상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 오보바톨(obovatol) 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 아밀로이드 관련 질환의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 아밀로이드 관련 질환은 아밀로이드의 축적, 변성 또는 그로 인한 독성에 의해 유발되는 모든 질환을 포함하나, 바람직하게는 알츠하이머 병, 다운증후군, 인지장애(cognitive disorder), 기억력 감퇴 및 아밀로이드증(amyloidosis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하며, 보다 바람직하게, 알츠하이머 병(Alzheimer disease)인 것을 특징으로 한다 (상기 종래기술 참조).
본 발명에서는, 상기 후박추출물이 베타-아밀로이드 형성에 관여하는 베타와 감마-세크리테이즈(β, γ-secretase) 활성을 억제한다는 사실을 처음으로 밝혀내어 아밀로이드 관련 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있음을 확인하였으며, 실험쥐를 이용한 수중미로(워터-메이지, water maze) 시험, 수동적 회피(패시브-어보 이던스, passive avoidance) 시험 등의 동물실험을 실시하여 후박추출물이 아밀로이드 관련 질환인 알츠하이머 병, 기억력 감퇴, 인지장애 등에 효능이 있음을 확인하였고, 쥐의 해마조직을 이용한 아세틸콜린 분해효소 활성억제 시험을 통하여 아밀로이드 관련 질환 중에서도 알츠하이머 병의 치료 또는 예방에 더욱 효과적임을 추가적으로 확인하였다.
본 발명의 조성물에있어서, 상기 오보바톨 ( 4',5-diallyl-2,3-dihydroxybiphenyl ether, CAS No. 83864-78-2)은 상업적으로 구입할 수도 있으나, 바람직하게는 후박나무(Magnolia officinalis Rehd. et Wils.)로부터 추출 정제한 것을 특징으로 한다. 상기 오보바톨은 후박나무(Magnolia officinalis Rehd. et Wils.)의 잎 혹은 줄기껍질의 한 성분이다. 오보바톨을 함유한 후박은 민간에서 조습소담(操濕消痰), 하기제만(下氣除滿) 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다(생약규격집, 한국의약품수출입협회, 2000).
본 발명의 다른 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 후박나무의 줄기껍질을 물, 에탄올, 메탄올 등의 저급(C1-C4)알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 후박추출물을 얻는 1단계; 상기 후박추출물을 물에 용해시킨 후 헥산, 클로로포름, 초산에틸 등의 비극성 용매를 이용하여 비극성용매 분획물을 얻는 2단계; 상기에서 수득한 비극성용매 분획물을 역상 실리카겔, 순상 실리카겔 등의 충진물을 사용하는 오픈 컬럼을 통하여 활성 분획물을 수득하는 3단계; 상기의 수득한 활성 분획물을 HPLC (high performance liquid chromatography)를 사용하여 오보바톨 화합물을 분리하는 4단계를 통하여 후박나무로부터 아밀로이드 관련 질환의 치료 또 는 예방 활성을 갖는 오보바톨의 정제 방법을 제공한다.
본 발명을 위해 오보바톨은 후박나무로부터 추출할 수 있다. 구체적으로 후박나무 잎과 줄기껍질을 음건, 세절하여 무게(㎏)의 약 2배 내지 20배, 바람직하게는 약 2배 내지 5배의 물, 메탄올 또는 에탄올 등의 저급(C1-C4)알코올의 극성용매 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 에탄올로 0℃ 내지 100℃, 바람직하게는 10℃ 내지 30℃ 추출온도에서 약 1일 내지 15일, 바람직하게는 약 2일 내지 7일 동안 냉침 추출, 환류 냉각 추출, 열수 추출, 초음파 추출 등의 추출방법을 이용하여 수득한 추출액을 여과, 감압농축하여 극성용매에 가용한 조추출물을 수득 가능하다.
추출에 있어 사용되는 추출 용매로서 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 아세톤 등의 비극성용매의 사용이 가능하다. 구체적으로 후박나무 잎과 줄기껍질을 음건, 세절하여 무게(kg)의 약 2 내지 20배, 바람직하게는 약 2배 내지 5배의 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 아세톤 등의 비극성용매 또는 이들의 약 1:1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매로, 바람직하게는 클로로포름을 가하여 25℃에서 약 24시간 냉침 추출, 환류 냉각 추출, 열수 추출, 초음파 추출 등의 추출방법을 이용하여 수득한 추출액을 여과, 감압농축하여 비극성용매에 가용한 조추출물을 수득 가능하다.
또한, 상기 극성 또는 비극성 용매 가용 추출물을 증류수 등으로 수회 분획 및 세척하여 정제한 후에 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있다(Harborne J .B. et al., Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis., 3rd Ed., pp 6-7, 1998). 예를 들어, 상기 정제된 극성 또는 비극성용 매 가용추출물을 감압농축하고, 이 감압농축액을 에틸아세테이트와 물을 넣어 분획하고 유기용매 부분을 모아 감압 농축하였다. 얻어진 용매 분획을 용출용매, 바람직하게는 메탄올과 물(4:1) 혼합용매를 용출용매로 하여 C18 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 용출물을 얻고, 또한, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 용출용매, 바람직하게는 헥산:초산에틸 혼합용매로 수행하여 정제한 후 헥산:초산에탈(9:1-6:4)을 변환시키면서 용출하였다.
고성능액체크로마토그래피(LC-6AD, SHIMATZU사; Shim-Pak prep-ODS column, SHIMATZU사; 자외선분광검출기, λ=254 nm)를 사용하여 활성 성분들은 메탄올:물(4:1)을 용매로 사용하여 오보바톨 화합물을 수득할 수 있다. 그러나 본 발명에 따른 오보바톨을 분리하는 방법은 이에 한정되지 않으며, 후박나무로부터 오보바톨을 분리할 수 있는 방법이라면 모두 사용할 수 있다.
상기 방법에 의해 수득된 후박 추출물은 오보바톨을 포함하며, 오보바톨의 함량은 추출물 총 중량에 대하여 약 5내지 20중량%이다. 바람직하게는 약 15중량%이다.
본 발명의 상기 제조방법으로 얻어진 즉, 후박나무 추출물로부터 분리되거나 화학적으로 합성된 오보바톨을 유효성분으로 함유하는 후박추출물인 것을 특징으로 하는 알츠하이머 병, 다운증후군, 인지장애, 기억력 감퇴, 아밀로이드증 등 아밀로이드 관련 질환의 치료 또는 예방에 유용한 조성물을 제공한다.
또한, 후박나무는 오랫동안 생약 및 식용으로 사용되어 오던 약재로서 이들로부터 추출된 본 발명의 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 역시 독성 등의 부 작용이 없을 것으로 생각된다.
본 발명의 아밀로이드 관련 질환에 대한 예방 또는 치료 효과를 갖는 오보바톨 화합물은 통상의 치환기들의 합성 및 분획 방법을 통하여 합성될 수 있다(Herbert O. House: Modern Synthetic Reactions, 2nd ED., The Benj amin/Cummings Publishing Co., 1972).
본 발명의 오보바톨 또는 이를 포함하는 후박추출물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 무독성염 및 용매화물로 제조될 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 염으로는 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.
이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르 산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르빈산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 포는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
본 발명의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 화합물에 존재할 수 있는 산성 포는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트 (토실레이트) 염이 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.
본 발명은 또한 오보바톨 또는 이를 포함하는 후박추출물과의 프로드럭을 함유한 조성물에 관한 것이다. 프로드럭은 생체 내에서 활성 형태로 변환되는 화합물로, 특정 화합물의 체내 동태를 변경시키거나, 또는 특정 화합물의 약물동태를 변 경시키는데 사용될 수 있다. 프로드럭 및 그의 용도의 예는 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려져 있으며(Berge et al, 'Pharmaceutical Salts', J Pharm. Sci., 1977), 프로드럭은 화합물의 최종 단리 및 정제 동안 현장 제조될 수 있거나 유리산 형으로 정제 화합물과 적절한 유도화제를 별도로 반응시켜 제조될 수 있다.
본 발명의 아밀로이드 관련 질환의 치료 또는 예방 효과를 갖는 약학 조성물은, 조성물 총중량 대비 오보바톨 또는 이를 포함하는 후박추출물을 0.01 내지 50 중량%로 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 화합물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 텍스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트 , 탈크, 마그네숨 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 제조된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 활택제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골(macrogol), 트윈(tween), 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당 업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 0.0001 내지 l00mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지10mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어 떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 화합물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 오보바톨 화합물의 분리 및 정제
건조 및 세절하여 얻은 후박나무 줄기껍질 3kg을 95% 에탄올 9L을 가하여 실온에서 3회 반복 추출한 후 여과하여 얻은 여과액을 감압농축기(EYELA사, N-1000, 일본)로 농축하여 건조된 조추출물 470g을 얻었다. 상기에서 수득한 후박나무 극성용매 가용추출물 200g을 2L 증류수로 현탁시킨 다음, 500ml의 초산에틸을 가하여 용해한 다음, 이를 분별 추출하였다. 이 과정을 2회 반복 수행하고 유기용매에 녹는 부분을 모았다. 유기용매층을 감압농축하여 농축액 180g을 수득하였다. 이 농축액 180g을 500ml의 메탄올에 녹이고 500g의 C18에 흡착시킨 후 메탄올 : 물 = 4 : 1 혼합용액 1L를 사용하여 활성물질 분획을 얻었다. 용리액을 감압 하에서 농축하여 얻은 황갈색의 농축액 100g을 메틸렌클로라이드에 용해시켰다. 실리카겔(머크사, 상품명: 9385) 1kg을 헥산 : 에틸아세테이트 = 9 : 1 혼합 용액을 사용하여 칼럼(4.5x40cm)에 충진 한 후, 활성성분 분획을 실리카겔에 흡착시키고 헥산과 초산에틸의 비율을 9 : 1부터 6 : 4로 변환시키면서 2회의 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 분리하였다. 최종적으로 고성능액체크로마토그래피 (Prep-HPLC; LC-6AD, SHIMATZU사; Capcell-Pak prep-ODS column, SHIMATZU사; 자외선분광검출기, λ=254 nm; 80% 메탄올, 18 ml/min)를 이용하여 오보바톨 화합물 1g을 정제하였다. 도 1은 본 발명의 오보바톨 정제 과정을 개략적으로 나타내는 흐름도이다. 상기 실시예에서 수득한 후박추출물 및 오보바톨의 고성능액체크로마토그래피 (HPLC; LC-6AD, SHIMATZU사; Capcell Pak C18 4.6 X 250mm Shiseido사; 자외선분광검출기, λ=254 nm; 80% 메탄올, 1 ml/min) 스펙트럼을 도 2 내지 도 3 에 나타내었는데, 오보바톨은 상기조건에서 머무른시간(retention time)이 약 6.8-7.1분으로 분석되었다.
실시예 2. 오보바톨의 동정
상기 실시예 1에서 수득한 오보바톨의 구조를 1H-NMR(Varian, GEMINI, 400 MHz), 13C-NMR(Varian, GEMINI, 100 MHz)로 분석하였다. 사용된 용매로는 CDCl3(Chloroform-d, 알드리치사)를 사용하였으며, 내부표준 물질로 트리메칠실란을 사용하여 δ값(ppm)으로 나타내었으며 하기와 같은 물성을 지님을 밝혀냈으며, 이는 이미 발표된 문헌(Kazuo et al., Chem. Pharm. Bull. pp 3347-3353, 1982)과 일치하여 오보바톨임을 확인하였다.
1H-NMR (400MHz, CDCl3), δ 6.28(1H, d, J=1.8Hz, H-4), 6.56(1H, d, J=1.8Hz, H-6), 3.18(2H, d, J=6.6Hz, H-7), 5.97(2H, m, H-8 and H-8'), 5.09(4H, m, H-9 and H-9'), 6.93(2H, d, J=4.3Hz, H-2' and H-6'), 7.14(2H, d, J=4.3Hz, H-3' and H-5'), 3.36(2H, d, J=6.6Hz, H-7')
13C-NMR (100MHz, CDCl3), δ 143(C-1), 132.93(C-2), 144.77(C-3), 110.68(C-4), 132.47(C-5), 111.17(C-6), 39.60(C-7), 137.33(C-8), 115.85(C-9), 154.98(C-1'), 117.84(C-2' and C-6'), 129.82(C-3' and C-5'), 135.18(C-4'), 39.38(C-7'), 137.18(C-8'), 115.75(C-9')
실험예 1. 공간학습능력 평가를 위한 수중미로(워터-메이지, water maze)
상기 실시예 1에 따라 얻은 오보바톨이 스코폴라민(scopolamine) 으로 뇌손상을 유발시킨 실험쥐의 학습능력에 미치는 영향을 평가하기 위해, 기존 문헌에 기재된 수중미로 실험동물 모델을 응용하여 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다(한국보건공정서연구회, 건강기능식품의 기능성식품 가이드, 663-701, 2004; Widy-Tyszkiewicz et al., Biol Pharm Bull, 2002).
5 내지 6주령의 ICR계 수컷 마우스(20-28g)(대한바이오링크, 한국)를 적당한 온도(22±2℃)와 일주기(12시간)를 유지하는 동물실에서 키웠고, 10마리를 1군으로 하여 케이지에서 물과 먹이를 자유 공급하였다. 실험 마우스는 실험 전에 1주일간 순화시켜 사용하였다.
직경 180㎝, 높이가 50㎝인 원통형 수조에 수온이 22±3℃로 조절된 물을 30㎝의 높이로 채웠다. 도피대는 직경이 12㎝인 원형 투명아크릴에 받침대를 부착하고 수면보다 1.5㎝ 낮게 위치하였다. 실험쥐는 하루에 180초간 6일간의 적응훈련(acquisition test)을 받았으며, 7일째 자유수영검사(retention test)를 실시하였는데 이때 실험쥐들은 도피대가 제거된 채로 60초간 수영을 하게 하였다. 모든 실험쥐의 행동은 비디오카메라를 이용해 녹화하여, 실험쥐가 도피대에 올라가는 시간과 거리를 측정하였다.
시험물질은 0.1 ml의 에탄올에 녹였고, 실험동물 몸무게 10g당 0.1ml의 양을 투여하기 위하여 0.1%의 트윈-80(Tween-80)으로 희석하였다. 오보바톨 (0.2, 0.5 및 l mg/kg)은 실험 측정 1시간 전 실험동물에 단회 경구 투여하였다. 비교예로는 스코폴라민만을 처리하였다. 각 군을 평가하여 그 평균값 결과 및 개선률(%)을 하기 표 1과 도 4에 나타내었다.
시료명 |
Escape Distance (㎝) |
개선률 (%) |
대조군 |
448 |
- |
비교예 (스코폴아민1㎎/㎏) |
645 |
0 |
스코폴아민1㎎/㎏+오보바톨 0.2㎎/㎏ |
525 |
60.9 |
스코폴아민1㎎/㎏+오보바톨 0.5㎎/㎏ |
469 |
89.3 |
스코폴아민1㎎/㎏+오보바톨 1.0㎎/㎏ |
380 |
100 |
상기 표 1에 나타나는 바와 같이 스코폴아민만을 처리한 실험쥐는 escape distance(㎝)가 증가한 반면, 스코폴아민과 시험물질인 오보바톨을 동시 처리한 실험쥐의 경우 농도의존적으로 유의성 있게 escape distance가 감소해, 대조군과 유사한 수준으로 개선됨을 확인하였다.
실험예 2. 명시적 기억능력 시험을 위한 수동적 회피(패시브-어보이던스, passive avoidance)
상기 실시예 1에 따라 얻은 오보바톨이 스코폴라민(Scopolamine)으로 뇌손상을 유발시킨 실험쥐의 기억능력에 미치는 영향을 평가하기 위해, 기존 문헌에 기재된 수동적회피(패시브-어보이던스) 실험동물 모델을 응용하여 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다(한국보건공정서연구회, 건강기능식품의 기능성식품가이드 663-701,2004; Rho et al., Biol Pharm Bull, 2005).
수동적 회피를 위한 시험장치는 전기충격발생기와 회피장치로 구성되어있다. 회피상자는 검은 아크릴로 만들어진 어두운 상자(30x30x30㎝)와 동일한 크기의 조명을 가할 수 있는 밝은 구획, 그리고 두 공간 사이를 연결하는 문으로 구성되어 있으며. 어두운 상자의 바닥에는 알미늄막대가 일정한 간격으로 깔려 있어, 이를 통해 동물의 발바닥에 전기충격을 가할 수 있도록 하였다. 실험쥐를 밝은 구획에 위치시킨 후 상자부위에 위치시킨 후 조명을 키고 문을 열어 실험쥐가 어두운 구획으로 들어갈 수 있게 하였다. 이러한 시행을 3회 반복한 후 3번째 시행에는 어두운 곳으로 들어가는 순간 바닥에 깔려있는 알미늄격자를 통해 전기충격(0.1mA, 5초)을 가하였다. 24시간 경과 후 동일한 절차를 사용해 기억검사를 실시한다. 문이 열린 수 어두운 구획으로 들어가는 시간을 측정해 도달 시간이 길수록 학습과 기억이 좋음을 의미한다. 각 군당 3마리를 평가하여 그 평균값 결과 및 개선률(%)을 하기 표 2와 도 5에 나타내었다.
시료명 |
Step through latency (sec) |
개선률 (%) |
대조군 |
580 |
- |
비교예 (스코폴아민1㎎/㎏) |
310 |
0 |
스코폴아민1㎎/㎏+오보바톨 0.2㎎/㎏ |
331 |
7.8 |
스코폴아민1㎎/㎏+오보바톨 0.5㎎/㎏ |
450 |
51.9 |
스코폴아민1㎎/㎏+오보바톨 1.0 ㎎/㎏ |
562 |
93.3 |
상기 표 2에 나타나는 바와 같이, 스코폴라민만을 처리할 경우 step through latency(sec)가 감소한 반면, 스코폴아민과 함께 시험물질인 오보바톨을 동시 투여할 경우 농도의존적으로 step through latency(sec)가 증가하여 대조군과 유사하게 개선됨을 확인하였다.
실험예 3. 아세틸콜린 에스테라제(Acetylcholinesterase) 활성억제
행동약리 실험 후 생쥐의 뇌에서 해마(hippocampus)를 분리한 뒤 RO-PREP 단백질 추출 용액(Protein Extraction Solution, iNtRON Bio-tech)으로 균질 분쇄하고 4℃에서 15,000rpm으로 2시간 원심분리하여 상등액만 취하고, 최종 추출물의 단백질양을 Bio-Rad 단백질 분석 키트(Bio-Rad)를 사용하여 측정하였다. 아세틸콜린 에스테라제 활성은 Ellman 방법을 변형하여 실시하였다.
96 웰 플레이트에 세포 용해물(cell lysate)을 웰당 10㎕씩 넣고 반응 완충액[0.01% DTNB, 0.02% 아세틸티오콜린(Acetylthiocholine) 및 0.1mM isoOMPA를 포함하는 50 mM Tris-HCl(pH 8.0, 0.1M NaCl, 20 mM MgCl2)]를 190㎕ 넣고 37℃에서 5 분간 405nm 1차 측정하였다. 반응 10분 후 405nm에서 2차 측정하였다. 아세틸티오콜린 에스테라제 검량은 시료 대신 아세틸콜린 에스테라제를 농도 별로 넣고 표준 완충액[0.01 % DTNB 및 0.02% 0.1mM isoOMPA를 포함하는 50 mM Tris-HCl(pH 8.0, 0.1M NaCl, 20 mM MgCl2)]을 처리하여 5 분간 37℃에서 405nm 측정하였다. 시료에 1차와 2차 흡광도 차이에 대한 단위시간 당 변화를 검량선에 대입하여 활성도로 나타내었다. 3번 평가하여 평균값 결과와 개선률(%)은 하기 표 3와 도 6에 나타냈다.
시료명 |
효소활성도 |
개선률 (%) |
대조군 |
15 |
- |
비교예 (스코폴아민1㎎/㎏) |
23 |
0 |
스코폴아민1㎎/㎏+오보바톨 0.2㎎/㎏ |
19 |
50.0 |
스코폴아민1㎎/㎏+오보바톨 0.5㎎/㎏ |
17 |
75.0 |
스코폴아민1㎎/㎏+오보바톨1.0 ㎎/㎏ |
16 |
87.5 |
상기 표 3에 나타나는 바와 같이, 스코폴라민만을 처리할 경우 효소활성도가 증가된 반면 스코폴아민과 함께 시험물질인 오보바톨을 동시 처리할 경우 농도 의존적으로 효소활성도가 감소되어 유의성 있게 대조군과 유사한 수준으로 개선됨을 확인하였다.
실험예 4. 베타-세크리테이즈(β-secretase) 활성억제
행동약리 실험 후 생쥐의 뇌의 해마(hippocampus)을 분리해 PRO-PREP 단백질 추출 용액(iNtRON Bio technology co., Ltd)으로 균질 분쇄하고 4℃에서 15,000rpm로 2시간 원심분리하여 상등액만 취하고, 최종 추출물의 단백질양을 Bio-rad 단백질 분석 키트(Bio-rad Co.)를 사용하여 측정하였다. BACE1 FRET 분석 키트(PANVERA)를 이용하여 β-세크리테이즈를 정량 하였다. 96 웰 플레이트에 세포 용해물(cell lysate)을 웰당 10㎕씩 넣고 BACE1 기질(substrate) (Rh-EVNLDAEFK-Quencher)를 10㎕를 가하고 실온에서 1 시간 반응시킨 다음, BACE1 종결 완충액(stop buffer, 2.5M 소디움 아세테이트) 10㎕를 넣어 반응을 종료시켰다. 형성된 형광(fluorescence)을 형광 마이크로플레이트 리더(fluorescent microplate reader)를 이용해 여기(excitation) 545nm, 발광(emission) 585nm에서 측정하였다. 3번 수행하여 그 평균값 결과와 개선률(%)을 하기 표 4와 도 7에 나타냈다.
시료명 |
효소활성도 |
개선률 (%) |
대조군 |
113 |
- |
비교예 (베타-아밀로이드1㎎/㎏) |
431 |
0 |
베타-아밀로이드 1㎎/㎏+오보바톨 0.2㎎/㎏ |
345 |
27.0 |
베타-아밀로이드 1㎎/㎏+오보바톨 0.5㎎/㎏ |
222 |
65.7 |
베타-아밀로이드 1㎎/㎏+오보바톨 1.0 ㎎/㎏ |
215 |
67.9 |
상기 표 4에 나타나는 바와 같이, 베타-아밀로이드(β-amyloid)만을 처리할 경우 효소활성도가 증가되었고, 베타-아밀로이드와 함께 시험물질인 후박추출물 또는 오보바톨을 투여할 경우 농도 의존적으로 효소활성도가 감소되어, 유의성있게 개선됨을 확인하였다.
실험예 5. 감마-세크리테이즈(γ-secretase) 활성억제
행동약리 실험 후 생쥐의 뇌의 해마(hippocampus)와 피질(cortex)을 분리해 PRO-PREP 단백질 추출 용액(iNtRON Bio technology Co., Ltd)으로 균질 분쇄하고 4℃에서 15,000rpm로 2시간 원심분리하여 상등액만 취하고, 최종 추출물의 단백질양을 Bio-rad 단백질 분석 키트(Bio-rad Co.)를 사용하여 측정하여 1㎎/㎖으로 조정하였다. γ-세크리테이즈 활성 키트(γ-Secretase Activity Kit, R&D systems)를 이용하여 γ-세크리테이즈를 정량하였다. 96 웰 플레이트에 세포 용해물을 50㎕/웰 넣고 2시간 반응 완충액 50㎕를 첨가하였다. 기질 5㎕를 넣어 조심스럽게 잘 섞어 준 후 빛을 차단한 상태에서 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 그 후 형광 마이크로플레이트 리더(fluorescent microplate reader)를 이용하여 여기(excitation) 355nm, 발광(emission) 510nm에서 측정하였다. 3번 측정하여 그 평균값 결과 및 개선률(%)를 하기 표 5와 도 8에 나타내었다.
시료명 |
효소활성도 |
개선률 (%) |
대조군 |
32 |
- |
비교예 (베타-아밀로이드1㎎/㎏) |
42 |
0 |
베타-아밀로이드 1㎎/㎏+오보바톨 0.2㎎/㎏ |
35 |
70.0 |
베타-아밀로이드 1㎎/㎏+오보바톨 0.5㎎/㎏ |
35 |
70.0 |
베타-아밀로이드 1㎎/㎏+오보바톨 1.0㎎/㎏ |
35 |
70.0 |
상기 표 5에 나타나는 바와 같이, 베타-아밀로이드만을 처리할 경우 효소활성도가 증가되었다가, 베타-아밀로이드와 함께 시험물질인 오보바톨을 투여할 경우 효소활성도가 다시 감소하여 대조군과 유사한 정도로 개선됨을 확인하였다.
본 발명의 오보바톨을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제
원 료 |
함 량 |
함 량 |
오보바톨 화합물 |
300 mg |
- |
후박 추출물 |
- |
300 mg |
유당 |
100 mg |
100 mg |
탈크 |
10 mg |
10 mg |
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제
원 료 |
함 량 |
함 량 |
오보바톨 화합물 |
50 mg |
- |
후박 추출물 |
- |
50 mg |
옥수수전분 |
100 mg |
100 mg |
유당 |
100 mg |
100 mg |
스테아린산 마그네슘 |
2 mg |
2 mg |
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캡슐제
원 료 |
함 량 |
함 량 |
오보바톨 화합물 |
50 mg |
- |
후박 추출물 |
- |
50 mg |
옥수수전분 |
100 mg |
100 mg |
유당 |
100 mg |
100 mg |
스테아린산 마그네슘 |
2 mg |
2 mg |
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 켑슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제
원 료 |
함 량 |
함 량 |
오보바톨 화합물 |
50 mg |
- |
후박 추출물 |
- |
50 mg |
주사용 멸균 증류수 |
적량 |
적량 |
pH 조절제 |
적량 |
적량 |
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제
원 료 |
함 량 |
함 량 |
오보바톨 화합물 |
100 mg |
- |
후박 추출물 |
- |
100 mg |
이성화당 |
10 g |
10 g |
만니톨 |
5 g |
5 g |
정제수 |
적량 |
적량 |
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.