JP6735347B2

JP6735347B2 - フキの葉抽出物を含む記憶力改善用組成物

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Publication number: JP6735347B2
Application number: JP2018534843A
Authority: JP
Inventors: ミュンソクオウ; ミンサンキム; キョンワンウー; サンスパク
Original assignee: ネイチャーバイオカンパニーリミテッド
Priority date: 2016-06-08
Filing date: 2016-10-26
Publication date: 2020-08-05
Anticipated expiration: 2036-10-26
Also published as: JP2019501181A; CN108472325B; CN108472325A; KR101689656B1; WO2017213306A1

Description

本発明は、記憶力改善効果を有するフキの葉抽出物の製造方法、及びフキの葉抽出物を含む記憶力改善用組成物に関する。

記憶力の改善と関連する研究は、主に生薬などの天然物から抽出したり、複合抽出物を用いたりするもので、動物実験において一定の部分の認知能力の改善を示したが、僅かなレベルの改善効果を示すという限界があり、確実な機転や作用部位が明らかになっていない実験結果に依存する場合が多く、生薬を用いた単一の抽出物や漢方医学処方箋に基づいた複合抽出物は、実際に毒性を含んでおり、多量摂取時に肝毒性を引き起こすなどの問題があった。また、フキ抽出物を製造するための既存の研究は、有機溶媒であるエタノール、ヘキサン、ブタノールを連続して使用する抽出過程が含まれることで、過程毎に溶媒を除去するために減圧濃縮を行う方法を用いているが、このような過程は、長時間を必要とし、複雑な過程でミスが発生する可能性が高く、抽出過程でヘキサン、ブタノールなどの人体に有毒な化学物質を使用するため、別途の抽出施設が必要であるだけでなく、有効成分の収率が１％程度と非常に低いため、経済性が低下するという欠点がある。

関連先行技術（韓国登録特許第１０−０５３５６５５号）は、アルコールを用いて抽出した抗酸化活性を有するフキ抽出物、並びにそれを含有する脳疾患の予防及び治療用抗酸化剤に関して記載しているが、フキの葉から神経細胞の保護効果を示す成分のみを最適に抽出する製造方法の開発が要求されており、そこで、本発明者らは、フキの葉を単なる水抽出やエタノール抽出ではなく、水抽出後に凍結乾燥し、その後、エタノール沈殿物を製造する方法を通じて、海馬の神経細胞を直接的に保護する効果を示す成分を収得するようになり、経口投与を介して、代謝後に脳組織にまで直接的に作用することができ、毒性がないため、長期的に摂取する場合にも副作用がないように開発するようになった。

本発明の目的は、（ａ）フキの葉に水を添加して抽出するステップと；（ｂ）前記フキの葉の抽出物を凍結乾燥するステップと；（ｃ）前記フキの葉の抽出物の凍結乾燥物にエタノールを添加した後、沈殿させるステップと；（ｄ）前記（ｃ）ステップを通じて得た沈殿物の上層液を除去し、沈殿物を凍結乾燥するステップとを含むフキの葉抽出物を製造する方法を提供することである。

本発明は、上記目的を達成するために、（ａ）フキの葉に水を添加して抽出するステップと；（ｂ）前記フキの葉の抽出物を凍結乾燥するステップと；（ｃ）前記フキの葉の抽出物の凍結乾燥物にエタノールを添加した後、沈殿させるステップと；（ｄ）前記（ｃ）ステップを通じて得た沈殿物の上層液を除去し、沈殿物を凍結乾燥するステップとを含むフキの葉抽出物を製造する方法を提供する。

前記（ｃ）ステップにおいて、エタノールは５０〜８０％エタノールであることを特徴とし、常温で２０〜３０時間沈殿させることを特徴とする。

本発明において、前記フキの葉抽出物は、記憶力改善能を有し、３，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸（３，５−ｄｉ−Ｏ−ｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃａｃｉｄ）、４，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸（４，５−ｄｉ−Ｏ−ｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃａｃｉｄ）、３，４−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸（３，４−ｄｉ−Ｏ−ｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃａｃｉｄ）、及び６，７−ジヒドロキシ−４−（３，４−ジヒドロキシフェニル）ナフタレン−２−カルボン酸（６，７−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−４−（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ）で構成された群から選択される成分を含むことを特徴とすることができる。

本発明はまた、前記方法で得られたフキの葉抽出物を含む記憶力改善用薬学組成物及び記憶力改善用健康機能食品を提供する。

前記薬学組成物は、神経細胞の保護及び再生効果を有することを特徴とし、経口、皮下、静脈内、筋肉内、鼻腔内、または腹腔内に投与されることを特徴とすることができ、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、シロップ剤、液剤、乳剤、懸濁剤、または注射剤の形態に製造されることを特徴とすることができる。また、前記健康機能食品は、神経細胞の保護及び再生効果を有することを特徴とし、担体、希釈剤、賦形剤、及び添加剤のうち１つ以上をさらに含むことによって、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤及び液剤の剤形からなる群から選択された１つの剤形に剤形されたことを特徴とすることができる。

本発明において、前記薬学組成物または健康機能食品は、３，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸（３，５−ｄｉ−Ｏ−ｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃａｃｉｄ）、４，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸（４，５−ｄｉ−Ｏ−ｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃａｃｉｄ）、３，４−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸（３，４−ｄｉ−Ｏ−ｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃａｃｉｄ）、及び６，７−ジヒドロキシ−４−（３，４−ジヒドロキシフェニル）ナフタレン−２−カルボン酸（６，７−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−４−（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ）で構成された群から選択される成分を含むことを特徴とすることができる。

既存の水抽出や酒精抽出を介したフキの葉抽出物には、フキの葉の様々な成分が共に抽出されるため、神経細胞の保護効果を示す成分のみを効果的に抽出するのに限界があった。

本発明において、フキの葉を水抽出した後、凍結乾燥するステップを経ないと、エタノールにフキの葉水抽出物の不要な成分が溶けなくなる。エタノールは、５０〜８０％エタノールである場合に不要な成分が良好に溶けるようになり、特に、エタノール７０％でフキの葉水抽出凍結乾燥品の不要な成分が良好に溶けるようになり、不要な成分が溶けている上層部を除去し、沈殿物のみを回収して、有用なフキの葉抽出物を獲得することができる。本発明によれば、フキの葉を水抽出するステップ、凍結乾燥するステップ、エタノール抽出するステップを順次経ることによって、フキの葉の不要な成分を効果的に除去し、有用な成分のみを回収して、神経細胞の保護効果を奏するフキの葉抽出物を収得できるようになる。

本発明に係る記憶力改善用健康機能食品は、担体、希釈剤、賦形剤、及び添加剤のうち１つ以上をさらに含むことによって、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤、及び液剤の剤形からなる群から選択された１つに剤形されたことを特徴とする。本発明の抽出物を添加できる食品としては、各種食品類、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、シロップ剤、飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤、健康機能性食品類などがある。前記本発明にさらに含み得る添加剤としては、天然炭水化物、香味剤、栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、風味剤（合成風味剤、天然風味剤など）、着色剤、充填剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、酸化防止剤、グリセリン、アルコール、炭酸化剤、及び果肉からなる群から選択された１種以上の成分を使用することができる。上述した天然炭水化物の例は、モノサッカライド、例えば、ブドウ糖、果糖など；ジサッカライド、例えば、マルトース、シュクロースなど；ポリサッカライド、例えば、デキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖、及びキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。前記香味剤として、天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウディオサイドＡ）、グリチルリチンなど）、及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を有利に使用することができる。

前記以外に、本発明に係る組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤、充填剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有することができる。それ以外に、本発明に係る組成物は、天然果物ジュース及び野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。このような成分は、独立して、または組み合わせて使用することができる。

前記担体、賦形剤、希釈剤、及び添加剤の具体例としては、これに限定するものではないが、ラクトース、デキストローズ、スクロース、ソルビトール、マンニトール、エリスリトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、メチルセルロース、水、砂糖シロップ、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルからなる群から選択された１種以上が使用されることが好ましい。

本発明に係る記憶力改善用健康機能食品を製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤、または賦形剤を使用して調製される。前記上述した剤形中の有効成分としての本発明に係る抽出物の含量は、使用の形態及び目的、患者の状態、症状の種類及び軽重などに応じて適宜調節することができ、固形分重量を基準として、０．００１〜９９．９重量％、好ましくは０．０１〜５０重量％であってもよいが、これに限定されない。

一方、フキ（一般名：Ｂｕｔｔｅｒｂｕｒ、又は、学名：Ｐｅｔａｓｉｔｅｓｊａｐｏｎｉｃｕｓ）は、ヨーロッパだけでなく、アジアの一部及び北米で発見される多年生潅木である。フキの根及び葉から分離した抽出物は、２０００年以上にわたり治療剤の用途に使用されてきた。今日、フキ抽出物は、筋肉を弛緩するのに主に使用され、胃腸内腹痛、平滑筋の痙攣のような状態の時に処置し、痛み緩和効果があり、また、頭痛にも使用できると報告された（ＥａｔｏｎＪ．，ＴｏｗｎｓｅｎｄＬｅｔｔ，２０００，２０２，１０４−１０６）。また、フキは、喘息及びアレルギー性疾患に対して治療効果があると報告されている（ＴｈｏｍｅｔＯＡ，ＳｉｍｏｎＨＵ，ＩｎｔＡｒｃｈＡｌｌｅｒｇｙＩｍｍｕｎｏｌ，２００２，１２９（２），１０８−１２）。

本発明に係る製造方法で得られたフキの葉抽出物は、神経細胞の保護及び再生において優れた効果を奏する。

フキの葉抽出物による細胞生存率を示した図である。ＫＰ−１の濃度別の投与による細胞毒性の結果を示した図である。ＫＰ−１の濃度別の投与による神経細胞の保護効果を示した図である。ＫＰ−１の１次分離物Ｆ１〜Ｆ８の細胞生存率を示した図である。ＫＰ−１の２次分離物ｆ３〜ｆ１１の細胞生存率を示した図である。ＫＰ−１の濃度別の投与による記憶力改善の効果を確認した図である。実験マウスの海馬組織の組織損傷の有無及び回復の有無を観察した図である。ＫＰ−１の濃度別の投与による海馬組織の組織再生及び保護効果を確認した図である。単なる水抽出、エタノール抽出において神経細胞の保護効果が現れないことを確認した図である。

以下、実施例を参照して本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明なことであろう。

［実施例１］

フキの葉抽出物（ＫＰ−１）の製造、及び細胞毒性と神経細胞の保護効果の確認

フキの葉１ｋｇに２０倍数の水を添加して抽出した後、抽出物を凍結乾燥させて、凍結乾燥品２５０ｇを収得した（フキの葉対比２５％）。その後、フキの葉水抽出凍結乾燥品に７０％エタノールを添加し、常温で２４時間溶出させた。２４時間経過後、不要な物質が溶解している上層部を除去し、フキの葉抽出物のみが残っている沈殿物を回収して凍結乾燥して、凍結乾燥品１５０ｇを収得した（水抽出凍結乾燥品対比６０％）。最終収得率は、使用されたフキの葉対比１５％、フキの葉水抽出凍結乾燥品対比６０％に該当した。下記の表１のように、フキの葉の抽出方法によるサンプルを作製し、細胞毒性と神経細胞の保護効果を確認した。その結果、サンプル４で最も優れた効果を示しており、これをＫＰ−１と命名した（図１）。

記憶力を主管する海馬の細胞組織であるＨＴ２２細胞は、９６ウェル細胞培養プレート（１×１０^４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）に１０％ＦＢＳ（熱−非活性）、１％ＰＳが含有されたＤＭＥＭ培地で２４時間培養した後、試料のみを処理（細胞毒性）したり、試料及びＡβ毒性を処理（神経保護効能）し、３７℃で１２時間培養した後、３−（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ＤｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍＢｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）溶液を入れ、２時間反応させた後、５７０ｎｍでの吸光度を測定して評価した。ＫＰ−１の濃度別の投与を通じた細胞毒性を確認した結果、毒性を示さないことを確認した（図２）。また、ＫＰ−１の濃度別の投与を通じた神経細胞の保護効果を確認した結果、ＫＰ−１３００μｇ／ｍｌで８０％以上の細胞生存率を示した（図３）。

［実施例２］

フキの葉抽出物（ＫＰ−１）の有効成分の確認

ＫＰ−１の有効成分を探索するために、レジンＤＩＡＩＯＮＨＰ−２０を用いて、ＫＰ−１をＦ１〜Ｆ８に分離した後、最も高い細胞生存率を示すＦ４をＫＰ−１Ｆ４と命名した（図４）。ＫＰ−１Ｆ４をＳＥＰＨＡＤＥＸＬＨ２でｆ１〜ｆ１１まで２次分離した。その結果、ｆ１及びｆ２は、予備実験で活性を示さず、ｆ９及びｆ１１で７５％以上の細胞生存率を示した（図５）。ｆ９及びｆ１１を、ＬＣ−ＭＡＳＳ及びＮＭＲを通じて有効成分を精製した。ｆ９の成分は、下記化学式１〜３であり、ｆ１１の成分は、下記化学式４であるものと確認された：

３，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸（３，５−ｄｉ−Ｏ−ｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃａｃｉｄ）

４，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸（４，５−ｄｉ−Ｏ−ｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃａｃｉｄ）

３，４−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸（３，４−ｄｉ−Ｏ−ｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃａｃｉｄ）

６，７−ジヒドロキシ−４−（３，４−ジヒドロキシフェニル）ナフタレン−２−カルボン酸（６，７−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−４−（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ）

［実施例３］

フキの葉抽出物の記憶力改善効果の確認

ＩＣＲマウス（ｍａｌｅ、７週齢）を１週間の純化及び飼育を経て使用した。本実験の飼育環境は、温度２０〜２４℃、相対湿度５０〜６０％、換気回数１５回／ｈ、照明時間ｌｉｇｈｔ＆ｄａｒｋｓｙｓｔｅｍ１２時間（０７：００〜１９：００）、照度１５０〜２００Ｌｕｘに設定された所で飼育し、マウス用固形飼料と水は自由に摂取するようにした。米国国立保健院（ＮＩＨ、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ）で提示した基準（Ｎｏ．８６−２３、ｒｅｖｉｓｅｄ１９８５）を遵守した慶煕大学校の動物飼育規定に従って飼育した。

Ａβ誘導アルツハイマー型痴呆モデルでのフキの葉抽出物の記憶力改善効能を確認するために、受動回避実験を行った。マウスの明るい所から暗い所に行こうとする習性を用いて、暗い所に電気的衝撃を加える装置を用いた。箱を仕切りを用いて２区画に区分し、動物が暗い区画に移動するとすぐに０．５ｍＡの電流を底のステンレスグリッドを介して３秒間流して電気衝撃を加え、マウスが照明が点灯している区画に移動した後、入口が閉じられるまでの時間（レイテンシータイム：ｌａｔｅｎｃｙｔｉｍｅ）を測定した（獲得試行：Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎｔｒｉａｌ）。２４時間後、再び明るい区域に位置させたとき、暗い区画に入るまでの時間を測定し、測定時間は最大５分とした（保持試行：Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎｔｒｉａｌ）。その結果、フキの葉抽出物を投与した場合に、有意的な記憶力改善効果が奏されることを確認した。図６に示されたように、ＫＰ−１を３μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ投与した場合のいずれも有意的な記憶力改善効果を奏した（（ａ）正常対照群：フキ試料の代わりに生理食塩水を経口投与しながら記憶力減退を誘導していない群、（ｂ）Ａβ誘導記憶力減退対照群：フキ試料の代わりに生理食塩水を経口投与しながらＡβを定位注入（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）して記憶力減退を誘導した群、（ｃ）陽性対照群：ドネペジル（ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ）を経口投与しながらＡβを定位注入（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）して認知機能を低下させた群、（ｄ）フキ投与群：フキ試料を経口投与しながらＡβを定位注入（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）して認知機能を低下させた群）。

［実施例４］

脳組織内の海馬細胞の活性の確認

動物実験の結果、フキの葉抽出物が記憶力改善効果を奏することを確認したが、さらに客観的な効能を確認するために、動物行動実験マウスの海馬組織をスライスした後、組織損傷の有無及び回復の有無を客観的に観察した。海馬細胞のＣＡ１部位の組織切片をＰＢＳで洗浄した後、クレシルバイオレット（ｃｒｅｓｙｌｖｉｏｌｅｔ）試薬と反応させ、組織の脱水及び透明化過程を経た後、顕微鏡で観察した（クレシルバイオレット染色）。組織切片を０．６％過酸化水素とＰＢＳで洗浄した後、１０％正常血清（ｎｏｒｍａｌｓｅｒｕｍ）と１次抗体を４℃で一晩反応させた後、再び１時間の間、３７℃で２次抗体を反応させ、ＡＢＣ発色とＤＡＢ発色過程を経た後、顕微鏡で観察した（免疫組織化学染色）（図７）。組織染色の結果を定量化した結果、ＫＰ−１を３μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ投与した場合のいずれも、有意的に海馬組織内のＣＡ１部位で組織再生及び保護効果が奏されることを確認した（図８）。

［比較例］

フキの葉を単に水抽出、エタノール抽出した場合に、フキの葉抽出物が神経細胞の保護効果を奏するかを実験した結果、フキの葉の様々な成分が共に抽出されてしまい、効果的に組織に浸透しないため、神経細胞の保護効果を奏することができなかった（図９）。

Claims

（ａ）フキの葉に水を添加して抽出するステップと、
（ｂ）前記フキの葉の抽出物を凍結乾燥するステップと、
（ｃ）前記フキの葉の抽出物の凍結乾燥物にエタノールを添加して溶出させ、前記フキの葉の抽出物を沈殿させるステップと、
（ｄ）前記（ｃ）ステップを通じて得た沈殿物の上層液を除去し、沈殿物を凍結乾燥するステップとを含む、フキの葉抽出物を製造する方法。
前記エタノールは、５０〜８０％エタノールであることを特徴とする、請求項１に記載のフキの葉抽出物を製造する方法。
前記（ｃ）ステップは、常温で２０〜３０時間沈殿させることを特徴とする、請求項１に記載のフキの葉抽出物を製造する方法。
前記フキの葉抽出物は記憶力改善能を有することを特徴とする、請求項１に記載のフキの葉抽出物を製造する方法。
前記フキの葉抽出物は、３，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸（３，５−ｄｉ−Ｏ−ｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃａｃｉｄ）、４，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸（４，５−ｄｉ−Ｏ−ｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃａｃｉｄ）、３，４−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸（３，４−ｄｉ−Ｏ−ｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃａｃｉｄ）、及び６，７−ジヒドロキシ−４−（３，４−ジヒドロキシフェニル）ナフタレン−２−カルボン酸（６，７−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−４−（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ）で構成された群から選択される成分を含むことを特徴とする、請求項４に記載のフキの葉抽出物を製造する方法。