KR20230110891A - 두충 잎 분획물을 포함하는 미세먼지로 인한 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 두충(Eucommia ulmoides) 잎 분획물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 뇌질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 하며, 더욱 상세하게는 두충 잎 분획물이 뇌 신경세포에서 발생되는 세포 독성에 대한 세포보호 효과가 우수함을 검증하고, 동물실험을 통해 초미세먼지로 인한 뇌 신경 질환의 직접적인 예방, 개선 또는 치료 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다. 이는 초미세먼지로 인한 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능성식품 조성물, 초미세먼지로 인한 뇌질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물, 초미세먼지로 인한 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 초미세먼지로 인한 뇌질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

두충 잎 분획물을 포함하는 미세먼지로 인한 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for preventing or treating brain diseases caused by ultrafine dust containing Eucommia ulmoides‘s leaves fraction as an active ingredient}
본 발명은 두충(Eucommia ulmoides) 잎 분획물을 유효성분으로 포함하는 미세먼지로 인한 뇌질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는 두충 잎 분획물을 포함하는 초미세먼지로 인한 뇌질환 중 뇌 신경 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 두충(Eucommia ulmoides) 잎 분획물을 유효성분으로 포함하는 미세먼지로 인한 뇌질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 두충 잎 분획물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 뇌 신경 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 상기 뇌 신경 질환의 종류로는 뇌졸중, 알츠하이머 병 (Alzheimer’s disease; AD), 치매 (dementia) 및 파킨슨병 등이 있다.
한편, 최근 미세먼지 (particulate matter, PM)의 농도가 증가하고 지속기간이 증가됨에 따라 미세먼지에 의한 인체 영향성에 대한 관심이 증가되고 있는 추세이다(Kim 등, 2017). 미세먼지는 우리나라의 오랜 역사와 함께 해왔으며, 예로부터 몽고와 중국 사막지역 및 황화강 유역에서 발원된 황사의 영향을 받았고, 최근에는 우리나라 및 동북아시아 국가들의 급격한 산업화가 미세먼지의 주요 발생 원인으로 보고되고 있다(Myung, 2016).
초미세먼지(PM2.5)는 공기역학적 지름이 2.5 μm 이하인 미세먼지를 의미하며, 대기 오염 발생원에서 직접 배출되어지는 1차 오염 물질과 대기에서 반응하여 생성되는 2차 대기오염 물질 (NO3 -, SO4 -, NH4-, polyacromatichydrocarbon (PAH), quinone등)이 주를 이룬다(Kim 등, 2017). 세계보건기구(World Health Organization, 2013)에 의하면, PM10 (공기역학적 지름이 10 μm 이하인 미세먼지)에 장기 노출될 경우 호흡기관 관련 질환과 사망률이 증가하게 되는데, PM2.5는 이보다 더 강한 위험 인자로 작용한다고 보고하였다.
지름 5~10 μg/m3 이하의 먼지는 코 점막을 통해 체내에 흡수가 가능하며 2~5 μg/m3 이하는 기도 (호흡기)를 통과하고, 0.1~1 μg/m3는 폐포 손상까지 유발하게 된다. 미세먼지가 인체에 흡입되었을 경우, 충돌·중력침강·확산·정전기적 흡착 등과 같은 다양한 기전에 의해서 조직에 침착될 수 있으며, 일부는 혈액을 따라서 전신을 순환하기도 한다.
특히, 체내에 침착된 미세먼지는 산화적 스트레스와 염증 반응을 유도하고 호흡계 및 순환계 질환의 급성 악화 등을 유발하는 것으로 보고되고 있다(Myung, 2016). 또한, 후각 상피세포를 거치면 혈관 뇌 장벽(Blood-Brain Barrier; BBB)을 거치지 않고도 뇌로 직접 도달할 수 있으며, 자성을 띄는 입자의 경우 뇌 조직에 직접 침착됨으로써 미세아교세포(Microglia)를 활성화하여 pro-inflammatory cytokines (IL-1β, TNF-α 및 IFN-γ) 등을 생산함으로써 뇌신경 염증을 유도하고 더 나아가 인지장애를 유도하는 것으로 보고되었다(Block, 2004). 따라서, 이러한 미세먼지로 유도될 수 있는 인체 내 산화적 스트레스 억제 및 염증 반응을 억제시켜 줄 수 있는 천연 식품 소재에 대한 연구가 필요하다고 사료된다.
한편 두충(Eucommia ulmoides)은 두충나무과 두충속의 낙엽교목으로써 높은 약용가치를 나타내고 있어 한국, 중국, 일본 등에서 널리 재배되고 있다. 두충의 수피는 혈압 조절을 효능을 지니고 있으며, 두충 잎은 고지혈증과 지방간 질환에 대한 효능을 지닌다고 보고되어 진다. 두충의 잎과 수피에는 phenolics, lignan, iridoids 및 triterpene 등이 존재하고, 특히 iridoids 유도체와 lignan 배당체는 항비만, 항심혈관질환에 우수한 효능을 나타내는 것으로 알려져 있다. 나아가 두충 잎과 수피는 항산화, 항염증 및 신경 보호 효과에 대해 보고되어 있다. 따라서 두충 잎 아세트산 에틸 분획물이 PM2.5로 인한 산화적 스트레스 및 염증 반응에서 인지기능 개선 효능을 평가하고자 하였다.
따라서, 본 연구에서는 뇌 신경세포에서 발생 되는 세포 독성에 대한 세포보호 효과를 검증하였고, 동물실험을 통해 두충 잎 분획물을 포함하는 조성물이 초미세먼지로 인한 뇌질환에 대해 예방, 개선 또는 치료용 조성물로 사용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
KR 10-2011-0002237
본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위해, 두충(Eucommia ulmoides) 잎 분획물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 뇌질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 하며, 더욱 상세하게는 두충 잎 분획물이 뇌 신경세포에서 발생되는 세포 독성에 대한 세포보호 효과를 검증하였으며, 동물실험을 통해 직접적으로 초미세먼지로 인한 뇌질환의 예방, 개선 또는 치료 효능을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
상기한 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 두충 잎 분획물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능성식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 분획물은 물 분획물, n-헥산 분획물, 클로로포름 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물인 것일 수 있으며, 바람직하게는 에틸아세테이트 분획물인 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 뇌질환은 뇌 신경 질환인 것을 특징으로 하며, 상기 뇌 신경 질환은 뇌졸중, 알츠하이머병 (Alzheimer’s disease; AD), 치매 (dementia) 및 파킨슨병 중 어느 하나인 것으로 하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 조성물은 뇌 조직 내 ABTS 라디칼 소거 활성 또는 DPPH 라디칼 소거 활성이 증가된 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 조성물은 초미세먼지로 유도된 뇌 조직 내에서의 지방질과산화물인 말론디알데히드(Malondialdehyde, MDA)의 생성을 억제하는 효과를 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 조성물은 초미세먼지로 유도된 뇌 조직 내에서의 활성산소(reactive oxygen species, ROS)의 생성을 억제시키는 효과를 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 조성물은 초미세먼지로 유도된 뇌 조직 내에서의 세포사멸을 억제시키는 효과를 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 조성물은 초미세먼지로 유도된 뇌 조직 내에서의 염증 반응에 대한 조직 보호 효과를 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 조성물은 초미세먼지로 인한 공간인지력 저하를 개선시키는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 조성물은 초미세먼지로 인해 저하된 단기 학습 및 단기 기억력을 개선시키는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 조성물은 초미세먼지로 인해 저하된 장기 학습 및 장기 기억력을 개선시키는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 조성물은 초미세먼지로 인해 뇌 조직에서의 인지기능 저하를 개선시키는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 조성물은 초미세먼지로 인한 뇌 조직에서 콜린성 시스템의 기능 저하를 개선시키는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 두충(Eucommia ulmoides) 잎 분획물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 두충(Eucommia ulmoides) 잎 분획물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 뇌질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 두충(Eucommia ulmoides) 잎 분획물은 초미세먼지로 인한 뇌질환에 대해 예방, 개선 또는 치료 효과가 뛰어나므로 초미세먼지로 인한 뇌질환 특히 뇌 신경 질환에 대한 예방 또는 개선용 건강기능성식품 조성물, 초미세먼지로 인한 뇌질환 특히 뇌 신경 질환에 대한 예방 또는 개선용 식품 조성물, 초미세먼지로 인한 뇌질환 특히 뇌 신경 질환에 대한 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 초미세먼지로 인한 뇌질환 특히 뇌 신경 질환에 대한 예방 또는 개선용 화장료 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 두충 잎 분획물의 총 페놀 및 플라보노이드 함량 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 두충 잎 분획물의 항산화 활성 측정 결과(ABTS 라디칼 소거 활성 및 DPPH 라디칼 소거 활성)를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 두충 잎 분획물이 뇌 신경세포에서의 세포 내 활성산소 (reactive oxygen species, ROS)의 생성 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 두충 잎 분획물의 뇌 신경세포에서의 세포사멸을 억제시키는 효과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 두충 잎 분획물의 공간 학습 및 기억능력 개선 효과를 Y-maze test를 이용해 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 두충 잎 분획물의 장기 학습 및 기억능력 개선 효과를 Morris water maze 실험을 이용해 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 두충 잎 분획물의 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 뇌 조직에서 SOD 활성 개선 효과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 두충 잎 분획물의 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 뇌 조직에서 GSH 활성 개선 효과를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 두충 잎 분획물의 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 뇌 조직에서 MDA 활성 개선 효과를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명의 두충 잎 분획물의 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 뇌 조직에서의 콜린성 시스템 손상 개선 효과를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 두충 잎 분획물의 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 뇌 조직에서 미토콘드리아 활성 개선 효과를 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명의 두충 잎 분획물의 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 olfactory bulb 조직에서의 염증 개선 효과를 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명의 두충 잎 분획물의 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 hippocampus 조직에서의 염증 개선 효과를 나타낸 도이다.
본 발명은 두충(Eucommia ulmoides) 잎 분획물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능성식품 조성물 제공을 목적으로 한다. 보다 바람직하게는, 초미세먼지로 인한 뇌 신경 질환 예방 또는 개선용 건강기능성식품 조성물 제공을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 두충 잎 분획물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 제공을 목적으로 한다. 보다 바람직하게는, 초미세먼지로 인한 뇌 신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 제공을 목적으로 한다.
마지막으로, 본 발명은 두충 잎 분획물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 뇌질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물 제공을 목적으로 한다. 보다 바람직하게는, 초미세먼지로 인한 뇌 신경 질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물 제공을 목적으로 한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현 예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어 (terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (w/w) %, 고체/액체는 (w/v) %, 그리고 액체/액체는 (v/v) %이다.
일 측면에서, 두충 잎 분획물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능성식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 추출물은 당업계에 공지된 추출 및 분리방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된 "추출물"은 적절한 용매를 이용하여 두충 잎으로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함한다. 상기 두충 잎으로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 식품학적으로 또는 약학적으로 허용되는 유기용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 정제수, 메탄올 (methanol), 에탄올 (ethanol), 프로판올 (propanol), 이소프로판올 (isopropanol), 부탄올 (butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤 (acetone), 에테르 (ether), 벤젠 (benzene), 클로로포름 (chloroform), 에틸아세테이트 (ethyl acetate), 메틸렌클로라이드 (methylene chloride), 헥산 (hexane) 및 시클로헥산 (cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다.
본 발명의 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피 (thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피 (high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다. 따라서 본 발명에 있어서 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.
본 발명의 식품 조성물은 유효성분인 분획물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 상기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 유효성분인 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 건강기능성식품 조성물은, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공될 수 있다. 본 발명에서 '건강기능성식품 조성물'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능성식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다. 예를 들어, 정제 형태의 건강기능성식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능성식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다. 캅셀 형태의 건강기능성식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다. 환 형태의 건강기능성식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다. 과립 형태의 건강기능성식품은 본 발명의 유효성분의 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
일 측면에서, 두충(Eucommia ulmoides) 잎 분획물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약학 조성물에는 유효성분 이외에 보조제 (adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 본 발명의 효과를 증가시킬 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.
상기 약학 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화될 수 있다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질, 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제 (예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제 (예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/ 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제제이며, 주사용 제제의 용매로서 물, 링거액, 등장성 생리식염수 또는 현탁액을 들 수 있다. 상기 주사용 제제의 멸균 고정 오일은 용매 또는 현탁 매질로서 사용할 수 있으며 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있다.
또한, 상기 주사용 제제는 올레산과 같은 지방산을 사용할 수 있다.
일 측면에서, 두충 잎 분획물을 유효성분으로 포함하는, 초미세먼지로 인한 뇌질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 “화장료 조성물”은 상술한 본 발명의 두충 잎에서 추출한 추출물의 화장품학적 유효량 (cosmetically effective amount) 및 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하여 제조할 수 있다.
본 명세서에서 용어 “화장품학적 유효량”은 상술한 본 발명의 조성물의 표피 각질형성세포의 증식을 통한 피부 재생 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
화장료 조성물의 외형은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는, 이온형 (리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 또한 포말 (foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일 및 바디에센스 등의 화장품으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 스킨, 로션, 크림, 에센스, 팩, 파운데이션, 색조화장품, 선크림, 투웨이케이크, 페이스파우더, 콤팩트, 메이크업베이스, 스킨커버, 아이쉐도우, 립스틱, 립글로스, 립픽스, 아이브로우 펜슬, 화장수 등의 화장품 및 샴푸, 비누 등의 세정제에 적용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 화장료 조성물에는 상기 두충 잎에서 추출한 추출물 이외에 기능성 첨가물 및 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분이 추가로 포함될 수 있다. 상기 기능성 첨가물로는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에는 또한, 상기 기능성 첨가물과 더불어 필요에 따라 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분을 배합해도 된다. 이외에 포함되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한 (制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 자세히 설명한다. 다만, 상기 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
[준비예]
준비예 1. 두충 잎 분획물의 제조
본 실험에 사용된 두충 잎은 경상북도 영천시에 위치한 농가로부터 2019년 4월에 40℃에서 열풍 건조된 두충 잎을 구입하여 사용하였다. 파우더 형태로 마쇄된 두충 잎 20 g은 사전 연구를 통해 총 페놀의 함량이 가장 우수하였던 40% 에탄올 용매 1 L에 혼합되어 40℃에서 2시간 동안 환류 냉각 추출하였다. 이 후, 여과지를 이용해 여과한 후 얻어진 추출물은 동일한 양의 n-헥세인, 클로로폼, 에틸아세테이트를 사용하여 분획을 실시하였다. 얻어진 에틸아세테이트 분획물은 회전진공농축기(N-N series, Eyela Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 농축하고 동결건조하여 본 실험에 사용하였다.
준비예 2. 실험에 사용된 세포 배양
본 실험에 사용된 뇌 신경세포(MC-IXC)는 ATCC로부터 구입하여 10% FBS 및 1% penicillin (50 units/mL)/streptomycin (100 μg/mL)이 포함된 minimum essential medium (MEM) 배지를 사용하였다. 미세아교세포(BV-2)는 한국식품연구원으로부터 분양받아 10% fetal bovine serum (FBS) 및 1% penicillin (50 units/mL)/streptomycin (100 μg/mL)이 포함된 DMEM 배지를 배양액으로 사용하였고, 모든 세포는 37℃, 5% CO2 조건의 incubator에서 배양하였다.
[실시예]
실시예 1. 두충 잎 분획물의 총 페놀성 화합물 및 총 플라보노이드 함량 측정
1-1. 실험 방법
총 페놀성 화합물 함량을 측정하기 위하여 시료에 Folin & Ciocalteau’s phenol reagent를 혼합하여 실온에서 5분간 방치한 후 7% Na2CO3를 혼합하였다. 이후 3차 증류수를 이용해 정용한 후, 상온에서 2시간 동안 반응시켜 760 nm에서 흡광도(UV-1800, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 측정하였다. 측정된 흡광도는 갈릭산을 이용해 작성된 검량 곡선으로 총 페놀성 화합물의 함량을 나타냈다.
또한, 총 플라보노이드 함량 측정은 두충 잎 추출물 1 mL에 다이에틸렌글리콜과 수산화나트륨을 혼합한 후, 30℃에서 60분 동안 반응시켰다. 최종반응물은 420 nm에서 흡광도를 측정하였고, 루틴을 사용하여 작성된 보정선에 대입하여 총 플라보노이드 함량을 계산하였고, 이를 루틴 당량(mg RE (rutin equivalent)/g of dried weight)으로 나타냈다.
1-2. 실험 결과
두충 잎 40% 에탄올 추출물을 이용해 극성에 따라 n-헥세인, 클로로폼, 에틸아세테이트 용매로 순차적으로 분획을 실시하였으며, 얻어진 4개의 분획물 층을 이용해 총 페놀성 화합물 및 총 플라보노이드 함량을 측정하였다(도 1). n-헥세인, 클로로폼, 에틸아세테이트 및 증류수 층에서 총 페놀의 함량은 각각 18.25, 148.08, 353.75, 55.58 mg of GAE/g으로 나타났고, 총 플라보노이드 함량은 각각 9.74, 37.44, 463.46, 31.67 mg of RE/g으로 나타냈다.
실시예 2. 뇌 조직에서의 라디칼 소거 활성 및 지방질과산화물 생성 억제 효과
2-1. 실험 방법
ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) 라디칼 소거 활성은 150 mM 염화소듐을 포함한 100 mM 인산 완충용액 (pH 7.4)에 2.45 mM 과황산칼륨(potassium persulfate) 및 7 mM ABTS 시약을 혼합하여 68℃의 항온 수조에서 15분간 방치한 후, 수용성 필터를 이용해 여과하여 24시간 동안 냉장 보관하여, ABTS 라디칼을 생성시켜 사용하였다.
ABTS 라디칼 용액은 734 nm에서 흡광도 값 (0.70±0.02)을 조정하였고, ABTS 용액과 시료를 혼합하여 37℃에서 10분 동안 반응시켰다. 반응물은 분광광도계를 이용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하여 라디칼 소거 활성을 계산하였다.
DPPH 라디칼 소거 활성은 80% 메탄올에 녹인 0.1 mM DPPH 용액을 517 nm에서 흡광도 값이 1.00±0.02가 되도록 조정하였고, DPPH 용액과 시료를 혼합하여 실온과 암실 조건에서 30분간 반응시켰다. 최종반응물은 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
마우스 뇌 조직을 이용한 지방질과산화물 (Malondialdehyde, MDA) 생성 억제 효과는 ICR (institute of cancer research) 마우스(male, 4 weeks)를 실험동물 공급업체 (Samtako, Osan, Korea)로부터 구입 후, 뇌를 적출하여 실험에 사용하였다. 본 동물실험은 경상대학교 동물윤리심의위원회 승인 후 진행하였다 (경상대학교 동물실험 인가번호: GNU-120831-M0067).
뇌 조직 무게 10배의 20 mM 트리스 염산 완충용액 (pH 7.4)를 첨가하여 조직파쇄기 (Next Advance Inc., NY, USA)를 사용하여 균질화하였다. 균질화 된 뇌 조직은 원심분리(5,000 x g, 20분, 4°C)하였고, 그 상층액을 실험에 사용하였다. 추출물, 상층액, 10 μM 황산철(Ⅱ), 0.1 mM 아스코브산을 혼합하여 37°C에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 30% 트라이클로로아세트산과 1% 싸이오바비투르산을 첨가하여 80℃의 항온 수조에서 20분 동안 가열하여 상층액을 532 nm에서 흡광도를 측정하였다.
2-2. 실험 결과
두충 잎 분획물의 ABTS 및 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과는 도 2와 같다.
양성대조군으로 사용된 비타민 C와 비교할 때 500 μg/mL 농도의 두충 잎 분획물은 200 μg/mL 농도의 vitamin C와 유사한 라디칼 소거능을 나타냈다. ABTS와 DPPH 라디칼 소거능에서 vitamic C의 IC50 값은 각각 111.75 μg/mL와 117.91 μg/mL으로 나타났고, 두충 잎 분획물의 IC50 값은 각각 212.80 μg/mL와 359.13 μg/mL으로 각각 나타났다. 또한 두충 잎 분획물의 지질과산화물 억제 활성을 측정한 결과는 100 μg/mL 농도의 두충 잎 분획물과 catechin의 지질과산화물 저해 활성은 각각 87.40%와 85.07%로 나타났고, catechin과 두충 잎 분획물의 IC50값을 비교하였을 때, 각각 25.29 μg/mL, 33.18 μg/mL로 나타났다.
이러한 결과들을 고려할 때, 두충 잎 분획물의 마우스 뇌 조직에서 나타나는 우수한 항산화 활성은 실시예 1의 총 페놀성 화합물의 함량과의 상관관계에서 기인된 것이며, 산화적 스트레스로 인하여 발생되는 세포의 기능적 손상을 감소시켜 보호하는데 도움이 될 것으로 판단된다.
실시예 3. 두충 잎 분획물의 뇌 신경세포에서의 초미세먼지 (PM 2.5 ) 유도성 산화적 스트레스의 세포 내 생성 억제 효과
3-1. 세포 내 산화적 스트레스 측정 방법
세포 내 산화적 스트레스 측정을 위해 MC-IXC 세포는 1×104 cells/well의 농도로 96 well plate에 일정하게 분주하였으며, BV-2 세포는 0.5×104 cells/well 농도로 분주하여, 24시간 동안 incubator에서 배양하여 세포를 부착시켰다.
이후 농도별 시료를 각 well에 처리하고 30분 뒤 MC-IXC 세포는 100 μg/mL 농도의 PM 2.5 를 처리하였고 BV-2 세포는 50 μg/mL 농도의 PM2.5를 처리하였다.
이후 MC-IXC 세포는 24시간, BV-2 세포는 12시간 반응시킨 후 50 μM DCF-DA를 처리하여 40분간 반응시켰다. 이는 형광 광도계(Infinite F200, Tecan, Mannedorf, Swiss)를 사용하여 excitation wave 485 nm 및 emission wave 535 nm에서 형광강도를 측정하였다.
3-2. 실험 결과
PM2.5로 인한 MC-IXC, BV-2 세포에 대한 ROS 생성과 이에 대한 두충 잎 분획물의 세포 보호 효과를 확인한 결과는 도 3과 같다.
MC-IXC, BV-2세포에 PM2.5를 처리하였을 때, ROS는 각각 646.99%, 341.71%로 증가하였으나, 두충 잎 분획물 10 μg/mL 처리하였을 때, 각각 75.27%, 93.03%로 감소하여 정상 대조군과 유사하거나 더 낮은 ROS의 수준을 나타내었다.
이러한 결과를 바탕으로 보았을 때, 두충 잎 분획물은 초미세먼지로 유도된 세포 내 ROS의 과도한 생성을 억제하여 세포보호 효과를 나타내는 것으로 판단된다.
실시예 4. 두충 잎 분획물의 뇌 신경세포에서의 초미세먼지 (PM 2.5 ) 유도성 세포사멸 억제 효과
4-1. 세포 생존율 측정 방법
세포 생존율 측정을 위해 전처리는 세포 내 ROS 함량 측정과 동일한 조건으로 세포를 분주하였고, 시료와 미세먼지도 동일한 조건으로 처리하였다.
이후 MC-IXC 세포는 24시간, BV-2 세포는 12시간 반응시킨 후 배지에 처리된 배양액을 모두 제거하였으며, 이후 다이메틸 일산화항 (dimethyl sulfoxide; DMSO)를 100 μL 처리하여 상온에서 반응시킨 뒤 570 nm (determination wave)와 690 nm (reference wave)에서 흡광도를 측정하였다.
4-2. 실험 결과
초미세먼지는 세포 내에 산화적 스트레스를 증가시키고 염증 반응을 촉진 시킴으로써 세포의 기능 저하 및 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있으며 (Guo 등, 2015), 두충 잎 분획물의 뇌 신경세포에서의 초미세먼지 유도성 세포사멸 억제 효과를 측정한 결과는 도 4와 같다.
도 4를 살펴보면 모든 세포에서 PM2.5의 처리는 세포의 사멸을 유도하는 것으로 확인되었고, MC-IXC, BV-2세포에 PM2.5를 처리하였을 때 세포 생존율은 각각 63.73%, 38.21%이며, 두충 잎 분획물 50 μg/mL 처리하였을 때, 각각 97.80%, 59.46%로 PM2.5로 인한 세포사멸로부터 세포를 보호하는 것으로 나타났다.
또한 두충 잎 분획물 10 μg/mL 처리군에서는 양성 대조군와 유사하거나 더 높은 세포 생존률을 나타내었다. 따라서 PM2.5로 유도되는 산화적 스트레스로부터 세포보호 효과를 나타내는 것으로 확인된다.
초미세먼지의 노출에 의한 세포 기능 저하는 다양한 메커니즘에 의한 것으로 그 중심에는 염증 반응의 활성화와 관련된 것으로 보고되고 있다. 초미세먼지는 세포막에서 직접적으로 반응하는데, lysosomal leakage 및 세포 표면 수용체인 toll-like 수용체와의 결합은 NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3 (NLRP3) inflammasome의 형성을 유도한다. 이는 다시 IL-1β의 방출을 유도하게 되고 nuclear factor-κB (NF-κB) 및 mitogen-activated protein kinase (MAPK) 경로를 활성화시킴으로써 세포 내 ROS의 생성 유도 및 pro-inflammatory cytokine (IL-1 family, TNF-α 및 IL-18) 분비를 촉진하게 된다. 뿐만 아니라, 초미세먼지는 세포 표면에서 직접적으로 반응할 수 있으며, PAH 및 quinone과 같은 물질들은 산화-환원 관련 대사의 활성화를 통하여 ROS 및 반응성이 큰 친전자성 대사산물(O2 ·-, H2O2, O2 ·-및 ·OH)들을 생성함으로써 미토콘드리아의 손상을 유발하고, 세포의 기능 저하를 초래하게 된다(Guo 등, 2015).
본 실험의 결과에서 나타난 두충 잎 추출물의 뇌 세포 내 ROS 생성 억제 효과 및 세포사멸 억제 효과는 두충에 함유되어 있는 다양한 생리 활성 물질에 의한 것으로 사료된다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때, 두충 잎 추출물은 뇌 신경세포에서 초미세먼지로 유도될 수 있는 세포 손상으로부터 기능 개선 및 치료에 도움을 줄 수 있는 건강기능성식품 조성물, 식품 조성물, 약학적 조성물 또는 화장료 조성물로서의 활용 가능성이 기대된다.
실시예 5. 뇌질환 개선효과를 보기위한 동물행동분석
5-1. 교대 행동 능력 평가 실험 (Y-maze)
교대 행동 능력을 실험하기 위하여 Y-maze를 실시하였고, Y모양으로 이루어진 검은색 플라스틱으로 제작한 Y-maze를 실험에 사용하였다. 각 arm을 각각 A와 B, C로 정한 후, 8분 동안 마우스가 움직인 경로를 smart 3.0 video tracking system (Panlab, Barcelona, Spain)으로 기록하였다. 마우스는 Y 모양으로 만들어진 미로에서 8분 동안 자유롭게 움직이며, 마우스가 3개의 팔에 순차적으로 교대하여 움직이는 것을 옳은 행동으로 평가한다.
PM2.5 노출로 인한 마우스의 자발적인 교대 행동 능력을 평가한 결과는 도 5에 나타내었다. 도 5A는 마우스가 8분 동안 Y-maze를 움직인 총 거리를 나타내었으며 모든 그룹에서 마우스의 행동 능력이 동일함에 따라 마우스의 행동 장애가 없음을 의미한다. 도 5B는 마우스 교대 행동을 나타내었으며, 그 결과 PM 2.5 그룹에서 22.56%로 낮은 교대 행동 수준을 나타내었으나 두충 잎 분획물 20과 40그룹에서 자발적 교대 행동의 능력이 33.56%와 29.41%로 증가하는 것을 확인하였는바 효과적으로 교대 행동 능력을 개선시키는 것을 확인하였다.
5-2. 장기 학습 및 기억능력 평가 실험 (Morris water maze)
장기 학습 및 기억능력을 평가하기 위하여 Morris water maze 실험을 실시하였고, 실험을 진행하는 동안 마우스는 4분면으로 나누어진 수조에서 1분 동안 자유롭게 수영하도록 하였다. 수조는 동, 서, 남, 북으로 나누어져 있고 한 쪽 분면에는 플랫폼을 위치시켰다. 따라서 Morris water maze test는 플랫폼을 보이게 하여 진행하는 visible test (Day 1)와 플랫폼을 보이지 않게 진행하는 hidden test (Day 2~5), 마지막으로 플랫폼을 완전히 제거하여 진행하는 probe test (Day 6)으로 진행하였다. Hidden test에는 마우스가 숨겨진 플랫폼을 찾아 탈출하기까지의 시간을 측정하였고, probe test에서는 마우스가 플랫폼이 위치 해있던 자리에 머무는 시간을 측정하였다.
PM2.5 노출로 인한 마우스의 장기 기억 능력을 평가한 결과는 도 6에 나타내었다. 도 6A는 Morris water maze test의 visible test와 hidden test 동안 마우스가 플랫폼으로 탈출하기까지 걸리는 시간을 측정한 결과로 PM2.5그룹에서는 탈출 시간의 변화가 나타나지 않았으나 두충 잎 분획물 20과 40그룹에서는 실험이 진행될수록 탈출 시간이 짧아지는 것을 확인하였다. 도 6B는 마지막 probe test에서 플랫폼이 존재하던 W zone에 마우스가 머무르는 시간을 측정한 결과 PM2.5그룹에서 29.11%로 낮은 수준을 나타내었고, 두충 잎 분획물 20과 40그룹에서 각각 55.85%, 75.16%로 더욱 증가된 수준을 나타내었다.
실시예 6. 뇌 조직 내 항산화 시스템 개선 효과
6-1. Superoxide dismutase (SOD) 활성 측정
마우스로부터 적출된 뇌 조직은 phosphate buffer saline (PBS)를 이용하여 균질화하였고, 얻어진 균질액은 400 × g에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛을 얻었다. 얻어진 펠렛은 1×cell extraction buffer (10×SOD buffer 1.0 mL, 20% triton X-100 0.2 mL, distilled water 8.8 mL, phenylmethanesulfonyl fluoride in ethanol 10 μL)를 이용하여 추출되었다. 이는 14,000 × g에서 5분 동안 원심분리되어 상등액을 얻었으며, 얻어진 상등액의 SOD 함량은 SOD assay kit (Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 사용하여 측정하였으며 microplate reader (Epoch2, BioTek)를 통해 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
PM 2.5 노출로 유도된 마우스 모델의 뇌 조직에서 SOD 함량을 나타낸 결과는 도 7과 같다. PM 2.5 가 노출된 마우스의 뇌 조직에서 SOD 함량은 3.50 unit/mg of protein으로 나타났고, 두충 잎 분획물 40그룹에서는 각각 4.46 unit/mg of protein으로 나타났다. 따라서 두충 잎 분획물의 섭취는 PM 2.5 의 노출로 인한 SOD의 수준 감소를 개선 시킬 수 있음을 확인하였다.
6-2. 환원형 글루타치온(reduced glutathione, reduced GSH) 활성 측정
마우스로부터 적출된 뇌 조직은 10 mM sodium phosphate buffer with 1 mM EDTA (pH 6.0)을 이용하여 균질화하였고, 균질액은 10,000 × g에서 15분 동안 원심분리하였다. 얻어진 상등액으로 단백질 정량을 진행한 후, 상등액과 5% metaphosphoric acid를 1:1로 혼합하여 2,000 × g에서 2분 동안 원심분리하여 얻어진 상등액으로 실험을 진행하였다. 상등액과 0.26 M Tris-HCl (pH 7.5), 0.65 N NaOH 및 OPT in methanol을 넣고 암실에서 15분 반응시킨 뒤, 형광 광도계 (Infinite F200, Tecan)를 사용하여 excitation wave 320 nm 및 emission wave 420 nm에서 측정하였다.
PM 2.5 에 노출된 마우스의 뇌 조직에서 reduced GSH 함량은 도 8과 같다. PM 2.5 의 만성적인 노출은 뇌 조직에서 reduced GSH는 정상 대조군을 100%로 하였을 때 74.92%로 감소 되었고, 두충 잎 분획물 40그룹에서는 95.89%로 그 함량이 증가 되었다. 따라서 PM 2.5 의 만성적인 노출로 유도된 마우스의 뇌 조직의 항산화 체계의 붕괴는 두충 잎 분획물을 섭취함으로써 개선되는 것을 확인하였다.
6-3. 지질과산화물(malondialdehyde, MDA) 함량 측정
마우스로부터 적출된 뇌 조직은 PBS를 이용하여 균질화하였고, 얻어진 균질액을 5,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 얻어진 상등액을 실험에 사용하였다. 상등액과 1% phosphoric acid 및 0.67% thiobarbituric acid (TBA)를 혼합하여 95℃ 항온 수조에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응액은 microplate reader (Epoch2, BioTek)를 통해 532 nm에서 흡광도를 측정하였다.
PM 2.5 를 만성적으로 노출 시킨 마우스의 뇌 조직에서 지질과산화물의 함량을 평가한 결과는 도 9와 같다. 결과를 보았을 때, 뇌 조직에서 PM 2.5 의 만성적인 노출은 지질과산화물의 함량을 증가시켰고, PM 2.5 그룹에서 4.32 nmole/mg of protein로 나타났고, 두충 잎 분획물 40그룹에서 3.11 nmole/mg of protein으로 나타났다. 따라서 PM 2.5 는 마우스의 뇌 조직에서 지질 과산화를 유도하며, 두충 잎 분획물은 PM 2.5 로부터 지질의 과산화를 억제하는 것을 확인하였다.
실시예 7. 콜린성 시스템 개선 효과
마우스로부터 적출된 뇌 조직은 PBS를 이용하여 균질화하였고, 이는 12,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액은 단백질 정량 후 아세틸콜린(acetylcholine : ACh) 함량과 아세틸콜린에스터라제(acetylcholinesterase : AChE) 활성을 측정하는데 사용되었다. ACh의 함량 측정을 위해 상등액은 2 M hydroxylamin·HCl과 3.5 N NaOH를 1:1 비율로 혼합한 혼합액과 2분 동안 반응시켰다. 이후 0.5 N HCl와 0.37 M FeCl2·6H2O in 0.1 N HCl을 첨가하였고 이는 microplate reader (Epoch2, BioTek)를 이용하여 540 nm에서 흡광도 측정하였다.
AChE 활성을 측정을 위해 상등액은 50 mM sodium phosphate buffer와 혼합하여 37℃에서 15분 동안 반응시켰다. 이후 acetylthiocholin과 DTNB가 결합된 AChE solution을 첨가하고 37℃에서 5분간 반응시켰으며, 이는 microplate reader (Epoch2, BioTek)를 이용하여 405 nm에서 흡광도 측정하였다.
PM2.5의 만성적인 노출로 마우스의 cholinergic system에 미치는 영향을 평가한 결과는 도 10과 같다. 도 10 (A)와 (B)는 마우스의 뇌 조직에서 ACh의 함량과 AChE의 활성을 평가한 결과로 PM2.5의 노출은 신경전달물질인 ACh의 함량을 1.67 mM/mg of protein으로 감소시켰고, ACh를 분해시키는 AChE의 활성은 정상 대조군을 100%으로 하였을 때 108.52%로 증가시켰다. 이에 두충 잎 분획물 40그룹에서 ACh의 함량은 1.95 mM/mg of protein으로 나타났고, AChE의 활성은 83.35%로 감소 되는 것으로 확인하였다. 또한 western blot assay를 통하여 마우스의 뇌 조직에서 AChE의 발현량을 측정한 결과 역시, PM2.5그룹에서 정상 대조군 대비 1.56배 증가되었고 두충 잎 분획물 40그룹에서는 PM2.5그룹 대비 0.71배 감소함으로써 대조군과 유사한 수준으로 감소되는 것을 확인하였다.
실시예 8. 미토콘드리아 기능 개선 효과
8-1. 뇌 조직 내 미토콘드리아 분리
마우스 뇌 조직의 미토콘드리아 활성을 평가하기 위해 뇌 조직에서 미토콘드리아를 추출하였다. 215 mM mannitol, 75 mM sucrose, 0.1% bovine serum albumin (BSA), 20 mM HEPES (Na+)로 이루어진 isolation buffer (pH 7.2)와 20 mM EGTA를 혼합된 버퍼를 이용해 뇌 조직은 균질화하였고, 균질액은 1,300 × g에서 5분 동안 원심분리하였다. 이를 통해 얻어진 상등액은 13,000 × g에서 10분 동안 원심분리하였고, 펠렛을 얻었다. 얻어진 펠렛에 20 mM EGTA와 0.1% digitonin이 함유된 isolation buffer를 첨가하여 ice에서 5분 동안 방치시킨 후, 이는 13,000 × g에서 15분 동안 원심분리하였다. 이를 통해 얻어진 펠렛은 isolation buffer와 혼합하여 10,000 × g에서 10분 동안 원심분리하였고, 최종적으로 얻어진 펠렛을 이용하여 미토콘드리아 활성을 평가하였다.
8-2. 초미세먼지에 노출된 뇌 조직에서의 미토콘드리아 기능평가 (미토콘드리아 내 Reactive oxygen species; ROS 함량 측정)
뇌 조직으로부터 추출된 미토콘드리아 추출물에서 미토콘드리아 내 ROS 함량을 측정하기 위해, 25 μM DCF-DA 시약과 혼합하여 암흑에서 20분 동안 반응시켰다. 이 반응액은 형광 광도계 (Infinite F200, Tecan)를 사용하여 excitation wave 485 nm 및 emission wave 535 nm에서 측정하였다.
PM2.5의 만성적인 노출로 유도된 마우스 뇌 조직의 미토콘드리아 내에서 ROS의 함량은 133.68%로 증가시켰으며, 두충 잎 분획물 40그룹에서는 73.12%로 감소시켰다(도 11A).
8-3. 초미세먼지에 노출된 뇌 조직에서의 미토콘드리아 기능평가 (미토콘드리아 막 전위 측정 Mitochondria membrane potential; MMP)
뇌 조직으로부터 추출된 미토콘드리아 추출물은 mitochondrial membrane potential (MMP) 활성을 측정하기 위해 사용하였으며, 미토콘드리아 추출물은 5 mM pyruvate와 5 mM malate가 함유된 미토콘드리아 isolation buffer와 혼합하였고, 이후 1 μM JC-1을 첨가하여 20분 동안 암흑에서 반응시켰다. 반응액은 형광광도계(Infinite F200, Tecan)를 이용하여 excitation wave 530 nm 및 emission wave 590 nm에서 측정하였다.
미토콘드리아의 막 전위를 평가한 결과에서 (도 11B), PM2.5그룹은 마우스의 뇌 조직에서 정상 대조군을 100%로 하였을 때, 73.60% 막 전위 손실을 나타내었고 두충 잎 분획물 40그룹에서 152.17%로 막 전위의 손실을 보호하였다.
8-4. 초미세먼지에 노출된 뇌 조직에서의 미토콘드리아 기능평가 (미토콘드리아 내 ATP 함량 측정)
뇌 조직으로부터 추출된 미토콘드리아 추출물에서 ATP level을 측정하기 위해, 추출물은 10,000 × g에서 10분 동안 원심분리하였고, 얻어진 펠렛은 1% trichloroacetic acid와 혼합하여 ice에서 10분 동안 반응시켰다. 이후 25 mM Tris-acetate buffer (pH 7.7)과 혼합한 뒤, 10,000 × g에서 15분 원심분리하였고 얻어진 상등액은 ATP level을 측정하는데 사용되었고, 이는 ATP assay kit (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 luminometer (GloMax-Multi Detection System, Promega, Corp., Madison, WI, USA)를 이용하여 측정하였다.
도 11C에서 미토콘드리아 내에 ATP level을 측정한 결과로 PM2.5의 만성적인 ATP 수준의 감소를 나타내었고, 두충 잎 분획물의 개선 효과는 미비하였다.
8-5. 초미세먼지에 노출된 뇌 조직에서의 미토콘드리아 기능평가 (웨스턴블랏법을 활용한 단백질 발현측정)
마우스로부터 적출된 뇌에서 분리한 해마와 후각 망울 조직을 이용하여 아밀로이드 베타 경로 단백질과 염증 반응에 관여하는 단백질의 발현을 측정하였다. 적출된 조직들은 1% protease inhibitor가 첨가된 cell/tissue lysis buffer를 이용해 단백질을 추출하였다. 단백질 추출액은 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 얻었으며, 이는 bradford법을 이용하여 단백질 상대 정량하였다. 조직의 단백질은 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 분리하였고 이는 poly-vinylidene difluoride (PVDF) membrane으로 transfer하였다. 이후 5% skim milk를 이용하여 1시간 동안 blocking하고 세척하였다. 이후 0.5% BSA와 0.1% sodium azide를 포함하는 TBST solution에 1:1000으로 희석된 1차 항체를 overnight하여 반응하였으며, 이후 세척 하여 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 2차 항체 반응이 종료된 membrane은 ECL solution에 반응시켜 발색시켰으며, 이는 ChemiDoc (iBrightTM CL1000 instrument, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 발광 밀도를 검출하였다. 밴드의 밀도는 ibright analysis software (Thermo Fisher, Waltham, Middlesex, MA, USA)를 이용하여 수치화하였고, 각 인자의 밀도 값은 β-actin의 밀도 값으로 나누어서 나타냈다.
마우스의 뇌 조직으로 분리한 olfactory bulb 조직에서 아밀로이드 베타 경로에 관여하는 단백질과 염증성 인자의 발현량을 측정한 결과는 도 12와 같다. Olfactory bulb는 PM2.5가 뇌 조직으로 침투하는 경로 중 하나로, PM2.5가 olfactory bulb에 축적되었을 때, 염증 반응의 가속화가 이루어진다고 보고되었다. 또한 olfactory bulb는 인지 손상의 초기 단계에서 아밀로이드 베타 축적과 타우 단백질의 과인산화를 나타낸다고 보고되었다. 따라서 도 12의 결과에서 PM2.5의 만성적인 노출은 마우스의 olfacotory bulb에서 amyloid-beta의 발현량을 정상 대조군 대비 1.70배 증가시켰고, 두충 잎 분획물 40그룹에서는 0.54배 감소하였으며, p-tau의 발현량을 통계적인 차이를 확인할 수 없었다(도 12B-C). 또한 p-IκBα, caspase-1, IL-1β, TNF-α의 발현량은 PM2.5그룹에서 정상 대조군 대비 각각 1.16배, 2.14배, 1.82배, 2.05배 증가시켰고, 두충 잎 분획물 40그룹에서는 PM2.5 그룹 대비 각각 0.55배, 0.51배, 0.53배, 0.60배 감소된 발현량을 나타내었다(도 12D-G).
마우스의 해마 조직은 기억과 학습에 중요한 역할을 하며, 따라서 마우스 해마 조직을 분리하여 아밀로이드 베타 경로 단백질과, 염증 경로에서 나타나는 단백질의 발현량을 측정한 결과는 도 13과 같다. 해마 조직 내에서 amyloid-beta와 p-tau의 발현량은 PM2.5그룹에서 정상 대조군 대비 각각 1.56배, 3.32배 증가되었고, 두충 잎 분획물 40그룹에서 PM2.5 그룹 대비 각각 1.73배, 2.83배로 control과 유사하게 개선되는 것을 확인하였다(도 13B-C). 또한 p-IκBα, caspase-1, IL-1β, TNF-α 인자의 PM2.5그룹에서의 발현량은 정상 대조군 대비 1.84배, 1.65배, 1.50배, 1.93배 증가되었으며, 두충 잎 분획물 40 그룹에서는 PM2.5 그룹 대비 0.65배, 0.62배, 0.67배, 0.61배 감소된 발현량을 나타내었다(도 13D-G).
실시예 9. 두충 잎 추출물의 주요 생리 활성 물질 분석(UPLC Q-TOF/MS 2 analysis)
두충 잎 분획물에 함유되어 있는 생리 활성 물질 분석을 위하여 UPLC Q-TOF/MS2 분석을 실시하였다. 두충 잎 분획물은 100% methanol을 이용하여 용해시킨 뒤, 필터를 이용하여 여과하여 사용하였다. 이는 Acquity UPLC BEH C18 컬럼을 이용하여 음이온 모드에서 분석을 실시하였고, 이동 속도는 0.35 mL/min으로 진행하였다. 이동상 용매는 0.1% formic acid in distilled water (A)와 0.1% formic acid in acetonitrile (B)를 사용하였으며, 1% B at 0-1 min, 1-100% B at 1-7min, 100% B at 7-8 min, 100-1% B at 8-8.2 min, and 1% B at 8.2-10 min 조건으로 용매 구배를 실시하였다.
본 발명에 사용된 두충 잎 분획물에 포함된 생리 활성 물질을 분석하기 위해 UPLC Q-TOF/MS2 분석을 실시하였다(도 14). 확인된 peak은 compound 1: 707 m/z (RT: 2.84 min), compound 2: 609 m/z (RT: 3.15 min), compound 3: 463 m/z (RT: 3.22 min), compound 4: 505 m/z (RT 3.28 min), compound 5: 489 m/z (RT: 3.44 min), compound 6: 301 m/z (RT 3.84 min)으로 나타났으며, 이들은 각각, 5-O-caffeoylquinic acid, rutin, quercetin-O-hexoside, quercetin-O-acetylhexoside (isomer), luteolin-O-acetylhexoside, quercetin으로 확인되었다(표 1).
No. RT
(min) 		Parent Ion
(m/z) 		MS 2
(m/z) 		Compound
1 2.84 707 354, 353 5-O-Caffeoylquinic acid
2 3.15 609 301 Rutin
3 3.22 463 301 Quercetin-O-hexoside
4 3.28 505 301, 300 Quercetin-O-acetylhexoside (isomer)
5 3.44 489 285 Luteolin-O-acetylhexoside
6 3.84 301 179, 151 Quercetin
실시예 10. 통계처리
모든 실험은 반복 실행 후, mean±SD로 나타냈다. 실험 결과의 통계적 유의성은 SAS software (version 9.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 분산분석을 실시하였으며, 각 그룹 간의 유의성은 Duncan의 다중범위검정법 (Duncan’s new multiple-range test)으로 유의차를 5% 수준 (p<0.05)에서 검증하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시 예들을 중심으로 살펴보았다.
본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구 범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (15)

  1. 두충 잎 분획물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능성식품 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 분획물은 물 분획물, n-헥산 분획물, 클로로포름 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물인 것을 특징으로 하는, 초미세먼지로 인한 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능성식품 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 뇌질환은 뇌 신경 질환인 것을 특징으로 하며, 상기 뇌 신경 질환은 뇌졸중, 알츠하이머 병, 치매 및 파킨슨병 중 어느 하나인 것인, 초미세먼지로 인한 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능성식품 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 뇌 조직 내 ABTS 라디칼 소거 활성 또는 DPPH 라디칼 소거 활성이 증가된 것을 특징으로 하는, 초미세먼지로 인한 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능성식품 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 뇌 조직 내 지방질과산화물인 말론디알데히드 (Malondialdehyde, MDA)의 생성을 억제하는 효과를 가지는 것인, 초미세먼지로 인한 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능성식품 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 뇌 조직 내 활성산소(reactive oxygen species, ROS)의 생성을 억제시키는 효과를 가지는 것인, 초미세먼지로 인한 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능성식품 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 뇌 조직 내 세포사멸을 억제시키는 효과를 가지는 것인, 초미세먼지로 인한 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능성식품 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 뇌 조직 내 염증 반응에 대한 조직 보호 효과를 가지는 것인, 초미세먼지로 인한 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능성식품 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 초미세먼지로 인한 공간인지력 저하를 개선시키는 것을 특징으로 하는, 초미세먼지로 인한 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능성식품 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 초미세먼지로 인해 저하된 단기 학습 및 단기 기억력을 개선시키는 것을 특징으로 하는, 초미세먼지로 인한 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능성식품 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 초미세먼지로 인해 저하된 장기 학습 및 장기 기억력을 개선시키는 것을 특징으로 하는, 초미세먼지로 인한 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능성식품 조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 초미세먼지로 인해 뇌 조직에서의 인지기능 저하를 개선시키는 것을 특징으로 하는, 초미세먼지로 인한 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능성식품 조성물.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 초미세먼지로 인한 뇌 조직에서 콜린성 시스템의 기능저하를 개선시키는 것을 특징으로 하는, 초미세먼지로 인한 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능성식품 조성물.
  14. 두충 잎 분획물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에서, 상기 뇌질환은 뇌 신경 질환인 것을 특징으로 하며, 상기 뇌 신경 질환은 뇌졸중, 알츠하이머 병, 치매 및 파킨슨병 중 어느 하나인 것인, 약학적 조성물.
  15. 두충 잎 분획물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 뇌질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물에서, 상기 뇌질환은 뇌 신경 질환인 것을 특징으로 하며, 상기 뇌 신경 질환은 뇌졸중, 알츠하이머 병, 치매 및 파킨슨병 중 어느 하나인 것인, 화장료 조성물.
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