.4% 파라포름알데하이드를 함유하고 있는 0.1M, pH 7.4의 인산화용액으로 심장을 혈류를 통해서 관류시켰다. 마우스의 뇌를 적출하여 0.4% 포름알데하이드가 함유된 0.05M의 인산화용액에 밤새 고정시킨후 4℃에서 30% 자당용액에 침전시켰다. 침전된 뇌는 급속냉동실에서 뇌절편을 만들기 전까지 보관하였으며, 뇌절편 시료는 50㎛로 잘랐다. 젤라틴으로 코팅된 슬라이드에 뇌절편을 고정한 후, 0.5%의 크레실 바이올렛 시약으로 염색을 하였으며, 70, 80, 90 그리고 100%의 에탄올에 두 번 반복하여 탈수시켰으며, 자일렌에 놓은 후 히스토마운트 시약을 사용하여 덮었다.
뇌절편 시료는 현미경을 통하여 살아있는 세포를 계산하였으며, 뚜렷하게 검 은색으로 염색된 세포는 죽은 세포로 간주하여 계산에서 배제하였다. 시험 결과는 도 13과 같다.
대조 샴군은 141의 세포생존 갯수를 나타냈으며, 동맥결찰군은 53개로 치매가 현저히 유도되었다 (p<0.05). 두충피 조추출물 5mg/kg 투여군은 55개를 나타내어 생존세포 갯수를 2개 증가시켰으며, 10 mg/kg 투여군은 74개를 나타내어 21개 증가시켰다. 25 mg/kg 투여군은 106개를 나타내어 생존세포 갯수를 53개 증가시켰다 (p<0.05). 따라서 두충피는 뇌허혈성 치매가 유도된 마우스의 뇌 보호 효과가 현저함을 알 수 있다.
실시예 18. 두충엽 조추출물의 Y-미로실험에서 작업기억력 증진 효과
마우스를 각 군당 8 마리씩 2 군으로 나누었다. 제1군은 증류수 투여군, 제2군은 각각 두충엽 조추출물 100 mg/kg 투여군으로 하였다. 두충엽 조추출물을 증류수에 용해시켜 100 mg/kg의 용량으로 마우스에 경구투여하고, 1시간 후에 마우스를 Y-미로에 넣어 A, B 그리고 C 각 가지에 마우스가 자유롭게 각 가지에 들어가는 것을 측정하였다. 이때 새로운 각 가지에 들어가면 1점을 주게 되며(실제변경), 교차행동에 대한 % 수학식은 다음과 같다.
교차행동 % = (실제변경) / (각가지에 들어간 총횟수 - 2) × 10
시험 결과는 도 14와 같다.
대조군의 마우스는 시험일에 48%의 교차행동을 나타내었으며, 두충엽 100 mg/kg 투여군은 59%를 나타내어 교차행동을 11% 증가시켰다. 따라서 두충엽은 마우스의 작업기억력을 현저히 증가시키는 효과가 있음을 알 수 있다.
실시예 19. 두충엽 조추출물의 수동회피실험에서 학습 및 기억력 증진 효과
마우스를 각 군당 8 마리씩 3 군으로 나누었다. 제1군은 증류수 투여군, 제2군 및 제3군은 각각 두충엽 조추출물 100 그리고 200 mg/kg 투여군으로 하였다. 두충엽 조추출물을 증류수에 용해시켜 100 및 200 mg/kg의 용량으로 마우스에 경구투여하고, 1시간 후에 마우스를 스텝-스루(step-through) 장치에 넣어 어두운 상자로 들어가면 0.15 mA (2 초)의 전기 충격을 가하여 학습(training)시켰다. 24 시간 후에 마우스를 다시 밝은 상자에 넣어 검은 상자에 들어가기까지의 체재시간을 측정하여 학습 및 기억력의 지표로 하였다. 이때 마우스의 컷-오프 시간(cut-off time)은 300초로 하여 대조군과 비교하였다. 시험 결과는 도 15와 같다.
대조군의 마우스는 시험일에 9초의 체재시간을 나타내었고, 두충피 100 mg/kg 투여군은 8초를 나타내었으며, 200 mg/kg 투여군은 13초를 나타내어 마우스의 체재시간을 4초 증가시켰다(p<0.05). 두충피는 마우스의 학습 및 기억력을 증가시킴을 알 수 있다.
실시예 20. 두충엽 조추출물의 수동회피실험에서 스코폴아민 유도 건망증 개선 효과
마우스를 각 군당 10 마리씩 3 군으로 나누었다. 제1군(대조군)은 증류수 투여군, 제2군은 식염수 및 스코폴아민 투여군, 제3군은 두충엽 조추출물 100 mg/kg 및 스코폴아민 투여군으로 하였다.
두충엽 조추출물을 증류수에 용해시켜 100 mg/kg의 용량으로 마우스에 경구투여하고, 30분 후에 스코폴아민 0.25 mg/kg을 피하주사 하였다. 30분 후에 마우스 를 스텝-스루(step-through) 장치에 넣어 어두운 상자로 들어가면 0.4 mA (2 초)의 전기 충격을 가하여 학습(training)시켰다. 24 시간 후에 마우스를 다시 밝은 상자에 넣어 검은 상자에 들어가기까지의 체재시간을 측정하여 스코폴아민 유도 건망증에 대한 학습 및 기억력의 지표로 하였다. 이때 마우스의 컷-오프 시간(cut-off time)은 300초로 하여 대조군과 비교하였다. 시험 결과는 도 16와 같다.
대조군은 161초를 나타내어 기억력이 유지되고 있으나 스코폴아민 투여 대조군은 시험일에 78초의 체재시간을 나타내어 건망증이 현저히 유도되었으며(p<0.01), 두충엽 조추출물 100mg/kg 투여군은 150초를 나타내어 체재시간을 72초 증가시켰다(p<0.01). 두충피의 투여는 저하된 마우스의 학습 및 기억력을 현저히 증가시켰다.
도 1은 두충피 조추출물, 부탄올 가용추출물, 에틸아세테이트 가용추출물 및 물가용 추출물에 의한 아세틸콜린에스테라제 억제능을 나타낸다.
도 2는 두충피 조추출물, 부탄올 가용추출물, 에틸아세테이트 가용추출물 및 물가용 추출물에 의한 자유라디컬 소거능 실험에서 자유라디칼 소거 효능을 나타낸다.
도 3은 두충피 조추출물 투여에 의한 Y-미로실험에서 작업기억 증진효능을 나타낸다.
도 4은 두충피 조추출물 투여에 의한 수동회피실험에서 기억력 증진효능을 나타낸다.
도 5는 두충피 조추출물 투여에 의한 Y-미로실험에서 스코폴아민 유도 작업기억 개선효능을 나타낸다.
도 6은 두충피 조추출물 투여에 의한 수동회피실험에서 스코폴아민 유도 기억력 개선효능을 나타낸다.
도 7은 두충피 조추출물 투여에 의한 수중미로실험에서 스코폴아민 유도 기억력 개선효능을 나타낸다.
도 8은 두충피 조추출물 투여에 의한 Y-미로실험에서 베타 아밀로이드 유도 치매 작업기억 개선효능을 나타낸다.
도 9은 두충피 조추출물 투여에 의한 수동회피실험에서 베타 아밀로이드 유도 치매 기억력 개선효능을 나타낸다.
도 10은 두충피 조추출물 투여에 의한 수중미로실험에서 베타 아밀로이드 유도 치매 기억력 개선효능을 나타낸다.
도 11은 두충피 조추출물 투여에 의한 아세틸콜린에스테라제 억제 효능을 나타낸다.
도 12는 두충피 조추출물 투여에 의한 수동회피실험에서 뇌허혈성 치매 개선효능을 나타낸다.
도 13은 두충피 조추출물 투여에 의한 니슬체 염색법실험에서 뇌세포 보호 효능을 나타낸다.
도 14는 두충엽 조추출물 투여에 의한 Y-미로실험에서 작업기억 증진효능을 나타낸다.
도 15는 두충엽 조추출물 투여에 의한 수동회피실험에서 기억력 증진효능을 나타낸다.
도 16은 두충피 조추출물 투여에 의한 수동회피실험에서 스코폴아민 유도 작업기억 개선효능을 나타낸다.

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  6. 두충 물 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는, 학습 장애, 기억력 장애 또는 치매 질환의 예방 또는 치료용, 또는 학습 또는 기억력 증진용 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 조성물 총 중량에 대하여 두충 물 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 0.001 내지 50 중량% 포함하는 약학 조성물.
  8. 두충 물 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는, 학습 또는 기억력 증진용 기능성 식품.
  9. 제8항에 있어서, 식품 총 중량에 대하여 두충 물 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 0.01 내지 95중량% 포함하는 기능성 식품.
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