CN106581113B - 毛裂蜂斗菜提取物在制备防治缺氧疾病药物或保健食品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，是一种毛裂蜂斗菜提取物及其所含的蜂斗菜内酯类化合物在制备防治缺氧疾病药物中的新用途。药效学试验结果表明，其不仅能明显延长密闭缺氧小鼠的存活时间，而且还能明显降低减压缺氧小鼠的死亡率，对密闭缺氧和高原缺氧起明显保护作用，因而可以用于制备防治包括高原缺氧或密闭仓缺氧等高原病或缺氧症的药物。

Description

毛裂蜂斗菜提取物在制备防治缺氧疾病药物或保健食品中的 应用

技术领域：

本发明涉及医药技术领域，是毛裂蜂斗菜提取物及其所含蜂斗菜内酯类化合物用于制备防治缺氧疾病特别是高原缺氧和密闭缺氧疾病药物或保健食品的新用途。

背景技术：

毛裂蜂斗菜Petasites tricholobus Franch.属菊科蜂斗菜属植物，其根茎在民间用于解毒祛瘀，外敷治跌打损伤、骨折蛇伤等。为开发利用该植物, 本发明人对该植物进行了较系统的化学成分及药理研究，曾对毛裂蜂斗菜中的四个蜂斗菜内酯新化合物以及蜂斗菜内酯类化合物用于治疗可能与组胺和/或白三烯有关疾病的用途申请并获得了中国发明专利 ZL200610026133.1(授权公告号为CN100554260C)；对毛裂蜂斗菜根茎提取物及其制备方法以及该提取物用于制备治疗和预防肿瘤疾病药物的用途、在制备防治心脑血管疾病药物中的用途也分别申请并获得了中国发明专利ZL200710038961.1(授权公告号为CN101028322B)，和 ZL200810039033.1(授权公告号为CN101297828B)。

高原缺氧和密闭缺氧性疾病主要是由于外部环境缺氧如航海和航空的密闭或通风不良的环境、由低海拨进入高海拔地区或长期生活在高海拨地区等导致的机体短期或长期供养不足而发生的缺氧性疾病。在临床上急性缺氧会导致为头昏、头痛、恶心、呕吐、心慌、气短、眼花、失眠、嗜睡、食欲减退、腹胀、腹泻、口唇发绀和手足发麻、步态不稳、惊厥等，另外还有可能导致急性肺水肿、脑昏迷和脑水肿等。慢性缺氧还会导致心脏病、红细胞增多症和血压异常等。目前临床上主要用于保护缺氧性疾病的中药主要有人参、党参、西洋参、红景天和刺五加等。

但是，到目前为止，尚未见有关毛裂蜂斗菜提取物及其所含的活性物质蜂斗菜内酯类化合物有耐高原缺氧和密闭缺氧药理活性的文献报道。

发明内容：

本发明的目的在于毛裂蜂斗菜提取物及其所含的活性物质蜂斗菜内酯类化合物的新用途，尤其是在制备防治缺氧疾病药物或保健食品中的应用。

本发明所述的缺氧疾病是指高原缺氧和/或密闭缺氧疾病。

本发明提供了毛裂蜂斗菜提取物在制备预防或治疗高原缺氧或密闭缺氧疾病药物或保健食品中的应用。

所述的毛裂蜂斗菜提取物的制备方法如下：毛裂蜂斗菜根茎粉碎后，用乙醇提取得提取液，提取液减压浓缩浓缩后离心或过滤，弃沉淀，上清液或过滤液备用；将上述上清液或过滤液进行聚苯乙烯型多孔性吸附树脂吸附、水-50％的含水低级醇淋洗除去杂质后，用上样生药质量的4-12倍量体积的60-95％的含水的C1～C5低级醇洗脱后将洗脱液减压浓缩，干燥，得毛裂蜂斗菜提取物。

进一步地，本发明也提供了毛裂蜂斗菜提取物所含的活性物质蜂斗菜内酯类化合物在制备预防或治疗高原缺氧或密闭缺氧疾病药物或保健食品中的应用。

本发明所述的毛裂蜂斗菜提取物所含的活性物质蜂斗菜内酯类化合物包括但不限于，中国发明专利ZL200610026133.1、ZL200710038961.1、 ZL200810039033.1中公开的所有蜂斗菜内酯类化合物。

本发明所述的蜂斗菜内酯类化合物，化学结构如式(Ⅰ)所示：

其中R₁、R₂分别代表：

R₁：-H，-OCOC(CH₃)＝CHCH₃，-OCOCH＝C(CH₃)₂，-OCOCH＝CHSCH₃， cis-OCOCH＝CHSCH₃，-OCOCH₃，-OCOC(CH₃)＝CHCH₃， cis-OCOCH＝CHSOCH₃，(R)-cis-OCOCH＝CHSOCH₃，(S)-cis-OCOCH＝CHSOCH₃，(S)-trans-OCOCH＝CHSOCH₃，-OH， -OCOCH₂CH(CH₃)₂，-OCOCH(CH₃)₂，-OCOCH(CH₃)CH₂CH₃或 -OCOC(＝CH₂)CH(OH)(CH₃)；

R₂：-H，-OCOCH＝C(CH₃)₂，-OCOCH＝CHSCH₃，cis-OCOCH＝CHSCH₃， -OCOC(CH₃)＝CHCH₃，-OCOCH₃，cis-OCOCH＝CHSOCH₃， (R)-cis-OCOCH＝CHSOCH₃，(S)-cis-OCOCH＝CHSOCH₃，-OH， (S)-trans-OCOCH＝CHSOCH₃，-OCOCH₂CH(CH₃)₂，-OCOC(CH₃)CHCH₃或-OCOCH(CH₃)₂；

取代基中：基团中(R)表示右旋，(S)表示左旋，trans表示顺式，cis表示反式。

本发明的部分蜂斗菜内酯类化合物的化学名及其R₁R₂组合如表1所示。

表1本发明优选蜂斗菜内酯类化合物

本发明毛裂蜂斗菜提取物所含的活性物质蜂斗菜内酯类化合物的制备方法如下：

(1)提取

毛裂蜂斗菜根茎粉碎后，用20-95％的含水乙醇按常规热提、冷浸或渗漉提取，得提取液，提取液减压浓缩，浓缩后离心或过滤，取上清液或过滤液；

(2)纯化

将上述上清液或过滤液通过聚苯乙烯型多孔性吸附树脂吸附，用水 -50％的含水低级醇淋洗除去杂质，再用上样生药质量的4-12倍量体积的60-95％的含水低级醇洗脱，收集洗脱液，所说的低级醇选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或戊醇；

(3)浓缩、干燥

按常规将洗脱液减压浓缩、干燥，即得毛裂蜂斗菜提取物。

(4)毛裂蜂斗菜提取物中所含蜂斗菜内酯类化合物的分离纯化：

将上述制得的毛裂蜂斗菜提取物溶于水制成混悬液，用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取部分，经减压浓缩，得到乙酸乙酯萃取物。将乙酸乙酯萃取物进行反复硅胶柱层析，最终获得了44个蜂斗菜内酯类化合物。

经药理和药效学动物实验表明，本发明的毛裂蜂斗菜提取物及其所含蜂斗菜内酯类化合物具有耐缺氧药理活性，因而可以用于制备防治包括高原缺氧、密闭仓缺氧等高原病或缺氧症的药物。

更优的，本发明的毛裂蜂斗菜提取物及其所含蜂斗菜内酯类化合物可以预防高原缺氧和密闭缺氧带来的头痛、多言、失眠、步态不稳、呼吸加快、心跳加快、脑水肿、嗜睡、昏迷、惊厥，甚至呼吸中枢麻痹等病症。

本发明所述的药物是由药物活性成分毛裂蜂斗菜提取物、蜂斗菜内酯类化合物，和药学上可接受的辅料组成的药物组合物。

本发明所述的药物组合物可采用医学领域常规的方法，将毛裂蜂斗菜提取物、蜂斗菜内酯类化合物作为活性成分，与药学上可接受的辅料制成药物制剂，所述的药物制剂中，活性成分的重量含量为0.1％～99.9％。

所述的药学上可接受的辅料，包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

所述药物可以制成注射液、悬浮剂、粉剂、片剂、颗粒剂等多种形式，上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明为临床或日常生活中防治包括高原缺氧、密闭仓缺氧等高原病或缺氧症提供了新的手段。

具体实施方式：

现结合实施例和生物活性试验，对本发明作详细描述。此仅作为说明本发明之用，不能用作对本发明保护范围的限制。

实验用毛裂蜂斗菜Petasites tricholobus Franch.和蜂斗菜Petasitesjaponicus(Sieb et Zucc)分别采集于四川成都郊区及浙江湖州市郊区。

实施例1.制备毛裂蜂斗菜提取物

本发明毛裂蜂斗菜提取物的制备方法步骤如下：

(1)提取

毛裂蜂斗菜根茎10kg粉碎后，用90％的含水乙醇50L按常规方法渗漉得提取液，提取液减压浓缩后离心，取上清液备用；

(2)纯化

将上述上清液进行聚苯乙烯型多孔性吸附树脂吸附，用水和50％的含水乙醇淋洗除去杂质后，用80L 80％的含水醇洗脱,收集洗脱液。

(3)浓缩、干燥

将洗脱液按常规减压浓缩，干燥，即得毛裂蜂斗菜提取物。

实施例2.制备毛裂蜂斗菜提取物所含的部分蜂斗菜内酯类化合物

取实施例1制备的毛裂蜂斗菜提取物20g，溶于石油醚，按常规进行硅胶柱层析，以石油醚-丙酮50-5：1层析，依次得Homofukinolide(7.9mg)、蜂斗菜内酯-Ⅰa(29mg)、蜂斗菜内酯-Ⅱa(65mg)、蜂斗菜内酯-B(1.6g)、蜂斗菜内酯-Ⅲa(2.8g)、蜂斗菜内酯-Ⅳa(2.9g)、蜂斗菜内酯-Ⅴa(50mg)、蜂斗菜内酯-D(2.6g)，其中蜂斗菜内酯-Ⅴa为新化合物。这些化合物的化学结构见表1，它们是蜂斗菜内酯类化合物，经HPLC测定分析，其中蜂斗菜内酯 -D、蜂斗菜内酯-B、蜂斗菜内酯-Ⅳa和蜂斗菜内酯-Ⅲa 4个化合物的含量之和占总提取物的50％以上，所以毛裂蜂斗菜提取物的主要成分是蜂斗菜内酯类化合物。经多次实验检测，蜂斗菜内酯-D、蜂斗菜内酯-B、蜂斗菜内酯-Ⅳa和蜂斗菜内酯-Ⅲa的含量之比依次为：0.1-5:0.1-5:1-9:1-9。

实施例3.用毛裂蜂斗菜制备蜂斗菜内酯类化合物

毛裂蜂斗菜的干燥叶35Kg，用乙醇回流提取三次，乙醇用量分别为175 L、70L、35L，提取时间分别为2小时、1小时、半小时。提取液减压浓缩后加水溶解，制成混悬液，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，分别得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物。将乙酸乙酯萃取物利用硅胶柱层析(层析硅胶200-300目，山东烟台芝罘黄务硅胶开发试验厂)，以正己烷-乙酸乙酯(8:1-1:1)梯度洗脱，根据薄层层析监测结果，将洗脱液合并为十三份。将第四份进行硅胶柱层析，以正己烷：乙酸乙酯为20：1洗脱，洗脱液浓缩后继续进行硅胶层析，用正己烷-乙酸乙酯之比为50：1洗脱，依次得 Homofukinolide(26.9mg)，蜂斗菜内酯-Ⅰa(65mg)，蜂斗菜内酯-Ⅱa (186.3mg)，蜂斗菜内酯-Fa(96.2mg)，蜂斗菜内酯-Fb(36.9mg)，蜂斗菜内酯-I(24.6mg)，蜂斗菜内酯-J(18.3mg)，蜂斗菜内酯-K(27.7mg)，蜂斗菜内酯-M(23.4mg)，蜂斗菜内酯-Na(13.0mg)，蜂斗菜内酯-Nb (34.8mg)，蜂斗菜内酯-O(21.7mg)，蜂斗菜内酯-P(32.9mg)和蜂斗菜内酯-Q(11.0mg)。将第五份经硅胶层析，正己烷-乙酸乙酯之比为10：1洗脱，得蜂斗菜内酯-De(4.2mg)，蜂斗菜内酯-Df(1.9mg)，蜂斗菜内酯-Dg (29.0mg)，蜂斗菜内酯-Dh(4.2mg)，蜂斗菜内酯-G(536.1mg)，蜂斗菜内酯-H(843.2mg)，蜂斗菜内酯-B(3.1g)，蜂斗菜内酯-Ⅲa(6.2g)，蜂斗菜内酯-R(36.9mg)，蜂斗菜内酯-S(23.7mg)，蜂斗菜内酯-T(15.8mg)，蜂斗菜内酯-Ua(15.6mg)，蜂斗菜内酯-Ub(17.0mg)，蜂斗菜内酯-V(14.2mg)，蜂斗菜内酯-Ⅲ(52.3mg)，蜂斗菜内酯-W(35.5mg)，蜂斗菜内酯-X(38.7mg)，蜂斗菜内酯-Ya(11.0mg)，蜂斗菜内酯-Yb(11.0mg)，蜂斗菜内酯-Za (11.3mg)，蜂斗菜内酯-Zb(11.1mg)。将第八部份经反复结晶过滤得蜂斗菜内酯-Ⅳa(4.8g)，蜂斗菜内酯-Ⅴa(50mg)。将第九部分经硅胶层析分离，得到蜂斗菜内酯-Uc(1.1g)。将第十三份进行硅胶层析分离，以正己烷 -乙酸乙酯之比为5：1洗脱，得蜂斗菜内酯-D(5.6g)，蜂斗菜内酯-Db (60.0mg)，蜂斗菜内酯-Dc(25.0mg)，蜂斗菜内酯-Dd(15.4mg)，蜂斗菜内酯-L(10.8mg)。

实施例4.用蜂斗菜制备蜂斗菜内酯类化合物

蜂斗菜的干燥根茎5Kg，用甲醇回流提取三次，甲醇用量分别为25L、 10L、5L，提取时间分别为2小时、1小时、半小时。提取液减压浓缩后加水溶解，制成混悬液，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取物。将石油醚萃物利用硅胶柱层析(层析硅胶200-300目，山东烟台芝罘黄务硅胶开发试验厂)，以正己烷-乙酸乙酯(20:1-1:1)梯度洗脱，依次得Homofukinolide(6.9mg)，蜂斗菜内酯-Ⅰa(5mg)，蜂斗菜内酯-Ⅱa(6.3mg)，蜂斗菜内酯-Fa(6.2mg),蜂斗菜内酯-Fb(26.9mg),蜂斗菜内酯-I(14.3mg), 蜂斗菜内酯-J(7.2mg),蜂斗菜内酯-K(17.3mg),蜂斗菜内酯-M(13.5mg), 蜂斗菜内酯-Na(7.0mg),蜂斗菜内酯-B(600.6mg)。将乙酸乙酯萃取物，用氯仿：甲醇之比为40：3洗脱，依次得蜂斗菜内酯-Nb(24.9mg),蜂斗菜内酯-O(11.7mg),蜂斗菜内酯-P(12.9mg),蜂斗菜内酯-Q(11.0mg)。再用用氯仿：甲醇之比为20：3洗脱，依次得蜂斗菜内酯-O(21.7mg)，蜂斗菜内酯-Uc(31.24mg)，蜂斗菜内酯-D(300.6mg)，蜂斗菜内酯-Db(10.0mg)，蜂斗菜内酯-Dc(15.0mg)，蜂斗菜内酯-Dd(5.4mg)，蜂斗菜内酯-L(2.8mg)。

本发明所述的毛裂蜂斗菜提取物所含的活性物质蜂斗菜内酯类化合物可参见中国发明专利ZL200610026133.1、ZL200710038961.1、 ZL200810039033.1中公开的所有蜂斗菜内酯类化合物的制备方法。

实施例5：药理活性试验

一、毛裂蜂斗菜提取物及其所含的蜂斗菜内酯类化合物对急性密闭缺氧小鼠存活时间的影响

1.材料和方法

1.1实验动物

SPF级6周龄ICR小鼠，雌雄各半，体重(20±2)g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号码：SCXK(沪)2012-0002。

动物饲养于清洁级动物房，自由进食与饮水，温度：(25±2)℃，湿度： 40％～60％，人工照明模拟昼夜变化。本实验方案遵守动物保护、动物福利和伦理原则及相关规定。

1.2实验分组

取健康ICR小鼠共220只，雌雄各半，适应性饲养3天后按体重随机分为11组：模型组、诺迪康(阳性对照)组、毛裂蜂斗菜提取物组、化合物4组，化合物5组，化合物7组，化合物8组，化合物12组，化合物19 组，化合物38组，化合物41组，每组20只。分组后，根据预试验结果确定给药剂量。各组给药剂量分别为诺迪康(阳性对照)组280mg/kg、毛裂蜂斗菜提取物组40mg/kg、化合物4组40mg/kg，化合物5组40mg/kg、化合物7组40mg/kg，化合物8组40mg/kg，化合物12组40mg/kg，化合物19组40mg/kg，化合物38组40mg/kg，化合物41组40mg/kg，模型组给予相同体积的0.5％CMC-Na溶液，给药方式为灌胃给药。给药1h后，将各组小鼠置于装有5g钠石灰的125ml广口瓶，每瓶1只，塞紧瓶盖，涂以凡士林，记录各组小鼠存活时间。

1.3检测指标与方法

小鼠于密闭广口瓶造模后，以呼吸停止为小鼠死亡的观察指标，立即用秒表记录每只小鼠从广口瓶密封开始到死亡为止的时间，统计各组小鼠存活时间。

1.4统计学分析

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析。对于计量资料，有效数据以 x±s表示，两组间均数比较采用ANOVA。

2.实验结果

2.1毛裂蜂斗菜提取物及其所含的蜂斗菜内酯类化合物对急性密闭缺氧小鼠存活时间的影响，实验结果如表2所示。

表2密闭缺氧小鼠存活时间

^*P<0.05，^**P<0.01，与模型组比较

由表2可以看出：毛裂蜂斗菜提取物组及蜂斗菜内酯类化合物4、5、7、 8、12、19、38、41均可明显延长密闭缺氧小鼠的存活时间，与模型组相比，差异有显著性(P＜0.01)。

本实验结果表明，毛裂蜂斗菜提取物及蜂斗菜内酯类化合物能明显延长密闭缺氧小鼠的存活时间。本发明毛裂蜂斗菜提取物及蜂斗菜内酯类化合物对密闭缺氧能发挥很好的防治作用。

二、毛裂蜂斗菜提取物及其所含的蜂斗菜内酯类化合物对小鼠急性减压缺氧死亡率的影响

1.仪器与设备

低气压环境模拟系统(江南造船厂)，滑阀式真空泵(浙江真空设备厂)，Alpha-1506P型紫外可见分光光度计(上海谱元仪器有限公司)，拜安捷2 血糖仪(BayerHealthCare LLC，USA)，TGL-16M型离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)，K30型旋涡振荡器(青浦泸西仪器厂)，HH-W600 型水浴锅(金南仪器制造有限公司)，PRO200型电动匀浆机(FLUKO)。

2.材料和方法

2.1实验动物

SPF级6周龄ICR小鼠，雌雄各半，体重(20±2)g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号码：SCXK(沪)2012-0002。

动物饲养于清洁级动物房，自由进食与饮水，温度：(25±2)℃，湿度： 40％～60％，人工照明模拟昼夜变化。本实验方案遵守动物保护、动物福利和伦理原则及相关规定。

2.2动物分组

取健康ICR小鼠共220只，雌雄各半，适应性饲养3天后按体重随机分为11组：模型组、诺迪康(阳性对照)组、毛裂蜂斗菜提取物组、化合物4组，化合物5组，化合物7组，化合物8组，化合物12组，化合物19组，化合物38组，化合物41组，每组20只。分组后，根据预试验结果确定给药剂量。各组给药剂量分别为诺迪康(阳性对照)组280mg/kg、毛裂蜂斗菜提取物组40mg/kg、化合物4组40mg/kg，化合物5组40mg/kg、化合物7组40mg/kg，化合物8组40mg/kg，化合物12组40mg/kg，化合物19组40mg/kg，化合物38组40mg/kg，化合物41组40mg/kg，模型组给予相同体积的0.5％CMC-Na溶液，给药方式为灌胃给药，每日给药1次，连续给药7d。最后1天灌胃给药后1h，将小鼠放入低压舱，密闭舱门，用真空泵以10m/min速度减压上升，在海拔高度至5000m和8000m时分别各停3min，最终升至10000m，1h后以20m/s缓慢降至正常海拔高度，开舱后统计各组动物的死亡率。

2.3小鼠减压缺氧存活率观察

小鼠于低压舱造模后，待缓慢降至正常海拔高度，迅速打开舱门，以呼吸停止为小鼠死亡的观察指标，统计各组的死亡率。

2.4统计学分析

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析。对于计量资料，有效数据以 x±s表示，两组间均数比较采用ANOVA，Dunnett-t test。

3.结果

3.1毛裂蜂斗菜提取物及蜂斗菜内酯类化合物对小鼠急性减压缺氧死亡率的影响如表3所示。

表3急性减压缺氧小鼠死亡率

^*P<0.05，与模型组比较

由表3可得，在小鼠急性减压缺氧实验中，模型组、诺迪康组、毛裂蜂斗菜提取物组的死亡率分别为65％，30％，25％，16％，20％，20％和20％。与模型组相比，诺迪康组能显著性降低死亡率(P<0.05)，毛裂蜂斗菜提取物组及化合物4、5、7、8、12、19、38、41组也均可降低死亡率，具有统计学意义(P<0.05)。

上述实验结果表明，毛裂蜂斗菜提取物及蜂斗菜内酯类化合物能明显降低减压缺氧小鼠的死亡率，因而对高原缺氧有明显保护作用。

上述药理活性试验结果表明，毛裂蜂斗菜提取物以及蜂斗菜内酯类化合物可明显延长密闭缺氧小鼠存活时间，降低急性减压缺氧小鼠死亡率，提示毛裂蜂斗菜提取物及蜂斗菜内酯类化合物对密闭缺氧和减压缺氧具有明显保护作用。

鉴于毛裂蜂斗菜提取物及其所含的蜂斗菜内酯类化合物在防治密闭缺氧和减压缺氧方面具有良好的效果，因而可以用于制备防治包括高原缺氧、密闭仓缺氧等高原病或缺氧症的药物。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (2)

1.毛裂蜂斗菜提取物在制备预防或治疗高原缺氧或密闭缺氧疾病药物中的应用，

所述的毛裂蜂斗菜提取物是用以下方法制备得到的：毛裂蜂斗菜根茎粉碎后，用乙醇提取得提取液，提取液减压浓缩后离心或过滤，弃沉淀，上清液或过滤液备用；将上述上清液或过滤液进行聚苯乙烯型多孔性吸附树脂吸附、水和50%的含水低级醇淋洗除去杂质后，用生药质量的4-12倍量体积的60-95%的含水的C1～C5低级醇洗脱后将洗脱液减压浓缩，干燥，得毛裂蜂斗菜提取物，所述低级醇选自甲醇、乙醇、丙醇。

2.根据权利要求1所述的毛裂蜂斗菜提取物在制备预防或治疗高原缺氧或密闭缺氧疾病药物中的应用，其特征在于，所述的药物是以毛裂蜂斗菜提取物为唯一药物活性成分和药学上可接受的辅料组成的药物组合物。