KR100535655B1 - 신경세포 보호 효과 및 항산화 활성을 갖는 머위 추출물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항산화 활성을 갖는 머위 추출물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 알코올을 이용하여 추출한 항산화 활성을 갖는 머위 추출물 및 상기 추출물을 유효성분으로 함유하는 뇌질환 예방 및 치료용 항산화제에 관한 것이다. 본 발명의 머위 추출물은 항산화 활성이 뛰어나고, 신경독성 완화 및 뇌신경세포 보호작용이 뛰어나 파킨슨병, 알츠하이머병, 루게릭병, 허혈성 뇌졸중 또는 퇴행성 척추손상과 같은 뇌질환을 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신경세포 보호 효과 및 항산화 활성을 갖는 머위 추출물{Extract of Petasites japonicus having neuroprotective effect and antioxidant activity}

본 발명은 머위 추출물 및 이를 함유하는 뇌질환 예방 또는 치료용 항산화제에 관한 것이다.

최근 생활수준이 향상됨에 따라 평균수명이 연장되고 노년인구가 차지하는 비중이 높아지고 있다. 한국인의 사망 원인을 살펴보면 뇌졸중, 치매, 정신장애 및 행동장애와 같은 뇌질환이 암 및 순환기계질환 다음으로 높은 사망원인을 차지하며, 단일 장기의 질환으로 볼 때 가장 높은 사망원인이다(한국통계연감, 성 연령계층별 사인별 사망자수, 1996). 대표적인 뇌질환으로는 알츠하이머병 (Alzheimer's disease, AD)(Furuta, A. et al., Am. J. Pathol., 1995, 146, 357-367;Good, D.F. et al., Am. J. Pathol., 1996, 149(1), 21-28), 다발성 경화증(Multiple sclerosis, MS)(Takeda, A. et al., Neuroscience letters, 1996, 21, 17-20), 루게릭병(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)(Rosen. D.R. et al., Nature, 1993, 362, 59-62), 파킨슨병(Parkinson's disease, PD)(Bowling, A.C. and Beal, M.F., Life Sci., 1995, 56(14), 1151-1171), 뇌졸중(stroke), 허혈장애(ischemia) 등이 있는데, 특히 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중 등을 비롯한 노인성 뇌 질환은 뇌세포 내에서의 라디칼 형성을 수반하는 산화적 스트레스가 주요한 병인에 해당한다(Smith, M.A., J. Neurochem., 1997, Supp. Sl, 69, 19).

산화적 스트레스는 세포나 조직이 독성 자유 라디칼(toxic free radical)에 의해 손상되는 것을 의미하는 것으로 산화적 스트레스에 의한 신경 세포의 손상(neuronal damage)은 정상적인 노화 과정중에 발생하는 뇌세포의 손상과 알츠하이머병, 파킨슨병, 루게릭병, 치매 등 뇌신경조직의 퇴행성 질환 (neurodegenerative disease)에 관련하는 것으로 알려져 있다(Good, D.F. et al., Am. J. Pathol., 1996, 149(1), 21-28; Bowling, A.C. and Beal, M.F., Life Sci., 1995, 56(14), 1151-1171; Smith, M.A., J. Neurochem., 69, 1997, Supp. Sl, 19). 뇌 조직에서는 당을 산화시켜 ATP를 얻는데 다량의 산소를 소비한다. 성인의 경우 분당 100 g의 뇌 조직에 대해 3.5 ㎖의 산소를 소비하며, 뇌 무게는 체중의 2% 밖에 되지 않으나 산소 소비량은 전체의 20%를 차지하기 때문에 뇌 조직내 산소의 분압이 높아지게 된다. 뇌 조직내 산소 분압이 높아지게 되면 글루타메이트 디카복실라제(glutamate decarboxylase)의 활성이 감소되거나 산소 자유 라디칼 형성이 증가하여 경련이 유도된다(Halliwell, B., and Gutteridge, J. M. C., Free Radicals in Biology and Medicine, 1989, 2nd Ed, Clarendon Press, Oxford). 특히, 뇌조직은 자유 라디칼 공격에 대해서 민감한 것으로 알려져 있는데, 이러한 이유는 뇌 신경세포에는 방어 메커니즘이 충분하지 못하며 산화되기 쉬운 다가불포화지방산(long chain unsaturated fatty acids)이 고농도로 존재하고, 라디칼 형성시 촉매로 이용되는 금속이온(Fe²⁺, Cu²⁺) 등이 존재하기 때문이다.

포유동물의 신경계 중에서 흥분성 아미노산 신경계(excitatory amino acids system, EAAs system)가 과다흥분되면 간질(epilepsy), 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중, 정신 장애(trauma) 등의 질환이 유발되는데, 이러한 질환의 유발에는 자유 라디칼의 증가에 기인하는 산화적 스트레스가 관여한다(Rosen. D.R. et al., Nature, 1993, 362, 59-62; Pellegrini-Giampietro, D.E. et al., J. Neurosci, 1990, 10, 1035-1041). 흥분성 아미노산 신경계를 활성화시켜 뇌 손상을 일으키는 물질을 흥분성 신경독(excitotoxins)이라 부르며, 이들에 의해 과도하게 흥분된 흥분성 아미노산 신경계는 신경세포 내의 이온의 유입과 자유 라디칼 생성을 유도하여 신경세포의 손상을 일으킨다. 흥분성 아미노산 신경계의 글루카메이트 수용체는 일종의 리간드-게이트된(ligand-gated) 이온 채널로서 이 수용체는 길항제의 선택성에 따라서 NMDA(N-methyl-D-aspartate), AMPA(α-amino-4-isoxazole-propionic acid), 카이닉산(kainic acid, KA) 수용체로 구분된다. 이들 수용체의 과도한 흥분은 신경세포의 손상을 초래하며, NMDA 수용체가 과도하게 흥분되면 Ca²⁺ 의 유입으로 세포 구성성분인 지질, 단백질 및 핵산의 분해를 초래하는 반면에, 비-NMDA 수용체가 과도하게 흥분되면 Na⁺의 유입으로 인해 신경세포의 용적증가(swelling)를 초래한다. 아울러 비-NMDA 수용체인 카이닉산 수용체가 활성화되는 경우에도 많은 활성산소종(reactive oxygen species, 이하 "ROS"라 약칭함)의 생성을 통해 뇌신경세포의 손상이 유발된다(Olney, J. W. et al., Brain Res, 1974, 77, 507-512). 카이닉산은 강한 중추신경계의 흥분성 신경독으로 수시간 또는 수일간 지속되는 급성 또는 아급성 간질형(epileptiform) 활성을 나타내며 궁극적으로는 신경세포 뿐 아니라 신경교(glia), 마이엘린 수초(myelin sheaths)등에서 비가역적인 신경병리학적 변화를 초래한다(Sperk, G., Prog. Neurobiol, 1994, 42, 1-32). 이외에 카이닉산은 뇌 손상을 직접적으로 유도할 뿐 아니라 아울러 뇌 독성을 나타낼 수 있는 정도의 글루타메이트 양을 방출한다(Roberts, J. C. and Francetic, D. J., Anal. Biochem, 1993, 211, 183-187). 이처럼 카이닉산에 의해 유도된 신경세포 사멸(neuronal death)은 ROS의 생성으로 인한 세포막의 파괴에 기인되며 이러한 신경세포 독성은 항산화제의 투여에 의해 보호된다(Coyle, J. T., and Puttfarcken, P. Science, 1993, 262, 689-695).

최근 뇌에서 선택적으로 산화적 스트레스를 유발하는 물질에 대한 연구가 활발히 진행되면서 아울러 산화적 스트레스의 보호제에 대한 연구 또한 활발히 진행되고 있다. ROS에 대해 세포내 존재하는 보호물질로는 글루타치온 (glutathione)(Roberts, J. C. and Francetic, D. J. Anal. Biochem, 1993, 211, 183-187; Raymond C. et al., J. Nutr., 1995, 125, 3062-3070; Marcos M. et al., J. Mechanisms of ageing and development, 1995, 84, 77-81), α-토코페롤(α-tocopherol)(Hoekstra, W. G., Fed. Proc., 1975, 34, 2083-2089; Kormbrist, D. J. and Movis, R. D., Lipids, 1980, 15, 315-322; Tappel, A. L., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1980, 355, 18-31; Reddy C. C. et al., Life Sci., 1982, 31, 571-576), 비타민 A(Ernster, L. and Nordenbrand, K., Methods in Enzymology, 1967, 10, 574-580), 비타민 C(Rustia, M., J. Natl. Cancer Inst., 1975, 55, 1389-1393), 셀레늄(selenium)(Hoekstra, W. G. Fed. Proc., 1975, 34, 2083-2089) 등이 있으며, 항산화 효소계로는 SOD(McCord and Fridovich, J. Biol. Chem., 1969, 224, 6049-6055), 카탈라제(catalase), 글루타치온 퍼옥시다제(glutathione peroxidase)(Roberts, J. C. and Francetic, D. J., Anal. Biochem., 1993, 211, 183-187; Tappel, A.L. Methods in Enzymology, 1978, 52, 506-523), 글루타치온 S-트랜스퍼라제(glutathione S-transferase)(Roberts, J. C. and Francetic, D. J., Anal. Biochem., 1993, 211, 183-187; Burk, R. F. et al., Biochem. Biophys. Acta., 1980, 618, 35-41), 글루타치온 리덕타제(glutathione reductase)(Tietze, F., Anal. Biochem., 1969, 27, 502-522; Floreani M, et al., FASEB J., 1997, 11, 1309-1315; Phillis, J.W., Prog. Neurobiol., 1994, 42, 441-448), 퀴논 리덕타제(quinone reductase)(Prestera, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 2969) 등이 있다.

현재까지 세포내에서 생성되는 산소 라디칼에 대한 항산화 보호측면에서 여러가지 천연 항산화제의 효과가 보고되었는데 주로 한약재나 식품성분의 항산화 기능에 관한 것으로, 간 조직에 관한 연구가 대부분이며 뇌 조직의 항산화에 관련된 연구는 매우 부진하다(Park, J.C. et al., J. Korean Soc. Food Nutr., 1996, 25, 588-592; Kim, M.R. et al., J. Food. Sci. Nutr., 1997, 2, 207; Kim, Mee Ree, et al., Food Res. Intl., 1999, 31(5), 389-394). 한편, 노인성 뇌질환의 발병을 예방하는 측면에서의 치료제 개발 연구로 신경보호치료에 초점을 맞추고 있는데, 최근에 자유 라디칼의 소거제, 칼슘 길항제, NMDA 및 비-NMDA 수용체 길항제 등이 뇌 보호목적으로 개발되어 일부 사용되고 있으나 뇌 보호용 항산화제의 경우 인체 안전성이 입증되지 못한 상태이다(Olney, J.W. et al., Science, 1991, 254, 1515-1518; Brouillet, E. and Beal M.F., NeuroReport., 1993, 4, 387-390; Kim, W.J. Kwon, J.S., Arch. Pharm. Res., 1999, 22, 35-43). 이러한 관점에서 보면 우리가 흔히 먹는 식용 식물자원은 인체 안전성이 어느 정도 검증된 것이지만 대개의 경우는 간과 같은 조직에 대한 항산화 효과에 대한 연구가 대부분이고 뇌 보호 목적으로 수행된 연구는 미흡하다.

한편, 머위(일반명:Butterbur 또는 학명:Petasites japonicus)는 유럽 뿐만 아니라 아시아 일부 및 북미에서 발견되는 다년생 관목이다. 머위의 뿌리 및 잎으로부터 분리한 추출물은 2,000년 이상 동안 치료제의 용도로 사용되었다. 오늘날 머위 추출물은 근육을 이완하는데 주로 사용되고, 위장내 복통, 평활근의 경련과 같은 상태에 처치하며, 통증 완화 효과가 있고 또한 두통에도 사용될 수 있다고 보고되었다(Eaton J., Townsend Lett, 2000, 202, 104-106). 또한, 머위는 천식 및 알레르기성 질환에 대해 치료 효과가 있다고 보고된 바 있다(Thomet OA, Simon HU, Int Arch Allergy Immunol, 2002, 129(2), 108-12). 그러나, 머위가 항산화 효과가 있다는 것에 대해서는 아직까지 밝혀진 바 없다.

이에, 본 발명자들은 뇌질환의 예방 및 치료제를 제조하기 위해 항산화 활성이 있는 식물자원을 탐색하던 중 머위 추출물이 항산화 활성이 뛰어남을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 항산화 활성을 갖는 머위 추출물 및 상기 추출물을 함유하는 뇌질환 예방 또는 치료용 항산화제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 머위를 물, 알코올 또는 물과 알코올의 혼합물로 추출하여 제조되는 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 갖는 머위 추출물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 추출물을 유효성분으로 함유하는 뇌질환 예방 또는 치료용 항산화제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 머위를 물, 알코올 또는 물과 알코올 혼합물로 추출하여 제조되는 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 갖는 머위 추출물을 제공한다.

본 발명의 머위 추출물은

1) 머위를 알코올로 추출 및 농축하여 알코올 추출물을 수득하는 단계;

2) 단계 1의 알코올 추출물을 헥산 및 물을 사용하여 헥산층과 물층으로 분획한 후 물층을 수득하는 단계; 및

3) 단계 2의 물층을 클로로포름을 사용하여 클로로포름층과 물층으로 분획한 후 물층을 수득하는 단계를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 추출물은 상기 머위 추출물에 추가로

1) 에틸아세테이트를 사용하여 에틸아세테이트층과 물층으로 분획한 후 물층을 수득하는 단계;

2) 단계 1의 물층을 부탄올을 사용하여 부탄올 층과 물층으로 분획한 후 부탄올층을 수득하는 단계; 및

3) 단계 2의 부탄올층을 저온 저압하에서 증발시켜 부탄올 분획을 수득하거나, 또는 상기 수득된 부탄올 분획에 재차 부탄올을 첨가하여 가용성 분획을 수득하는 단계를 추가로 포함하여 제조되는 것을 특징으로 한다.

상기에서 알코올은 메탄올 또는 에탄올인 것이 바람직하며, 메탄올인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 메탄올은 95 내지 100%의 메탄올인 것이 바람직하며, 15 내지 20℃의 암실에서 3 내지 4회 추출하는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 마쇄 및 건조된 머위에 99.9% 메탄올을 넣어 15℃의 암실에서 3회 추출하였다.

또한, 본 발명의 바람직한 실시예에 알 수 있는 바와 같이, 머위의 메탄올 추출물을 각 용매별로 추출하여 얻은 분획을 이용하여 항산화 활성을 측정한 결과 머위의 에틸아세테이트 분획 및 부탄올 분획이 항산화 활성이 뛰어남을 알 수 있었다(표 1 참조). 또한, 머위의 부탄올 분획을 생쥐에 직접 투여한 경우 카이닉산(kainic acid, 이하 "KA"라 약칭함)에 의해 유도되는 치사율을 낮춰주고(표 2 및 표 3 참조), 체중이나 뇌무게에 변화를 주지 않아 부작용이 없음을 알 수 있었으며(표 4 및 표 5 참조), KA에 의해 유도된 신경 독성 행동을 완화시켜 주고(표 6 참조), 뇌 신경세포의 손상을 억제하는 효과가 있음을 확인하여(도 2, 도 3a 및 도 3b 참조) 본 발명의 머위 추출물은 신경독성을 완화하고 신경세포를 보호해주는 역할이 있음을 알 수 있었다. 또한, 본 발명의 머위 추출물은 KA에 의해 유도된 글루타치온의 생성량 감소를 정상 수준으로 회복시켜주고(도 4 참조), KA에 의해 유도된 지질과산화를 막아주며(도 5 참조), KA에 의해 감소된 항산화 효소 활성을 정상 수준으로 회복시켜주어(도 6a 참조) 항산화 활성이 우수함을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 머위 추출물은 메탄올 추출 단계를 거쳐 얻어지고, 추가로 에틸아세테이트 추출 단계를 거치는 것이 바람직하며, 추가로 부탄올 추출 단계를 거치는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 부탄올 추출 단계를 거친 후에 부탄올로 재추출하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 머위 추출물을 유효성분으로 함유하는 뇌질환 예방 또는 치료용 항산화제를 제공한다.

본 발명의 머위 추출물은 신경세포 보호 효과 및 항산화 활성이 우수하므로 이를 이용하여 산화적 스트레스 즉, 과산화에 의해 유발되는 뇌질환을 예방 및 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물을 이용하여 예방 및 치료할 수 있는 뇌질환으로는 산화적 스트레스가 주 병인인 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 루게릭병(Amyotrophic lateral sclerosis), 허혈성 뇌졸중(Hypoxic-ischemic injury) 및 퇴행성 척추손상(chronic spinal cord injury)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 그러나, 반드시 상기한 질환에만 한정되는 것은 아니고 산화적 스트레스에 의해 유발되는 뇌질환이면 어느 것이든 적용될 수 있다.

또한, 본 발명의 머위 추출물을 유효성분으로 함유하는 뇌질환 예방 또는 치료용 항산화제에는 본 발명의 머위 추출물 성분외에도 일반적으로 사용되는 임의의 항산화제 성분을 추가하여 사용하는 것도 가능하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 머위 추출물의 제조

머위(Butterbur or Petasites japonicus)를 음건하였다. 건조된 머위를 마쇄한 후, 건조 머위 500 g에 99.9% 메탄올 5 ℓ를 넣어 15℃의 암실에서 3회 추출하였다. 상기 추출된 머위의 메탄올 추출물을 40℃의 회전증발기에서 메타올을 감압 농축시켜 날려보낸 후 잔사를 증류수에 녹였다. 상기 증류수에 녹아있는 머위 추출물에 동일 부피의 헥산(hexane)을 첨가하여 층분리를 시킨 후 헥산층을 수득하였다. 상기 헥산층을 수득하고 남은 물층에는 동일비의 클로로포름을 첨가하여 층분리를 시킨 후 클로로포름층을 수득하였다. 상기 클로로포름층을 수득하고 남은 물층에는 동일비의 에틸아세테이트를 첨가하여 층분리를 시킨 후 에틸아세테이트층을 수득하였다. 상기 에틸아세테이트층을 수득하고 남은 물층에는 동일비의 부탄올을 첨가하여 층분리를 시킨 후 부탄올 층 및 물층을 수득하였다. 상기 수득된 헥산층, 클로로포름층, 에틸아세테이트층, 부탄올층 및 물층은 각각 저온 저압 상태에서 증발시킨 후 헥산분획, 클로로포름분획, 에틸아세테이트 분획, 부탄올 분획 및 물 분획을 제조하였다(도 1).

<실시예 2> 머위 메탄올 추출물의 항산화 활성 분석

본 발명의 머위 추출물이 항산화 활성을 가지는지 알아보기 위해 상기 실시예 1에서 추출한 머위의 용매별 추출물을 생쥐의 뇌에 처리한 후 지질 과산화 정도를 측정하는 시험관내 실험(in vitro)을 수행하였다. 구체적으로, ICR 수컷 생쥐(22.5 ±2.5g, 6 내지 8주령)로부터 뇌를 적출한 후 2 mM EDTA를 포함하는 0.15 M KCl 용액으로 세척하였다. 상기 세척된 뇌를 호모게나이저(tissue homogenizer, Teflon pestle)를 이용하여 뇌를 분쇄하였다. 상기 분쇄된 뇌 1 ㎖에 8.1% SDS 1 ㎖, 20% 아세트산 2 ㎖ 및 0.75% 티오바비튜릭산(thiobarbituric acid, 이하 "TBA"라 약칭함) 1 ㎖을 첨가하였다. 상기 뇌 혼합물을 끓인뒤 30분 동안 얼음에 놓아 둔 후 14,000 rpm에서 10분동안 원심분리하여 상층액을 얻었다. 상기 상층액에 상기 실시예 1에서 추출한 머위의 용매별 분획물을 각각 1 ㎖씩 첨가한 후 Fe²⁺ 0.2 mM 및 아스코르빈산 25 mM을 첨가하여 37℃에서 회전시켜 혼합해 주었다. 30분이 지난후에 상기 혼합액에 동일 부피의 15% 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid, 이하 "TCA"라 약칭함) 및 0.75% TBA를 첨가하였다. 상기 반응 혼합액을 15분동안 끓인 후 얼음에 5분 동안 놓아두고 3,000 rpm에서 10분동안 원심분리하여 혈구(corpuscolate)를 분리하였다. 상기 원심분리 후 상등액을 얻은 후 533 nm에서 흡광도를 측정하였다(Bidlack, W.T., and Tappel, A.L., Lipids, 1973, 8, 177-182). 1,1,3,3,-테트라에톡시프로판 (1,1,3,3,-tetraethoxypropane)의 가수분해에 의해 생성되는 말론디알데히드(malondialdehyde)(Gutteridge, J.M.C., Analytical Biochemistry, 1975, 69, 518-526)를 이용해 보정(calibration)하였다. 지질 과산화의 억제 정도는 추출물을 8가지 농도로 처리했을때의 지질 과산화 억제 정도를 나타낸 곡선으로부터 50% 저해 효과를 나타내는 log 농도를 반수유효약량(IC₅₀)으로 나타내었다. 항산화 활성은 하기 수학식 1에 나타난 바와 같이 대조군(추출물을 처리하지 않은 것)에 대한 티오바비튜릭산 반응성 기질(thiobarbituric acid reactive substrate, 이하 "TBARS"라 약칭함)의 퍼센트 감소 정도로 나타내었다.

<수학식 1>

상기에서 A_샘플군: 뇌 균질화물, 아스코르빈산/Fe²⁺ 및 머위 추출물 혼합액의 533 nm에서의 흡광도,

A_비교군1: 뇌 균질화물 및 머위 추출물 혼합액의 533 nm에서의 흡광도,

A_비교군2: 뇌 균질화물 및 아스코르빈산/Fe²⁺혼합액의 533 nm에서의 흡광도,

A_대조군: 뇌 균질화물의 533 nm에서의 흡광도.

그 결과, 머위 메탄올 추출물로부터 수득한 용매 분획물 중에서 에틸아세테이트 및 부탄올 분획의 IC₅₀ 농도값이 가장 낮았다(표 1). 따라서, 머위 메탄올 추출물을 추가로 에틸아세테이트로 추출한 에틸아세테이트 분획 및 이를 추가로 부탄올로 추출한 부탄올 분획은 적은 농도를 처리하여도 지질 과산화 억제 활성, 즉 항산화 활성이 뛰어남을 알 수 있다.

머위 분획	IC50(㎎/㎖)
에틸아세테이트	0.020
클로로포름	0.245
부탄올	0.023
물	0.117
아스코르빈산(대조군)	0.790

<실시예 3> 카이닉산에 의해 유도되는 산화적 신경 독성의 억제

상기 실시예 2에서 항산화 활성이 높음을 확인한 머위의 부탄올 분획이 신경 독성에 미치는 영향을 알아보기 위해 카이닉산(kainic acid, 이하 "KA"라 약칭함)에 의해 유도되는 산화적 신경 독성에 미치는 영향을 생체내 실험(in vivo)을 통해 분석하였다.

<3-1> 머위 부탄올 분획 투여에 의한 치사율, 체중, 신경독성 행동 분석

수컷 ICR 생쥐(22.5 ±2.5 g, 6 내지 8주령)를 폴리카보네이트 케이지(케이지당 5마리)에서 실험 동물용 고형 사료(SamYang Co. Korea)를 자유급이시켰다. 온도는 23 ±3℃, 상대 습도는 60 ±10%로 유지하고 12시간 간격의 명암 주기 및 150-200 럭스(lux)로 조도를 조절하였다. 순화 기간중 건강하다고 판단된 동물만을 무작위로 군분리를 하여 실험에 사용하였다. 동물의 생육 및 실험은 모두 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침서(Guide for care and use of laboratory animal, National Institutes of Health Guidelines, 1985, 85-23)에 따라 수행하였다. 생쥐의 그룹은 불특정하게 그룹지었으며 각각의 체중을 매일 측정하였다. 상기 생쥐에 식도 주입용 니들(esophagus needle)을 이용하여 상기 실시예 1에서 추출한 머위의 부탄올 분획을 150 또는 400 ㎎/㎏의 양으로 하루에 한번씩 4일 동안 구강 주입하였다. 상기 머위의 부탄올 분획 주입 후 하루 뒤에 KA를 식염수에 녹여 생쥐 몸무게 1 ㎏당 50 ㎎을 복강 주사하였다. 상기 부탄올 분획을 주입하는 대신에 식염수를 주입한 생쥐를 대조군 생쥐로 사용하였다. KA 주입후 생쥐의 행동학적 변화를 콘도 등의 방법(Kondo et al., Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism, 1997, 17, 241-256)에 의해 모니터링하였다. 또한, KA 주입후 하루 뒤에 생쥐의 뇌를 적출하여 액체 질소에 얼린 후 사용하기 전까지 최대 48시간 동안 -80℃에서 보관하였다.

1. 치사율

KA 및 KA와 머위의 부탄올 분획을 투여한 후의 치사율을 측정한 결과, KA만을 투입한 것에 비해 머위의 부탄올 분획을 먼저 투여한 경우 생쥐의 치사율이 낮아졌으며, 400 ㎎/㎏을 투여한 것보다 150 ㎎/㎏을 투여한 것의 치사율이 더 높았다(표 2). 따라서, 머위의 부탄올 분획은 농도 의존적으로 KA에 의해 유도된 생쥐의 치사율을 낮춰줌을 알 수 있었다.

처리군		치사율(%)
실험군 1	대조군	0
	KA(50 ㎎/㎏)	54
	KA(50 ㎎/㎏)+머위의 부탄올 분획(400 ㎎/㎏)	25
실험군 2	대조군	0
	KA(50 ㎎/㎏)	63.6
	KA(50 ㎎/㎏)+머위의 부탄올 분획(150 ㎎/㎏)	50

그러나, 상기 표 2에서 보는 바와 같이 머위 부탄올 분획 150 ㎎/㎏을 투여하여도 치사율은 50%로 매우 높음을 알 수 있다. 이에, 상기 머위 부탄올 분획에 다시 10배 부피의 부탄올을 넣어 부탄올에 잘 녹는 분획과 잘 녹지 않는 분획을 수득한 후 각각 fraction Ⅰ 및 fraction Ⅱ라 명명한 후 상기와 동일하게 실험을 수행하여 치사율을 측정하였다.

그 결과, fraction Ⅰ을 투여한 경우 치사율이 0%로 나타나고 fraction Ⅱ는 44%로 나타나 부탄올로 재추출한 분획이 치사율이 매우 낮음을 알 수 있었다(표 3). 이는 부탄올에 녹지 않는 분획에 포함된 성분이 생쥐에 독성을 나타내는 요인이 될 것으로 사료되었다.

처리군	치사율(%)
KA(44 ㎎/㎏)	54
KA(44 ㎎/㎏)+fraction Ⅰ(200 ㎎/㎏)	0
KA(44 ㎎/㎏)+fraction Ⅱ(200 ㎎/㎏)	44.4

2. 체중 및 뇌의 무게 변화

400 ㎎/㎏의 머위 부탄올 분획을 투여한 후의 생쥐의 체중 및 뇌의 무게를 측정한 결과 머위의 부탄올 분획을 투여하여도 체중 및 뇌의 무게에는 영향을 주지 않았다(표 4). 또한, 200 ㎎/㎏의 fraction Ⅰ 또는 fraction Ⅱ를 투여하였을때에도 체중 및 뇌의 무게에 영향을 주지 않았지만 fraction Ⅰ이 fraction Ⅱ에 비해 훨씬 영향을 주지 않음을 알 수 있었다(표 5). 따라서, 본 발명의 머위 메탄올 추출물은 직접 투여하여도 부작용을 주지 않음을 알 수 있었다.

처리군	최초 체중(g)	최종 체중(g)	체중 변화(g)	뇌 무게(g)
대조군	31.48 ±1.09	32.06 ±1.06	0.58 ±0.008	0.355 ±0.0059
KA(50 ㎎/㎏)	31.39 ±0.49	32.34 ±0.58	0.95 ±0.385	0.346 ±0.0038
KA(50 ㎎/㎏)+머위의 부탄올 분획(400 ㎎/㎏)	31.71 ±0.7	33.21 ±0.74	1.51 ±0.247	0.353 ±0.0066

처리군	최초 체중(g)	최종 체중(g)	체중 변화(g)	뇌 무게(g)
대조군	30.04 ±0.71	30.09 ±0.95	0.05 ±0.51	0.304 ±0.0059
KA(44 ㎎/㎏)	29.49 ±0.91	29.88 ±0.86	0.39 ±0.29	0.327 ±0.0098
KA(44 ㎎/㎏)+fraction Ⅰ(200 ㎎/㎏)	31.66 ±0.65	31.49 ±0.74	0.18 ±0.39	0.328 ±0.0178
KA(44 ㎎/㎏)+fraction Ⅱ(200 ㎎/㎏)	30.56 ±0.88	29.33 ±1.16	1.12 ±0.54	0.319 ±0.0051

3. 신경 행동학적 변화

200 ㎎/㎏의 머위 fraction Ⅰ 또는 fraction Ⅱ를 투여한 후의 신경 행동학적 변화(1 단계; 꼬리의 휨, 2 단계; 진전, 3 단계; 급성 발작)를 관찰한 결과, 머위 fraction Ⅰ은 KA만 투여한 것에 비해 꼬리의 휨(tail arch)은 그대로 유지되었으나 진전(tremore) 및 급발작(seizure)은 각각 77.8% 및 66.7%로 감소하였다. 그리고 머위 fraction Ⅱ는 fraction Ⅰ에 비해 신경행동학적 변화가 빨리 나타났으며 이는 상기에서 추론한 바와 같이 부탄올에 녹지 않는 분획에 포함된 성분이 생쥐에 독성을 나타내는 요인이 될 것으로 사료되었다(표 6). 따라서, 본 발명의 머위의 부탄올 분획은 KA에 의해 유도된 신경 독성적 행동을 완화시킴을 알 수 있었다.

처리군	꼬리 휨	진전	급성 발작
KA(44 ㎎/㎏)	12.4 ±4.7(100%)	16.7 ±6.1(100%)	18.9 ±19.5(100%)
KA(44 ㎎/㎏)+fraction Ⅰ(200 ㎎/㎏)	27.6 ±7.6(100%)	40.6 ±11.9(77.8%)	48.2 ±10.4(66.7%)
KA(44 ㎎/㎏)+fraction Ⅱ(200 ㎎/㎏)	11.4 ±7.6(100%)	17.0 ±9.7(100%)	22.6 ±16.8(88.9)

또한, 상기에서 KA 주입 후 하루 뒤에 적출한 뇌를 이용하여 조직학적 검사를 수행하여 해마(hippocampus)의 CA1 및 CA3 부위에 있는 추체 세포(pyramidal cells)의 손상여부를 관찰하였다. 그 결과, KA를 투여한 후 해마의 CA1 및 CA3 부위에 있는 살아있는 신경 세포가 각각 18.5% 및 8.9%로 대부분의 신경세포가 손상되었다. 그러나 머위의 부탄올 분획을 전처리한 경우 살아있는 신경세포가 각각 72.6% 및 62.2%로 신경세포 보호효과가 있음을 알 수 있었다(도 2, 도 3a 및 도3b).

<3-2> 머위의 부탄올 분획 투여에 의한 항산화 물질 분석

KA만 투여한 생쥐 및 400 ㎎/㎏의 머위 부탄올 분획을 투여한 생쥐로부터 약 0.2 g의 뇌 조직을 차가운 6% 메타포스포릭산(metaphosphoric acid) 용액에 넣고 차가운 세라믹 퍼큐션 모터를 사용하여 분쇄하였다. 상기 분쇄된 용액을 4℃, 27,000 g에서 20분 동안 원심분리하였다. 상기 원심분리한 상층액을 수득한 후 상등액 0.05 ㎖에 5 mM EDTA를 포함하는 100 mM 포스페이트 버퍼(pH 7.4) 0.39 ㎖, 10 mM DTNB(5,5-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)) 0.025 ㎖ 및 5 mM NADPH 0.08 ㎖을 첨가하여 25℃에서 3분 동안 평형유지시켰다. 상기 평형유지 후 글루타치온(glutathione, 이하 "GSH"라 약칭함) 리덕타제(reductase) 2 unit를 넣어 반응을 시작한 후 흡광도 측정기(UV/VIS spectrophotometer)를 사용하여 412 nm에서 흡광도를 측정해 2-니트로-5-티오벤조익산(2-nitro-5-thiobenzoic acid)의 형성을 측정하였다(Roberts, J.C. and Francetic, D.J., Analytical Biochemistry, 1993, 211, 183-187; Raymond, C. et al., Journal of Nutrition, 1995, 125, 3062-3070). 샘플에 포함된 전체 GSH 양은 알려진 GSH의 양에 대한 412 nm에서의 흡광도 변화를 그래프화하여 작성한 표준 곡선으로부터 도출하였다. 상기 GSH의 값은 4 내지 8마리의 생쥐로부터의 결과를 세 번 수행한 결과의 평균 ±S.E.M로 나타내었다.

그 결과, KA를 단독으로 투여하였을 때에는 뇌조직에서의 총 GSH 양이 20% 정도로 유의적으로 감소하였으며, KA 투여전에 머위의 부탄올 분획을 400 ㎎/㎏ 투여하였을 때에는 GSH의 양이 무처리한 대조군의 수준으로 회복되었다(도 4). 따라서, 본 발명의 머위의 부탄올 분획은 항산화 효과가 있음을 알 수 있었다.

<3-3> 머위의 부탄올 분획 투여에 의한 지질 과산화 분석

KA는 지질 과산화를 유도하기 때문에 본 발명의 머위의 부탄올 분획이 KA에 의해 유도된 생쥐의 지질 과산화에 미치는 영향을 분석하고자 하였다. 구체적으로, KA만 투여한 생쥐 및 KA 투여와 함께 머위의 부탄올 분획을 400 ㎎/㎏ 투여한 생쥐로부터 뇌를 적출하였다. 상기 뇌 조직에 0.25 M 수크로즈 용액을 넣어 분쇄한 후 분쇄된 전체 뇌 균질화물을 이용하여 뇌에 함유되어 있는 TBARS의 양을 측정하였다.

그 결과, KA를 단독으로 투여함으로써 증가한 TBARS 함량이 본 발명의 머위의 부탄올 분획을 전처리함으로써 무처리한 대조군의 수준으로 되돌아갔다(도 5). 또한, 머위의 fraction Ⅰ 및 fraction Ⅱ의 결과도 상기와 동일하게 나왔다. 따라서, 본 발명의 머위의 부탄올 분획은 뇌조직에서의 산화적 스트레스에 의한 지질 과산화를 막아줌을 알 수 있었다.

<3-4> 머위의 부탄올 분획 투여에 의한 항산화 효소 활성의 분석

본 발명의 머위의 부탄올 분획이 KA에 의해 유도되는 과산화를 억제하여 항산화 효과가 있음을 확인하여 이러한 효과가 나타나는 것이 항산화 관련 효소 활성에 영향을 줌으로써 일어나는지 확인하고자 하였다. 구체적으로, 상기 실시예 <3-3>에서 수득한 뇌 균질화물을 이용하여 뇌 균질화물에 포함되어 있는 글루타치온 관련 항산화 효소 즉, 글루타치온 퍼옥시다제(glutathione peroxidase) 및 글루타치온 리덕타제(glutathione reductase)의 활성을 측정하였다.

그 결과, KA에 의해 감소한 글루타치온 퍼옥시다제의 활성은 본 발명의 머위의 부탄올 분획을 전 투여함으로써 무처리한 대조군보다 더 높은 수준으로 유의성있게 증가하였다(p< 0.05)(도 6a). 반면, 본 발명의 머위의 부탄올 분획은 KA에 의해 감소한 글루타치온 리덕타제의 활성에는 영향을 주지 않았다(도 6b).

또한, 머위의 부탄올 분획을 다시 부탄올에 녹인후 불용분을 제거하고 가용분만을 수득하여 상기에서 실시한 바와 동일하게 생쥐에 투여한 후 치사율, 체중변화, 뇌무게 변화, 신경독성적 행동변화, 신경세포의 조직 관찰, 글루타치온 양 분석, 글루타치온 리덕타제 및 글루타치온 퍼옥시다제 발현량을 분석하였다.

그 결과, 머위의 부탄올 분획을 재추출한 것은 머위의 부탄올 분획을 투여한 결과와 동일한 결과를 나타내었다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 머위 추출물은 항산화 활성이 우수하며, 지질 과산화 억제능이 뛰어나 과산화에 의해 유도되는 뇌질환을 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

이하, 본 발명의 머위 추출물을 이용하여 예방 또는 치료할 수 있는 구체적인 질환에 대해 설명한다.

<적용예 1> 알츠하이머병(Alzheimer's disease: AD)

알츠하이머병은 대뇌피질 및 해마에 있는 글루타민성 뉴런(glutamatergic neurons)과 전뇌 기저에 있는 콜린성 신경세포(cholinergic neurons)의 괴사를 동반하며, 신경세포 밖의 아밀로이드 플라그(amyloid plaque)와 신경세포 안의 신경 섬유의 엉킴(neurofibrillary tangles)이 공통적인 현상으로 발견된다. 그리고, 과도한 양의 활성산소에 의해 지질 과산화(lipid peroxidation), 8-하이드록시 디옥시구아노신(8-hydroxy deoxyguanosine), 단백질 카르보닐(protein carbonyls), 질화(nitration), 단백질의 산화적 교차결합(oxidative crosslinking of proteins) 등이 알츠하이머병에서 증가해 있다고 알려져 있다(Vitek et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91, 4766-4770; Smith et al., 1995, Trends. Neurosci., 18, 172-176; Smith et al., 1996, Mol. Chem. neuropathol., 28, 41-48, Smith et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94, 9866-9868; Montine et al., 1996, J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55, 202-201). 따라서, 지질 과산화 억제 활성 및 항산화 관련 효소 활성이 우수한 본 발명의 추출물은 알츠하이머병을 예방 및 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

<적용예 2> 파킨슨병(Parkinson's disease)

파킨슨병은 흑질에 존재하는 도파민 신경 세포의 괴사가 동반되어 진전, 근육경직, 운동 완서, 비정상적 자세, 운동 불능 등의 다양한 증상들을 나타내는 퇴행성 신경계 질환이다. 신경 세포괴사의 주요 원인으로 산화적 독성이 제시되고 있는데 주로 지질 과산화, DNA 산화, 단백질 카보닐(protein carbonyl) 및 나이트로타이로신(nitrotyrosine)의 증가가 흑질에서 발견된다(Bowling, A.C. and Beal, M.F., Life Sci., 1995, 56(14), 1151-1171). 따라서, 지질 과산화 억제 활성 및 항산화 관련 효소 활성이 우수한 본 발명의 추출물은 파킨슨씨 병을 예방 및 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

<적용예 3> 루게릭병(Amyotrophic lateral sclerosis)

근위축성 측상 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis)은 주로 척수신경의 하위 운동 뉴런(lower motor neuron)으로부터 시작하여 점차 상위 운동 뉴런(upper motor neuron)으로 진행되어 대뇌피질, 뇌간, 척수의 운동 신경세포의 손상을 동반하고, 근위축, 호흡근력 약화 및 섬유속성 연축이 특징적으로 나타나며, 증상이 처음 관찰된 지 2-5년내에 사망한다. 특히, 유전적 근위축성 측삭 경화증 환자에서 염색체 21번(chromosome 21)에 위치하는 슈퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical)을 제거해주는 SOD-1 유전자에서 변이가 관찰되어 산화적 독성이 나타나며 환자의 뇌에서 산화적 독성의 지표인 단백질 카보닐 군이 증가해 있다고 보고되었다(Bowling et al., 1993, J. Neurochem., 61, 2322-2325). 따라서, 지질 과산화 억제 활성 및 항산화 관련 효소 활성이 우수한 본 발명의 추출물은 루게릭병을 예방 및 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

<적용예 4> 허혈성 뇌졸중(Hypoxic-ischemic injury)

뇌졸중은 뇌의 혈액 순환 장애(혈전증, 색전증, 협착증)에 의해 일정한 양으로 공급되는 포도당 및 산소가 부족함으로 인해 일어나는 질환으로서, 손상을 받은 뇌에 의한 신체기능 조절의 손실로 인해 마비증세, 언어 및 인지 기능의 장애가 발생한다. 뇌졸중이 일어나고 난 뒤 세포막의 탈극성(membrane depolarization)으로 인해 세포내로 칼슘이 유입되면 이것이 다시 미토콘드리아로 유입되어 호흡체계(repiratory chain)가 손상되고 활성 산소의 생성이 증가하여 세포내에 활성 산소가 과량 쌓이게 된다. 생성된 활성 산소는 세포막 지질의 파괴, 유전자의 손상, 단백질 변성 등을 유도해 신경세포의 괴사가 일어나며, 이에 대해 항산화제는 허혈성 신경세포의 괴사를 억제하는 효과가 있다(Holtzman et al., 1996, Ann. Neurol., 39(1), 114-122; Ferrer et al., 2001, Acta neuropathol.(Berl.), 101(3), 229-38; Hall et al., 1990, Stroke, 21, 11183-11187). 따라서, 지질 과산화 억제 활성 및 항산화 관련 효소 활성이 우수한 본 발명의 추출물은 허혈성 뇌졸증을 예방 및 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

<적용예 5> 퇴행성 척추손상(Chronic spinal cord injury)

척추의 손상은 하반신 마비와 사지 마비를 일으키며 손상 부위로부터 먼 거리에 있는 부위까지 신경세포의 괴사가 관찰되지만, 이에 대한 치료제나 치료법이 개발되어 있지 않은 실정이다. 척추손상에는 Ca²⁺의 유입, 세포막의 붕괴, 산화적 독성에 의한 지질의 과산화가 관찰된다고 보고되었으며 (Brown and Hall, 1992, J. Am. Vet. Med. Assoc., 200, 1849-1859; Springer et al., 1997, J. Neurochem., 68, 2469-2476; Juurlink and Paterson, 1998, J. Spinal cord Med., 21, 309-334), 최근에는 세포의 괴사가 2차 손상에 관여한다는 증거가 제시되고 있고, 세포 괴사에 관여하는 효소인 카스파제(caspase)에 대한 억제제가 신경세포의 괴사를 감소시킨다고 보고되었다(Zhang et al., 1990, J. Neurochem., 59, 733-739). 따라서, 지질 과산화 억제 활성 및 항산화 관련 효소 활성이 우수한 본 발명의 추출물은 퇴행성 척추손상을 예방 및 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 머위 추출물은 산화적 스트레스에 의한 뇌의 신경독성 및 지질 과산화에 대해 억제 활성이 뛰어나므로 산화적 스트레스에 의해 유발되는 뇌질환을 예방 및 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 머위 메탄올 추출물로부터 용매별로 분획하는 단계를 나타낸 모식도이다.

도 2는 머위의 부탄올 분획을 생쥐에 투여하였을 때 KA에 의해 유도되는 해마 신경세포의 생존에 미치는 효과를 나타낸 조직 사진이다.

A: 무처리한 정상 해마의 CA1 부위, B: 무처리한 정상 해마의 CA3 부위,

C: KA 처리한 생쥐 해마의 CA1 부위, D: KA 처리한 생쥐 해마의 CA3 부위,

E: 머위의 부탄올 분획을 처리한 후 KA 처리한 생쥐 해마의 CA1 부위,

F: 머위의 부탄올 분획을 처리한 후 KA 처리한 생쥐 해마의 CA3 부위

도 3a는 머위의 부탄올 분획을 생쥐에 투여하였을 때 KA에 의해 유도되는 해마의 CA1 부위에 있는 신경세포의 생존에 미치는 영향을 생존 세포수를 세어 나타낸 그래프이다.

도 3b는 머위의 부탄올 분획을 생쥐에 투여하였을 때 KA에 의해 유도되는 해마의 CA3 부위에 있는 신경세포의 생존에 미치는 영향을 생존 세포수를 세어 나타낸 그래프이다.

도 4는 머위의 부탄올 분획을 생쥐에 투여하였을 때 KA에 의해 유도되는 글루타치온 양의 감소에 미치는 영향을 분석한 그래프이다.

도 5는 머위의 부탄올 분획을 생쥐에 투여하였을 때 KA에 의해 유도되는 지질과산화에 대한 억제를 분석한 그래프이다.

도 6a는 머위의 부탄올 분획을 생쥐에 투여하였을 때 KA에 의해 유도되는 글루타치온 퍼옥시다제 활성의 감소에 미치는 영향을 분석한 그래프이다.

도 6b는 머위의 부탄올 분획을 생쥐에 투여하였을 때 KA에 의해 유도되는 글루타치온 환원효소 활성의 감소에 미치는 영향을 분석한 그래프이다.

Claims (7)

1. 삭제
2. 삭제
3. 1) 머위(Petasites japonicus)를 알코올로 추출하고 농축하여 알코올 추출물을 수득하는 단계;

   2) 상기 단계 1의 알코올 추출물을 헥산 및 물을 사용하여 헥산층과 물층으로 분획한 후 물층을 수득하는 단계;

   3) 상기 단계 2의 물층을 클로로포름을 사용하여 클로로포름층과 물층으로 분획한 후 물층을 수득하는 단계;

   4) 단계 3의 머위 추출물에 에틸아세테이트를 사용하여 에틸아세테이트층과 물층으로 분획한 후 물층을 수득하는 단계;

   5) 상기 단계 4의 물층을 부탄올을 사용하여 부탄올 층과 물층으로 분획한 후 부탄올층을 수득하는 단계; 및

   6) 상기 단계 5의 부탄올층을 저온 저압하에서 증발하여 부탄올 분획을 수득하거나 또는 상기에서 수득된 부탄올 분획에 재차 부탄올을 첨가하여 가용성 분획을 수득하는 단계;

   로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 뇌세포 보호 효과를 갖는 머위 추출물.
4. 제 3항에 있어서, 상기 알코올은 메탄올 또는 에탄올인 것을 특징으로 하는 뇌세포 보호 효과를 갖는 머위 추출물.
5. 제 4항에 있어서, 상기 메탄올은 95 내지 100%인 것을 특징으로 하는 뇌세포 보호 효과를 갖는 머위 추출물.
6. 제 3항 내지 제 5항에서 선택되는 어느 한 항의 머위 추출물을 유효성분으로 함유하는 뇌세포 보호 효과를 갖는 의약조성물.
7. 삭제