KR101784294B1 - 모과 추출물을 포함하는 뇌신경질환 예방 또는 치료용 의약 조성물 - Google Patents
모과 추출물을 포함하는 뇌신경질환 예방 또는 치료용 의약 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 모과 추출물로부터 분리된 스테아린산(stearic acid, methyl ester)의 뇌신경질환 예방, 치료 또는 개선용 용도를 제공한다. 이들 성분은 우수한 콜린아세틸트랜스퍼라제(ChAT)의 활성화 효과를 나타낸다. 따라서, 이들을 유효성분으로 포함하는 조성물은 알츠하이머병(Alzheimer’s disease; AD), 치매(dementia) 및 퇴행성 뇌질환 등의 다양한 질환을 효과적으로 예방, 치료 또는 개선하기 위해 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 모과 추출물로부터 분리된 스테아린산(stearic acid, methyl ester)을 유효성분으로 포함하는 뇌신경질환 예방 또는 치료용 의약 조성물에 관한 것이다.
알츠하이머 병(Alzheimer's disease, AD)은 중추신경, 특히 전뇌(forebrain), 소뇌편도(amygdala), 해마(hippocampus) 및 대뇌피질 같은 피질과 변연계(limbic system)의 신경을 파괴하는데, 이들은 뇌에서 학습, 기억, 사고, 행동, 감정조절 등과 관련된 부위이다.
콜린아세틸트랜스퍼라제(ChAT)는 뇌에서 뇌신경 세포 신호 전달 물질인 아세틸콜린(ACh)의 생성을 활성화시켜주는 인자로 알려져 있으며, 학습, 기억력 등과 같은 신경정신적적(neuropsychic) 기능에 관여하는 콜린성 뉴론의 기능 상태를 모니터하는 가장 특이적인 인디케이터이다. 알츠하이머 병 환자의 뇌에서는 ChAT의 양이 급격히 감소되는 것을 볼 수 있고, ChAT의 활성이 감소되면서 아세틸콜린(ACh)의 농도가 현저하게 감소되어 있다. 이에 따라, 뇌에서의 ChAT의 농도를 높게 유지시키면 환자의 기억력, 인지능력이 크게 회복된다고 보고된 바 있다.
현재 ChAT의 활성을 증진시켜주기 위해 신경성장인자(nerve growth factor, NGF)나 신경영양물질(neurotrophin)을 투여하기 위한 연구도 진행 중이지만, 이는 drug delivery에서 문제점을 갖고 있다. 인간의 뇌는 뇌막(blood brain-barrier)으로 보호를 받고 있는데, 이 막은 선택적 투과성을 나타내므로 분자량이 큰 물질 (예: 단백질, 지방 등등)의 투과가 쉽지 않으므로 뇌막을 투과할 수 있는 저분자 물질을 탐색하여 drug delivery의 문제점을 해결해야 하는 필요성이 있다.
또한, 현재까지 보고된 항치매 활성화 성분은 주로 식물유래 저분자 및 합성 물질로써 인지적 증상을 호전시키기 위한 약물인 ChEIs를 많이 사용되고 있다. 제1세대 ChEIs로서 최초로 항치매 작용에 있어 적용 승인을 받은 tacrine은 작용지속 기간이 짧아 하루 4번 투여해야 하며, 간 독성이 있어 monitoring의 번거로움이 있다. 최근 주목받고 있는 제2세대 ChEIs로는 donepezil로 하루 한번 복용할 수 있고, 선택적인 저해로 말초 부작용을 줄였으며, Rivastigmine은 하루 2번 복용이 가능하고 중추신경계에 특이성이 높아 말초 부작용을 크게 감소시켰고, 신장에서 대사되므로 간 독성이 거의 없는 것으로 보고되고 있으며, Metrifonate은 치매환자에 3상 임상실험이 진행 중이며, 비가역적인 AChEIs로서 작용기간이 길다. 또한, 항치매 활성화 성분으로 ChAT activator가 있지만 ChEIs처럼 많은 물질들이 개발되어 있지는 않고 현재 FDA 승인 약품은 없는 실정이다.
따라서, 여러 천연물을 이용하여 부작용이 적고 그 효과가 우수한 ChAT 활성화능을 갖는 약제 및 기능성 소재를 개발할 필요가 있으며, ChAT 활성화 기능을 갖는 저분자성 미량 원소들은 뇌 기능향상 및 치매 예방제로 기능성 식품 및 보조요법제의 소재로 사용될 수 있다.
농촌진흥청 연구과제, 송경식 외 3명, 2011, 식물 추출물을 이용한 기억력 증진 및 퇴행성 뇌질환 개선 제품 개발
본 발명은 식용생물자원으로부터 콜린아세틸트랜스퍼라제(ChAT)를 활성화할 수 있는, 즉 뇌신경질환을 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 개발하여, 이를 포함하는 뇌신경질환 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 뇌신경질환 예방 또는 치료용 의약 조성물을 식용생물자원으로부터 정제하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
이를 위해, 본 발명자들은 오랫동안 식품으로 이용되어온 식용생물자원들을 대상으로 콜린아세틸트랜스퍼라제(ChAT)를 활성화할 수 있는지 연구한 결과, 모과 추출물로부터 분리된 스테아린산(stearic acid, methyl ester)이 이러한 효과를 나타냄을 확인하였다.
따라서, 본 발명에서는 모과 추출물로부터 분리된 하기 화학식 1의 스테아린산(stearic acid, methyl ester)을 유효성분으로 포함하는 뇌신경질환 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
본 발명의 모과 추출물의 제조 시에는 건조 또는 미건조시킨 모과 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 추출의 효율성을 위해 모과는 잘게 부수어 사용할 수 있다. 또한, 효과적인 뇌신경질환 예방 또는 치료용 모과 추출물을 얻기 위해, 모과의 분쇄 전에 약 100℃의 높은 온도에서 약 5분간 블랜칭(blanching)을 수행하여 세포 내 효소를 불활성화시키는 과정을 거칠 수 있다.
본 발명에서 모과 추출물의 제조를 위해서는 모과의 3 내지 10 배의 추출 용매를 사용하여 통상적인 추출방법에 따라 추출할 수 있다.
추출 용매로는 천연물 추출에서 널리 이용되고 있는 물, 유기 용매 또는 이들의 혼합 용매를 이용할 수 있다. 상기 유기 용매로는 에탄올, 메탄올, 헥산, 클로로포름 및 에탈아세테이트 등이 포함된다. 이러한 유기 용매는 물과 혼합하여 사용할 수 있으나, 활성 성분의 용이한 용출을 위해서 물과 혼합하지 않고 사용할 수도 있다. 한 구체예에서, 상기 모과 추출물은 에탄올 추출물일 수 있다.
상기 모과 추출물은 1차 추출에서 사용된 유기 용매와는 극성이 다른 유기 용매를 사용하여 추가로 분획할 수 있다. 이 경우, 상기 모과 추출물은 모과를 유기용매로 추출하고, 그 잔사를 극성이 다른 유기용매를 이용하여 분획함으로써 수득한 모과 추출물 분획일 수 있다.
또한, 상기 모과 추출물 또는 모과 추출물 분획에 대해 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel columnchromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography) 및 고성능 액체 크로마토그래피(highperformance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 정제함으로써 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다. 본 발명에 있어서, '모과 추출물'은 이와 같이 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 모과 추출물은 모과를 에탄올로 추출하고, 그 잔사를 헥산, 클로로포름 및 에틸아세테이트로 순차적으로 분획하여 얻은 에틸아세테이트 분획일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 모과 추출물은 모과를 에탄올로 추출하고, 그 잔사를 헥산, 클로로포름 및 에틸아세테이트로 순차적으로 분획하여 얻은 에틸아세테이트 분획에 대해 클로로포름과 에탄올의 혼합 용매를 전개용매로 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 얻은 분획 중 클로로포름 : 에탄올 = 100:0 ~ 0:100의 전개용매조건에서 얻은 모과 추출물 분획일 수 있다.
상기 수득한 모과 추출물 분획에 대해 컬럼크로마토그래피를 반복적으로 수행하거나 TLC(thin layerchromatography) 또는 HPLC(high performance liquid chromatography)를 수행하여 추가로 정제된 모과 추출물 분획을 얻을 수도 있다.
하기 실시예에서는 이러한 추가적인 정제과정을 통해 모과 추출물로부터 뇌신경질환의 예방 또는 치료 활성을 나타내는 활성성분이 스테아린산(stearic acid, methyl ester)임을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 스테아린산(stearic acid, methyl ester)을 함유하는 모과 추출물을 유효성분으로 포함하는 뇌신경질환 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한
1) 모과를 유기용매, 물 또는 이들의 혼합용매로 추출하고, 그 잔사를 헥산, 클로로포름 및 에틸아세테이트를 이용하여 순차적으로 분획하여 에틸아세테이트 분획을 얻는 단계; 및
2) 상기 단계 1)로부터 얻은 에틸아세테이트 분획에 대해 클로로포름과 에탄올의 혼합 용매를 전개용매로 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 얻은 분획 중 클로로포름 : 에탄올 = 100:0 ~ 0:100의 전개용매 조건에서 모과 추출물 분획을 얻는 단계; 및
3) 상기 단계 2)로부터 얻은 모과 추출물 분획에 대해 HPLC(high performance liquid chromatography)를 수행하여 하기 화학식 1의 스테아린산(stearic acid, methyl ester)을 정제하는 단계를 추가로 포함하는 모과 추출물 분획의 정제 방법을 제공한다.
[화학식 1]
본 발명의 하기 실시예에서는, 모과를 100% 에탄올로 추출하여 얻은 잔사를, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트의 순으로 분획하여 모과 추출물 분획을 제조하였다. 또한, 상기 모과 추출물 분획 중 에틸아세테이트 분획을 추가로 분획하고 정제하였다. 이러한 과정을 통해 얻은 본 발명의 모과 추출물, 모과 추출물 분획 및 스테아린산(stearic acid, methyl ester)은 우수한 콜린아세틸트랜스퍼라제(ChAT)를 활성화 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 모과 추출물, 모과 추출물 분획 및 스테아린산(stearic acid, methyl ester)은 뇌신경질환 예방 또는 치료의 유효 성분으로 포함될 수 있다.
본 발명의 뇌신경질환 예방 또는 치료용 조성물은, 특히 콜린아세틸트랜스퍼라제(ChAT)를 활성화시키며, 상기 콜린아세틸트랜스퍼라제(ChAT)의 활성이 감소됨에 따라 발생하는 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 모과 추출물로부터 분리된 스테아린산(stearic acid, methyl ester)은 저분자 물질로써 뇌막 투과성이 우수하여 기존의 drug delivery 문제점을 해결할 수 있다. 예를 들어, 상기 모과 추출물로부터 분리된 스테아린산(stearic acid, methyl ester)의 분자량은 ~ 내지 ~m/z, ~ 내지 ~m/z 또는 284.48 m/z일 수 있다.
상기 콜린아세틸트랜스퍼라제(ChAT)의 활성이 감소됨에 따라 발생하는 질환은 이에 제한되는 것은 아니나, 알츠하이머병(Alzheimer’s disease; AD), 치매(dementia) 및 퇴행성 뇌질환 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 질환일 수 있다.
상기 조성물은 본 발명의 유효 성분뿐만 아니라 기존에 공지된 뇌신경질환 예방 또는 치료제와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 모과 추출물로부터 분리된 스테아린산(stearic acid, methyl ester)을 유효 성분으로 포함하는 의약 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 의약 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 의약 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 상기 의약 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 모과 추출물로부터 분리된 스테아린산(stearic acid, methyl ester)을 포함하는 뇌신경질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 뇌신경질환 예방 또는 개선용 식품 조성물은 전술한 의약 조성물과 같이, 콜린아세틸트랜스퍼라제(ChAT)의 활성이 감소됨에 따라 발생하는 뇌신경질환의 예방 또는 개선에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 의약 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.
또한 본 발명은 포유동물에게 치료상 유효량의 모과 추출물로부터 분리된 스테아린산(stearic acid, methyl ester)을 투여하는 것을 포함하는 뇌신경질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다. 여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 모과 추출물로부터 분리된 스테아린산(stearic acid, methyl ester)을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.001㎎/kg 내지 10㎎/kg, 예를 들어, 0.01㎎/kg 내지 1㎎/kg 의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 치료방법에서 본 발명의 모과 추출물로부터 분리된 스테아린산(stearic acid, methyl ester)을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
본 발명은 모과 추출물로부터 분리된 스테아린산(stearic acid, methyl ester)의 뇌신경질환 예방, 치료 또는 개선용 용도를 제공한다. 이들 성분은 우수한 콜린아세틸트랜스퍼라제(ChAT)의 활성화 효과를 나타낸다. 따라서, 이들을 유효성분으로 포함하는 조성물은 알츠하이머병(Alzheimer’s disease; AD), 치매(dementia) 및 퇴행성 뇌질환 등의 다양한 질환을 효과적으로 예방, 치료 또는 개선하기 위해 사용될 수 있다.
도 1은 모과로부터 본 발명의 활성성분을 분리 및 정제하기 위한 공정을 간략하게 도식화하여 설명한 순서도이다.
도 2는 모과의 유기용매 분획에 따른 ChAT 활성을 비교한 그래프이다.
도 3은 오픈 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의한 본 발명의 활성성분의 분획물별 ChAT 활성화 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 모과의 TLC 에 의한 본 발명의 활성성분의 분획물별 ChAT 활성화 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 최종 활성 물질인 스테아린산(stearic acid, methyl ester)의 HPLC를 이용한 정제 확인을 나타낸 크로마토그램이다.
도 6은 모과에서 분리된 스테아린산(stearic acid, methyl ester)의 투여량 의존적 ChAT 활성을 나타내고 상업적 스테아린산과 비교한 그래프이다.
도 7은 TMT-유발된 학습 및 기억력 손상된 마우스에 대한 모과 추출물의 방어 효과를 나타내는 그래프이다(Y-maze test).
도 8은 TMT-유발된 학습 및 기억력 손상된 마우스에 대한 모과 추출물의 방어 효과를 나타내는 그래프이다(passive avoidance test).
도 9는 TMT-유발된 학습 및 기억력 손상된 마우스에 대한 스테아린산(stearic acid, methyl ester)의 방어 효과를 나타내는 그래프이다(Y-maze test).
도 10은 TMT-유발된 학습 및 기억력 손상된 마우스에 대한 스테아린산(stearic acid, methyl ester)의 방어 효과를 나타내는 그래프이다(passive avoidance test).
도 2는 모과의 유기용매 분획에 따른 ChAT 활성을 비교한 그래프이다.
도 3은 오픈 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의한 본 발명의 활성성분의 분획물별 ChAT 활성화 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 모과의 TLC 에 의한 본 발명의 활성성분의 분획물별 ChAT 활성화 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 최종 활성 물질인 스테아린산(stearic acid, methyl ester)의 HPLC를 이용한 정제 확인을 나타낸 크로마토그램이다.
도 6은 모과에서 분리된 스테아린산(stearic acid, methyl ester)의 투여량 의존적 ChAT 활성을 나타내고 상업적 스테아린산과 비교한 그래프이다.
도 7은 TMT-유발된 학습 및 기억력 손상된 마우스에 대한 모과 추출물의 방어 효과를 나타내는 그래프이다(Y-maze test).
도 8은 TMT-유발된 학습 및 기억력 손상된 마우스에 대한 모과 추출물의 방어 효과를 나타내는 그래프이다(passive avoidance test).
도 9는 TMT-유발된 학습 및 기억력 손상된 마우스에 대한 스테아린산(stearic acid, methyl ester)의 방어 효과를 나타내는 그래프이다(Y-maze test).
도 10은 TMT-유발된 학습 및 기억력 손상된 마우스에 대한 스테아린산(stearic acid, methyl ester)의 방어 효과를 나타내는 그래프이다(passive avoidance test).
본 발명은 이들의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법을 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명의 청구항의 범위에 의해 정의될 뿐이다.
실시예
1: 모과 추출물의 제조 및
ChAT
활성화능
측정
3 kg의 건조 모과를 99.5% 에탄올에 24 시간 동안 실온에서 진탕하여 용해시켰다. 결과의 에탄올 추출물을 Whatman 여과지로 여과시켰다. 상기 추출 과정은 5회 반복하였다. 상기 추출물을 40℃에서 감압하에 rotary evaporator(EYELA)에서 농축시켰다. 상기 모과 추출물 (또는 후술하는 분획 및 정제물) 의 ChAT 활성화능을 측정하기 위하여, Choline acetyltrasferase를 생성해 내는 MC-IXC cell(human brain neuroblastoma cell)을 culture dish 에 키운 후 85%~90% confluent가 일어났을 때 cell을 Trypsin-EDTA를 처리하여 cell을 dish에서 제거한 후 cell lysis buffer(0.5%Triton X-100, 10 mM MgCl2, 150 mM NaCl, pH 7.5)를 넣고 균질화(homogenizate) 하였다. 상기 균질화물을 원심분리후 얻어진 상등액(enzyme source)을 ChAT 활성화능 측정에 사용하였다. 상기 상등액과 시약 (50mM K-포스페이트 버퍼, 0.1 mM 에세린, 8 mM 염화 콜린, 25 M coenzyme A [acetyl-1-14C])을 혼합한 후 37℃에서 1 h동안 인큐베이션하였다. 상기 반응을 소디움 테트라페닐보레이트를 첨가하여 종료시켰다. 상기 반응 결과로 형성된 [14C] 아세틸콜린을 liquid scintillation counter를 사용하여 카운트하여 ChAT 활성화능을 결정하였다. ChAT 활성화능을 구하는 공식은 다음과 같다.
Activity (%) = [(sample reaction enzyme reaction) / enzyme reaction] ×100
수십 여종의 식용 식물자원의 에탄올 추출물을 상기 ChAT 활성 측정 방법을 이용하여 그 활성도를 검색하였다. 그 결과 모과 (24.3%)가 가장 높은 활성을 보였으며, cell enzyme을 이용하여 ChAT 활성도를 검색한 결과 모과의 에탄올 추출물이 가장 높은 활성을 보였다.
실시예
2: 모과 추출물로부터
ChAT
활성화 지방산(
스테아린산
)의 정제
(1) 순차적 유기용매
분획화
모과 추출물로부터 ChAT 활성물질을 분리하기 위해, 우선 상기 실시예 1에서 얻은 모과 에탄올 추출물을 극성에 따라 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 순으로 유기용매를 이용하여 분획하였다.
도 1은 모과로부터 본 발명의 활성물질을 획득하기 위한 유기용매를 이용한 분획의 순서도이다. 클로로포름 분획이 가장 현저한 ChAT 활성을 나타냈으므로, ChAT 활성물질을 얻기 위해 상기 클로로포름 분획을 다음의 방법에 따라 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 이용하여 분리, 정제하였다.
도 2는 모과의 유기용매 분획에 따른 ChAT 활성을 비교한 그래프이다. 샘플 농도는 0.25 mg/mL이었고, ChAT 활성화능 값은 평균 ± S.E (n=3)으로 나타냈다. (P. C: positive control of daidzein, H1~3: n-헥산 layers, C4~6; 클로로포름 layers, E7~9; 에틸아세테이트 layers)
(2) 실리카겔
컬럼크로마토그래피
270.55 g의 실리카겔을 클로로포름을 갖는 유리컬럼(5×43 cm)에 패킹시켰다. 상기 가장 높은 ChAT 활성화능을 갖는 클로로포름 분획을 40℃에서 증발시켜 농축한 샘플 (10.822 g)을 클로로포름에 용해시켰다. 샘플을 3.3 mL/min의 유속으로 클로로포름 및 에탄올 (CHCl3:EtOH = 100:0 ①②③, 90:10 ①②③, 80:20 ①②③, 70:30 ①②③, 60:40 ①②③, 50:50 ①②③, 40:60 ①②③, 30:70 ①②③, 20:80 ①②③, 10:90 ①②③, 0:100 ①②③)로 구성된 단계적용출법(stepwise gradient)에 의해 분리시켰다. 용매의 bed volume은 650 mL이었다. 33개의 분획을 수거하여 ChAT 활성화 효과를 시험하였다.
도 3은 오픈 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의한 본 발명의 활성성분의 분획물별 ChAT 활성화 효과를 나타낸 그래프이다. 각 샘플의 농도는 0.25 mg/mL이었고, ChAT 활성화능 값은 평균 ± S.E (n=3)로 나타냈다. 그 결과, 21번째 분획인 CHCl3:MeOH = 40:60 ③ (v/v)에서 가장 높은 628%의 활성을 보였다.
(3) TLC(Thin layer chromatography)
가장 높은 ChAT 활성화 효과를 보인 CHCl3:MeOH = 40:60 ③ (v/v) 분획을 가지고 단일 물질을 분리 해내기 위하여 클로로포름/에탄올 (40:60, v/v) 용매로 TLC(thin layer chromatography) 에서 전개시켰다. 상기 TLC plate를 가시광 및 자외선(254 and 360 nm) 하에 가시화하여 Rf 값을 측정하였다. 상기 TLC plate로 부터 각각의 band를 긁어 에탄올로 우려내어 40℃에서 증발을 실시 한 다음 ChAT 활성화능을 측정하였다.
도 4는 TLC 에 의한 본 발명의 활성성분의 분획물별 ChAT 활성화 효과를 나타낸 그래프이다. 각 샘플의 농도는 0.25 mg/mL이었고, ChAT 활성화능 값은 평균 ± S.E (n=3)로 나타냈다. 그 결과 Rf value가 0.37, 0.53, 0.77 특히 0.77인 band가 가장 높은 활성을 나타내었고 이를 다시 45℃에서 증발을 실시하였다.
(4)
HPLC
(high pressure liquid chromatography)
가장 높은 ChAT 활성화능를 나타낸 TLC 밴드로부터 활성 물질을 분리 해내기 위하여 HPLC 를 실시하였다. μ-bondapakTM C18 column (3.9 × 300 mm)을 이용하여 0.5 ml/min의 속도로 0 내지 100%의 에탄올을 90분 linear gradient elution을 통하여 200nm부터 800nm에서 스캐닝 하였고 injection volume은 20 ㎕로 하였다.
도 5는 본 발명의 최종 활성 물질인 스테아린산(stearic acid, methyl ester)의 HPLC를 이용한 정제 확인을 나타낸 크로마토그램이이며, 210 nm, 1.268 min에서 가장 높은 피크가 검출되었다.
(5) 최종 활성물질(
스테아린산
)의 동정
최종 활성물질을 확인하기 위해 도 5의 가장 높은 피크를 농축하여 EI-MS(Electron ionization) spectroscopy와 NMR(Nuclear Magnetic Resonance) spectroscopy를 실시하였다. EI-MS spectroscopy를 위하여, HPLC에서 나온 피크를 농축하여 메탄올에 용해시키고, positive ion EI mass spectrometer (JMS AX505WA, JEOL, Japan)상에서 스펙트럼을 기록하였다. EI-MS 스펙트럼에서 피크가 관찰되었으며, 그 활성성분의 분자량은 284.48 m/z 로 밝혀졌다.
13C-NMR spectroscopy를 위하여, HPLC에서 나온 피크를 농축하여 MeOD (methyl-d3 alcohol-dl)에 용해시키고, 600 MHz 및 25℃에서 작동하는 high resolution NMR spectrometer (Avance-600, Bruker, German)상에서 스펙트럼을 기록하였다.
1H-NMR spectroscopy를 위하여, HPLC에서 나온 피크를 농축하여 MeOD (methyl-d3 alcohol-dl)에 용해시키고, 600 MHz 및 25℃에서 작동하는 high resolution NMR spectrometer (Avance-600, Bruker, German)상에서 스펙트럼을 기록하였다. 1H/13C-NMR 스펙트럼은 분자내 탄소 핵의 frequency 패턴을 포함하며 근접한 원자의 proximity 및 connectivity를 반영한다. 1H/13C-NMR 화학이동(chemical shifts)를 이용하여 상기 활성성분의 화학구조를 예측하였다.
상기 실험 결과, 본 발명의 최종 활성물질은 분자량이 284.48 m/z정도의 지방산인 상기 화학식 1의 스테아린산 (stearic acid, methyl ester)으로 확인되었다.
실시예
3: 상업적 화합물(
stearic
acid, methyl ester)의
ChAT
활성화능
시험
상기와 같이 모과에서 분리된 최종 활성물질인 스테아린산 (stearic acid, methyl ester)을 상업적으로 구입하여 농도 의존적으로 처리하고, Positive control인 Daidaein과 ChAT에 대한 활성화 효과가 동일한지를 확인하기 위해, ChAT 활성화 효과를 비교하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, 상업적 화합물과 Daidaein의 ChAT 활성화능을 비교했을때, 이들 활성은 0.001 M 농도의 스테아린산(stearic acid, methyl ester)에서 유사하였다(도 6). 이는 모과로부터 분리된 스테아린산(stearic acid, methyl ester)의 ChAT 활성화 효과가 Positive control인 Daidaein의 ChAT 활성화 효과와 동일함을 보여준다.
실시예
4: 모과 추출물로부터 in
vivo
behavioral test
ChAT 활성능을 갖는 최종물질인 스테아린산(stearic acid, methyl ester)을 함유한 모과 에탄올 추출물을 가지고 마우스를 대상으로 in vivo behavioral test를 실시하였다. 즉, 마우스를 이용하여 기억 및 학습능력을 저해하는 약물(trimethyltin)을 투여하여 인위적으로 기억 및 학습능력 저하를 유발한 후 본 발명의 활성물질을 투여하여 그 효과를 검정하였다(Y-maze test 및 Passive Avoidance Test). ICR-male mouse를 1주 적응기간 후에 인지(cognitive) 기능 측정에 사용하였다. 마우스를 각 군당 8마리씩 5개 군으로 나누었다. 하기 표 1은 각 실험군당 조성을 나타낸다. 모과(Chinese quince Koehne.)의 에탄올 추출물을 400, 800 및 1200 (mg/kg B.W)의 농도로 물과 혼합하였다. 마우스는 28일간 사료와 물에 자유롭게 접근하도록 하였다.
실험군 | 조성 |
Group C | Normal control mice, supplied with water |
Group t | Inject with TMT, supplied with water |
Group C400 | Inject with TMT, supplied with ethanol extract of Chaenomeies sinensis Koehne (400mg/kg, day) |
Group C800 | Inject with TMT, supplied with ethanol extract of Chaenomeies sinensis Koehne (800mg/kg, day) |
Group C1200 | Inject with TMT, supplied with ethanol extract of Chaenomeies sinensis Koehne (1200mg/kg, day) |
즉시 공간 작업 기억력의 측정으로 간주되는 자발적 교대 행동(spontaneous alternation behavior)을 Y-maze test를 통해 평가하였다. 모든 실험군에서 entries 개수의 큰 차이가 발견되지 않았다. 이는 TMT 처리가 모든 마우스에서 로코모터 능력에 영향을 주지 않았음을 보여준다. 도 7에 나타난 바와 같이, TMT 만으로 처리된 마우스는 정상 대조군 에 비해 현저히 감소된, 약 50%의 교대 행동을 나타냈다. 그러나, 모과 추출물이 처리된 마우스는 TMT 대조군에 비해 약 15% 내지 17% 증가된 교대 행동을 나타냈다. 도 7은 TMT-유발된 학습 및 기억력 손상된 마우스에 대한 모과 추출물의 방어 효과를 나타내는 그래프이며, Y축은 Alternative behavior (%)이다.
도 8에 나타난 바와 같이, 수동적 회피 수행(passive avoidance performance)에서는, TMT 대조군 마우스가 정상 대조군에 비해 retention trials에서 현저히 짧은 latency times (step through latency의 268.18초의 감소)을 보여주었다. 그러나, 28일간 모과 추출물을 처리한 경우 수동적 회피 수행이 현저히 개선되었다. 즉, TMT-대조군에 비해 step through latency가 약 50.17초, 114초 내지 256.3초 증가하였다. Retention time의 증가는 TMT-유발된 기억력 손상의 완화를 초래하였다.
도 8은 TMT-유발된 학습 및 기억력 손상된 마우스에 대한 모과 추출물의 방어 효과를 나타내는 그래프이며, Y축은 수동적 회피 수행의 retention trial에서 step-through latency(sec)를 나타낸다.
상기 실험결과로부터, 본 발명의 모과 추출물이 기억 및 학습능력의 회복 및 인지 장애의 예방에 효과가 있음을 알 수 있다.
실시예
5: 모과 추출물부터 분리된
스테아린산
(
stearic
acid, methyl ester) in
vivo
behavioral test
ChAT 활성능을 갖는 최종물질인 모과 추출물로부터 분리된 스테아린산(stearic acid, methyl ester)을 가지고 마우스를 대상으로 in vivo behavioral test를 실시하였다. 즉, 마우스를 이용하여 기억 및 학습능력을 저해하는 약물(trimethyltin)을 투여하여 인위적으로 기억 및 학습능력 저하를 유발한 후 본 발명의 활성물질을 투여하여 그 효과를 검정하였다(Y-maze test 및 Passive Avoidance Test). ICR-male mouse를 1주 적응기간 후에 인지(cognitive) 기능 측정에 사용하였다. 마우스를 각 군당 8마리씩 5개 군으로 나누었다. 하기 표 2은 각 실험군당 조성을 나타낸다. 스테아린산(stearic acid, methyl ester)을 5, 10, 20 및 40 (mg/kg B.W)의 농도로 물과 혼합하였다. 마우스는 28일간 사료와 물에 자유롭게 접근하도록 하였다.
실험군 | 조성 |
Group C | Normal control mice, supplied with water |
Group t | Inject with TMT, supplied with water |
Group SAME5 | Inject with TMT, supplied with stearic acid, methyl ester (5mg/kg, day) |
Group SAME10 | Inject with TMT, supplied with stearic acid, methyl ester (10mg/kg, day) |
Group SAME20 | Inject with TMT, supplied with stearic acid, methyl ester (20mg/kg, day) |
Group SAME40 | Inject with TMT, supplied with stearic acid, methyl ester (40mg/kg, day) |
즉시 공간 작업 기억력의 측정으로 간주되는 자발적 교대 행동(spontaneous alternation behavior)을 Y-maze test를 통해 평가하였다. 모든 실험군에서 entries 개수의 큰 차이가 발견되지 않았다. 이는 TMT 처리가 모든 마우스에서 로코모터 능력에 영향을 주지 않았음을 보여준다. 도 9에 나타난 바와 같이, TMT 만으로 처리된 마우스는 정상 대조군 에 비해 현저히 감소된, 약 37%의 교대 행동을 나타냈다. 그러나, 스테아린산(stearic acid, methyl ester) 이 처리된 마우스는 TMT 대조군에 비해 약 24% 내지 30% 증가된 교대 행동을 나타냈다. 도 9는 TMT-유발된 학습 및 기억력 손상된 마우스에 대한 스테아린산(stearic acid, methyl ester)의 방어 효과를 나타내는 그래프이며, Y축은 Alternative behavior (%)이다.
도 10에 나타난 바와 같이, 수동적 회피 수행(passive avoidance performance)에서는, TMT 대조군 마우스가 정상 대조군에 비해 retention trials에서 현저히 짧은 latency times (step through latency의 107.24초의 감소)을 보여주었다. 그러나, 28일간 스테아린산(stearic acid, methyl ester)을 처리한 경우 수동적 회피 수행이 현저히 개선되었다. 즉, TMT-대조군에 비해 step through latency가 약 71초, 87초, 157초 내지 240초 증가하였다. Retention time의 중가는 TMT-유발된 기억력 손상의 완화를 초래하였다.
도 10은 TMT-유발된 학습 및 기억력 손상된 마우스에 대한 스테아린산(stearic acid, methyl ester)의 방어 효과를 나타내는 그래프이며, Y축은 수동적 회피 수행의 retention trial에서 step-through latency (sec)를 나타낸다.
상기 실험결과로부터, 본 발명의 스테아린산(stearic acid, methyl ester)이 기억 및 학습능력의 회복 및 인지 장애의 예방에 효과가 있음을 알 수 있다.
Claims (7)
- 삭제
- 제 3 항에 있어서, 뇌신경질환은 알츠하이머 병(Alzheimer’s disease; AD), 치매(dementia) 및 퇴행성 뇌질환으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 뇌신경질환 예방 또는 치료용 의약 조성물.
- 삭제
- 1) 모과를 유기용매, 물 또는 이들의 혼합용매로 추출하고, 그 잔사를 헥산, 클로로포름 및 에틸아세테이트를 이용하여 순차적으로 분획하여 클로로포름 분획을 얻는 단계; 및
2) 상기 단계 1)로부터 얻은 클로로포름 분획에 대해 클로로포름과 에탄올의 혼합 용매를 전개용매로 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 얻은 분획 중 클로로포름 : 에탄올 = 100:0 ~ 0:100의 전개용매 조건에서 모과 추출물 분획을 얻는 단계; 및
3) 상기 단계 2)로부터 얻은 모과 추출물 분획에 대해 HPLC(high performance liquid chromatography)를 수행하여 하기 화학식 1의 스테아린산 메틸에스테르(stearic acid, methyl ester)을 정제하는 단계를 추가로 포함하는 모과 추출물 분획의 정제 방법.
[화학식 1]
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KR20220063978A (ko) | 2020-11-11 | 2022-05-18 | 박노흥 | 파인애플을 이용한 엉겅퀴와 솔잎, 마늘, 양파, 머위, 모과, 석류, 백하수오, 민들레, 은행 발효물의 제조방법 |
-
2015
- 2015-06-30 KR KR1020150093772A patent/KR101784294B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
Title |
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Translational stroke Research, 2014, vol. 5, no. 1, pp. 109~117* |
농촌진흥청 연구과제, 송경식 외 3명, 2011, PJ007102, 식물 추출물을 이용한 기억력 증진 및 퇴행성 뇌질환 개선 제품 개발* |
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