CN105273017B

CN105273017B - 一类来源连翘的化合物，其制法及在防治帕金森病的应用

Info

Publication number: CN105273017B
Application number: CN201410223754.3A
Authority: CN
Inventors: 陈乃宏; 张培成; 宋修云; 张凡; 张挽青; 杨桠楠; 冯子明; 姜建双
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2014-05-26
Filing date: 2014-05-26
Publication date: 2019-01-01
Anticipated expiration: 2034-05-26
Also published as: CN105273017A

Abstract

本发明涉及一类连翘中结构新颖的化合物及其制备方法以及该类化合物在防治帕金森病中的应用。经药理学试验证明，该类化合物能够有效抑制鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤，改善脂多糖(LPS)诱导的小胶质细胞神经炎症反应，降低炎症因子的释放，具有良好的抗帕金森病作用，有效剂量可达0.1μmol/L。可以用于制备成防治帕金森病的药物。

Description

一类来源连翘的化合物，其制法及在防治帕金森病的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一类从中药连翘中分离得到的新化合物及其在防治帕金森病中的应用。

背景技术

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是最常见的以运动功能紊乱为特征的神经系统退行性疾病，65岁以上人群的发病率为1％，我国大约有170万帕金森病患者。该病的发病率随着年龄的增大而上升，人口老龄化的加剧，使得发病人数还将呈现出逐年上升的趋势。PD严重危害着人类的健康，不仅给患者带来巨大的痛苦，而且给家庭和社会造成沉重的负担。目前对该病尚无有效的治疗方法，临床常用的左旋多巴替代疗法仅能够维持5年左右，随着疾病的进展，左旋多巴的药效逐渐减弱，并出现严重的毒副作用。因此探寻新的有效治疗方案迫在眉睫。

目前对于PD的病因及发病机制尚未完全明了；但已有大量研究发现，线粒体呼吸链复合物I抑制剂鱼藤酮的摄入，可导致选择性的黑质纹状体神经退行性疾病和胞浆内突触核蛋白免疫阳性包涵体的出现，即产生明显的PD病理症状。另外，目前越来越多的研究表明，神经炎症、小胶质细胞的激活也与帕金森病密切相关。小胶质细胞是中枢神经系统中的主要吞噬细胞，是神经炎症的主要参与者。在健康的脑中，静息状态的小胶质细胞发挥正常吞噬功能；当小胶质细胞被中度激活时，它能清除过多的神经毒素、死亡细胞及细胞碎片，维持中枢神经系统的稳态；当小胶质细胞被持续激活时，它可与MCP-1等化学因子结合，继而与神经元结合，在中枢神经系统的变性疾病中发挥重要作用。鉴于此，许多学者认为：抑制鱼藤酮神经毒性以及调控小胶质细胞减轻神经元的损伤，均为抗PD新药研发的可行性方向。

PD的主要病理改变是中脑黑质多巴胺能神经元的退化、凋亡，为此恢复多巴胺能神经元的功能，促进多巴胺的分泌就成为PD治疗的关键。中药以其毒副作用小、疗效持久、整体调节和协同效果好等优势，已成为近年来防治PD新药的研究热点。尽管这些中药的疗效评估、机制探讨仍基于实验室研究阶段，临床研究尚未提供确定性的结论，但大量的数据已奠定了一定的理论基础，为进一步遴选抗PD新药夯实了基础。

连翘(Fructus Forsythiae)，为木犀科植物连翘(Forsythia suspensa)的干燥果实，中医临床常配伍用于治疗急性风热感冒、痈肿疮毒、淋巴结结核、尿路感染等症，现代药理学发现连翘具有抗菌、抗炎、抗氧化、保护心血管的药效作用。连翘中化学成分复杂，主要为苯乙醇苷类，萜类，木脂素类，黄酮类，生物碱类，酚酸类以及其它类化合物。

申请者研究发现，从连翘中分离得到了一类结构新颖的化合物——forsythoneoside A～D，化学结构如下，经药理学实验证明该类化合物能够有效抑制鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤，改善脂多糖(LPS)诱导的小胶质细胞活化反应，降低炎症因子的释放，具有良好的防治帕金森病作用，有效剂量可达0.1μmol/L。目前，尚未见有将中药连翘用于治疗帕金森病的研究报道，也未见具有PC12细胞保护作用的连翘化合物单体的制备方法专利文献。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种新的防治帕金森病药物。

本发明第一方面提供一类来源于连翘的新化合物；

本发明第二方面提供了这类化合物的制备方法；

本发明第三方面提供了含有这类化合物的药物组合物；

本发明第四方面提供了这类化合物在防治帕金森病药物中的应用。

为解决上述技术问题，采用如下技术方案：

本发明第一方面提供了一类来源于连翘的新化合物forsythoneoside A～D，其结构如下：

本发明第二方面提供上述连翘新化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：连翘药材70％乙醇回流提取，浓缩后浸膏通过有机溶剂萃取、大孔吸附树脂层析、凝胶柱层析、反相硅胶柱层析及制备型HPLC分离纯化，得到上述化合物forsythoneoside A～D，经UV、IR、NMR、MS及CD等谱学手段分析鉴定其结构，为一类苯乙醇苷黄酮加合物，目前未有该类物质报道。

本发明第三方面涉及一种含有药物有效剂量的化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。通常本发明药物组合物含有0.1～95％重量的本发明化合物。在单元剂型中本发明化合物一般含量为0.1～100mg，优选的单元剂型含有4～50mg。

本发明化合物的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明化合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。

本发明化合物或含有它的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射和穴位注射等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

例如为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

例如为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、单硬脂酸甘油脂、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。

例如为了将给药单元制成胶囊，将有效成分本发明化合物与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。

例如，将本发明化合物制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂、肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。这些辅料是本领域常用的。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明化合物药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明化合物组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。本发明化合物的每天的合适剂量范围：本发明的化合物的用量为0.001～100mg/Kg体重，优选为0.1～60mg/Kg体重，更优选为1～30mg/Kg体重，最优选为2～15mg/Kg体重。成人患者服用的本发明化合物每日为10～500mg，优选为20～100mg，可一次服用或分2～3次服用；儿童服用的剂量按照每kg体重5～30mg，优选为10～20mg/kg体重。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药，这受限于给药医生的临床经验以及治疗手段的给药方案。本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。

本发明第四方面涉及上述连翘新化合物抗帕金森病方面的应用。体外抗抗帕金森病(PD)药理试验结果显示该类化合物能够有效抑制鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤,给药浓度达0.1μM时,化合物1*～4*可将细胞存活率由53.9％分别提高到59.2％、75.0％、64.0％、75.5％；选取化合物2*,对其神经保护作用机制进行初步研究,发现该加合物能有效改善脂多糖(LPS)诱导的小胶质细胞神经炎症反应,并可抑制NF-κB通路的激活,从而降低炎症因子的释放,因此具有良好的抗帕金森病作用。

有益技术效果：

1、本发明的一类连翘新化合物具有明显的防治帕金森病作用，其一，能够显著抑制鱼藤酮诱导神经毒性作用，药效可达0.1μmol/L，远高于阳性对照药辅酶Q10；其二，能够显著抑制LPS诱导的小胶质细胞神经炎症反应，药效也可达0.1μmol/L。

2、本发明的一类连翘新化合物结构新颖，未有文献报道，具有进一步开发成防治帕金森病药物的潜力。

附图说明

图1Western blot检测forsythoneoside B对LPS所致NF-κB通路激活的影响(LPS,100ng/mL)

具体实施方式

下面的实施例及药理活性实验用于进一步说明本发明，但这并不意味着对本发明的任何限制。

1、连翘单体化合物forsythoneoside A～D的制备方法

实施例1

10kg连翘药材经20L体积浓度为70％乙醇溶剂回流提取3次，每次2小时，提取液浓缩后得浸膏1.4kg，使用蒸馏水将所得浸膏密度调至1.10，依次使用2L的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取3次，正丁醇部位回收溶剂，得浸膏450g，使用蒸馏水(4L)分散溶解，上清液通过填充体积为10L的D101型大孔吸附树脂，使用水，15％乙醇，30％乙醇，50％乙醇，95％乙醇梯度(20L)洗脱，收集50％乙醇洗脱部分，回收溶剂后经Sephadex LH-20凝胶柱层析、ODS反相硅胶柱层析反复纯化得到上述化合物forsythoneoside A(30mg)、forsythoneoside B(25mg)、forsythoneoside C(15mg)、forsythoneoside D(15mg)，经UV、IR、NMR、MS及CD等谱学手段分析鉴定其结构，为一类苯乙醇苷黄酮加合物，

上述新化合物的波谱信息及核磁信号归属如下：

Forsythoneoside A：浅黄色不定形粉末；UVλmax(MeOH)nm:332,270,256；HR-ESI-MS m/z 1231.3354[M+H]⁺(calcd for C₅₆H₆₃O₁₃,1231.3348)；IR 3370.5,1692.6,1600.7,1519.4,1448.0cm^-1；(c 0.10MeOH)；CDλmax nm(Δε):368(+4.55),275(-1.28)；¹HNMR(500MHz,acetic acid-d₄)δ:6.52(1H,s,H-6),7.92(1H,d,J＝2.5Hz,H-12),7.10(1H,d,J＝8.5Hz,H-15),7.95(1H,dd,J＝8.5,2.5Hz,H-16),5.10(1H,d,J＝7.5Hz,H-17),3.76(1H,m,H-18),3.75(1H,m,H-19),3.60(1H,m,H-20),3.53(1H,m,H-21),3.86(1H,m,H-22a),3.54(1H,m,H-22b),4.70(1H,brs,H-23),3.85(1H,m,H-24),3.80(1H,m,H-25),3.50(1H,m,H-26),3.61(1H,m,H-27),1.20(1H,d,J＝6.0Hz,H-28),7.12(1H,s,H-2′),6.70(1H,s,H-5′),4.64(1H,m,H-7′),3.98(1H,m,H-8′a),3.87(1H,m,H-8′b),7.15(1H,d,J＝2.5Hz,H-10′),6.85(1H,d,J＝8.5Hz,H-13′),7.02(1H,dd,J＝8.5,2.5Hz,H-14′),7.64(1H,d,J＝16.0Hz,H-15′),6.33(1H,d,J＝16.0Hz,H-16′),4.48(1H,d,J＝8.0Hz,H-18′),3.56(1H,m,H-19′),3.84(1H,m,H-20′),4.98(1H,t,J＝10.0Hz,H-21′),3.39(1H,m,H-22′),3.65(1H,m,H-23′a),3.51(1H,m,H-23′b),4.74(1H,brs,H-24′),3.91(1H,m,H-25′),3.82(1H,m,H-26′),3.48(1H,m,H-27′),3.65(1H,m,H-28′),1.12(1H,d,J＝6.0Hz,H-29′)；¹³C NMR(125MHz,acetic acid-d₄)δ:161.1(C-2),138.7(C-3),181.5(C-4),162.7(C-5),102.6(C-6),161.5(C-7),103.6(C-8),156.8(C-9),110.0(C-10),125.0(C-11),119.5(C-12),147.0(C-13),151.5(C-14),118.8(C-15),126.9(C-16),107.8(C-17),77.4(C-18),79.6(C-19),72.3(C-20),78.3(C-21),70.6(C-22),103.6(C-23),73.8(C-24),74.3(C-25),75.9(C-26),71.3(C-27),19.8(C-28),115.7(C-1′),119.0(C-2′),144.0(C-3′),147.7(C-4′),106.7(C-5′),147.2(C-6′),36.3(C-7′),77.4(C-8′),130.0(C-9′),117.5(C-10′),147.6(C-11′),150.5(C-12′),118.6(C-13′),125.6(C-14′),149.8(C-15′),116.9(C-16′),170.5(C-17′),105.5(C-18′),76.8(C-19′),77.5(C-20′),73.9(C-21′),76.3(C-22′),69.6(C-23′),103.2(C-24′),73.6(C-25′),74.2(C-26′),75.8(C-27′),71.4(C-28′),19.6(C-29′)。

Forsythoneoside B：浅黄色不定形粉末；UVλmax(MeOH)nm:332,270,256；HR-ESI-MS m/z 1231.3323[M+H]⁺(calcd for C₅₆H₆₃O₃₁,1231.3348)；IR 3376.2,1694.6,1601.4,1516.8,1446.4cm^-1；(c 0.10MeOH)；CDλmax nm(Δε):368(-2.61),275(+5.38)；¹H NMR(500MHz,acetic acid-d₄)δ:6.53(1H,s,H-6),7.93(1H,d,J＝2.5Hz,H-12),7.10(1H,d,J＝8.5Hz,H-15),7.81(1H,dd,J＝8.5,2.5Hz,H-16),5.20(1H,d,J＝7.5Hz,H-17),3.75(1H,m,H-18),3.76(1H,m,H-19),3.64(1H,m,H-20),3.58(1H,m,H-21),3.83(1H,m,H-22a),3.56(1H,m,H-22b),4.76(1H,brs,H-23),3.88(1H,m,H-24),3.78(1H,m,H-25),3.48(1H,m,H-26),3.56(1H,m,H-27),1.17(1H,d,J＝6.0Hz,H-28),7.15(1H,s,H-2′),6.66(1H,s,H-5′),4.67(1H,m,H-7′),4.10(1H,m,H-8′a),3.78(1H,m,H-8′b),7.15(1H,d,J＝2.5Hz,H-10′),6.85(1H,d,J＝8.5Hz,H-13′),7.02(1H,dd,J＝8.5,2.5Hz,H-14′),7.64(1H,d,J＝16.0Hz,H-15′),6.33(1H,d,J＝16.0Hz,H-16′),4.50(1H,d,J＝8.0Hz,H-18′),3.69(1H,m,H-19′),3.77(1H,m,H-20′),5.04(1H,t,J＝10.0Hz,H-21′),3.69(1H,m,H-22′),3.70(1H,m,H-23′a),3.47(1H,m,H-23′b),4.70(1H,brs,H-24′),3.85(1H,m,H-25′),3.67(1H,m,H-26′),3.43(1H,m,H-27′),3.63(1H,m,H-28′),1.10(1H,d,J＝6.0Hz,H-29′)；¹³C NMR(125MHz,acetic acid-d₄)δ:161.4(C-2),138.6(C-3),181.5(C-4),162.7(C-5),102.6(C-6),161.6(C-7),103.9(C-8),157.0(C-9),110.1(C-10),125.2(C-11),120.2(C-12),147.0(C-13),151.2(C-14),118.6(C-15),126.3(C-16),107.2(C-17),77.3(C-18),79.7(C-19),72.4(C-20),78.5(C-21),70.0(C-22),103.6(C-23),73.8(C-24),74.3(C-25),75.8(C-26),71.3(C-27),19.7(C-28),115.6(C-1′),119.3(C-2′),143.7(C-3′),147.7(C-4′),106.7(C-5′),147.7(C-6′),36.6(C-7′),77.7(C-8′),130.0(C-9′),117.6(C-10′),147.6(C-11′),150.6(C-12′),118.5(C-13′),125.6(C-14′),149.9(C-15′),117.0(C-16′),170.5(C-17′),106.3(C-18′),76.9(C-19′),77.5(C-20′),74.1(C-21′),76.2(C-22′),69.8(C-23′),103.4(C-24′),73.6(C-25′),74.3(C-26′),75.8(C-27′),71.4(C-28′),19.6(C-29′)。

Forsythoneoside C:黄色不定形粉末；UVλmax(MeOH)nm:336,216；HR-ESI-MS m/z1233.3502[M+H]⁺(calcd for C₅₆H₆₅O₃₁,1233.3504)；IR 3394.2,1693.6,1602.8,1514.3,1444.9cm^-1；(c 0.09MeOH)；CDλmax nm(Δε):263(+5.52),225(-13.02)；¹H NMR(600MHz,acetic acid-d₄)δ:6.51(1H,s,H-6),7.71(1H,d,J＝1.8Hz,H-12),6.81(1H,d,J＝8.4Hz,H-15),7.29(1H,dd,J＝8.4,1.8Hz,H-16),5.06(1H,d,J＝7.8Hz,H-17),3.76(1H,m,H-18),3.73(1H,m,H-19),3.60(1H,m,H-20),3.48(1H,m,H-21),3.79(1H,m,H-22a),3.49(1H,m,H-22b),4.64(1H,brs,H-23),3.80(1H,m,H-24),3.78(1H,m,H-25),3.51(1H,m,H-26),3.53(1H,m,H-27),1.18(1H,overlap,H-28),7.00(1H,s,H-2′),6.83(1H,s,H-5′),2.65(2H,m,H-7′),3.84(1H,m,H-8′a),3.60(1H,m,H-8′b),7.13(1H,d,J＝1.8Hz,H-10′),6.85(1H,d,J＝8.4Hz,H-13′),7.00(1H,dd,J＝8.4,1.8Hz,H-14′),7.63(1H,d,J＝16.2Hz,H-15′),6.31(1H,d,J＝16.2Hz,H-16′),4.20(1H,d,J＝7.8Hz,H-18′),3.41(1H,m,H-19′),3.72(1H,m,H-20′),4.93(1H,t,J＝9.6Hz,H-21′),3.50(1H,m,H-22′),3.63(1H,m,H-23′a),3.50(1H,m,H-23′b),4.78(1H,brs,H-24′),3.98(1H,m,H-25′),3.85(1H,m,H-26′),3.48(1H,m,H-27′),3.67(1H,m,H-28′),1.15(1H,d,J＝6.0Hz,H-29′)；¹³C NMR(125MHz,acetic acid-d₄)δ:160.7(C-2),138.0(C-3),181.5(C-4),163.4(C-5),102.3(C-6),164.4(C-7),110.5(C-8),157.1(C-9),107.8(C-10),125.1(C-11),120.4(C-12),146.6(C-13),151.1(C-14),118.2(C-15),125.7(C-16),107.7(C-17),77.5(C-18),79.8(C-19),72.2(C-20),78.1(C-21),70.6(C-22),103.7(C-23),73.7(C-24),74.3(C-25),75.9(C-26),71.3(C-27),19.8(C-28),134.3(C-1′),120.9(C-2′),147.9(C-3′),146.0(C-4′),121.8(C-5′),125.1(C-6′),36.2(C-7′),73.5(C-8′),129.9(C-9′),117.5(C-10′),147.6(C-11′),150.6(C-12′),118.6(C-13′),125.6(C-14′),149.8(C-15′),116.9(C-16′),170.4(C-17′),105.6(C-18′),76.4(C-19′),77.3(C-20′),73.8(C-21′),76.5(C-22′),69.3(C-23′),103.1(C-24′),73.7(C-25′),74.3(C-26′),75.8(C-27′),71.2(C-28′),19.6(C-29′)。

Forsythoneoside D:黄色不定形粉末；UVλmax(MeOH)nm:336,216；HR-ESI-MS m/z1233.3504[M+H]⁺(calcd for C₅₆H₆₅O₃₁,1233.3504)；IR 3392.5,1693.2,1604.1,1514.2,1445.6cm^-1；(c 0.09MeOH)；CDλmax nm(Δε):273(-1.81),225(+8.95)；¹H NMR(600MHz,acetic acid-d₄)δ:6.51(1H,s,H-6),7.67(1H,d,J＝1.8Hz,H-12),6.83(1H,d,J＝8.4Hz,H-15),7.33(1H,dd,J＝8.4,1.8Hz,H-16),5.05(1H,d,J＝7.8Hz,H-17),3.72(1H,m,H-18),3.70(1H,m,H-19),3.59(1H,m,H-20),3.50(1H,m,H-21),3.79(1H,m,H-22a),3.49(1H,m,H-22b),4.64(1H,brs,H-23),3.81(1H,m,H-24),3.78(1H,m,H-25),3.52(1H,m,H-26),3.58(1H,m,H-27),1.21(1H,overlap,H-28),7.05(1H,s,H-2′),6.80(1H,s,H-5′),2.69(2H,m,H-7′),3.87(1H,m,H-8′a),3.63(1H,m,H-8′b),7.15(1H,d,J＝1.8Hz,H-10′),6.86(1H,d,J＝8.4Hz,H-13′),7.01(1H,dd,J＝8.4,1.8Hz,H-14′),7.64(1H,d,J＝16.2Hz,H-15′),6.32(1H,d,J＝16.2Hz,H-16′),4.14(1H,d,J＝7.8Hz,H-18′),3.44(1H,m,H-19′),3.70(1H,m,H-20′),4.93(1H,t,J＝9.6Hz,H-21′),3.53(1H,m,H-22′),3.72(1H,m,H-23′a),3.55(1H,m,H-23′b),4.79(1H,brs,H-24′),3.98(1H,m,H-25′),3.86(1H,m,H-26′),3.49(1H,m,H-27′),3.71(1H,m,H-28′),1.20(1H,d,J＝6.0Hz,H-29′)；¹³C NMR(125MHz,acetic acid-d₄)δ:161.1(C-2),138.2(C-3),181.9(C-4),163.6(C-5),102.4(C-6),164.5(C-7),110.7(C-8),157.2(C-9),108.1(C-10),125.3(C-11),120.4(C-12),146.7(C-13),151.2(C-14),118.3(C-15),126.0(C-16),107.9(C-17),77.7(C-18),79.8(C-19),72.7(C-20),78.4(C-21),70.8(C-22),103.8(C-23),73.9(C-24),74.5(C-25),76.1(C-26),71.6(C-27),19.9(C-28),134.5(C-1′),120.4(C-2′),147.9(C-3′),146.2(C-4′),122.0(C-5′),125.2(C-6′),36.3(C-7′),73.5(C-8′),130.3(C-9′),117.8(C-10′),147.8(C-11′),150.7(C-12′),118.8(C-13′),125.6(C-14′),149.8(C-15′),117.2(C-16′),170.5(C-17′),105.8(C-18′),76.7(C-19′),77.5(C-20′),73.9(C-21′),76.8(C-22′),69.8(C-23′),103.4(C-24′),73.5(C-25′),74.3(C-26′),76.1(C-27′),71.5(C-28′),19.8(C-29′)。

二、连翘单体化合物的药理活性实验

国内外研究发现，长期接触鱼藤酮的实验大鼠，可出现类似样帕金森病理学及行为学改变，包括黑质纹状体DA神经元减少等。本发明通过药理学试验，发现化合物forsythoneoside A～D具有明显的抑制鱼藤酮诱导的PC12细胞(具有典型的神经内分泌细胞特征)损伤的作用,可用于制备成预防或治疗PD的药物。

实验例1

连翘化合物对体外神经细胞(PC12)损伤的影响

取铺满单层的PC12细胞(模拟神经元细胞)，弃去原培养液，加入5％FBS、5％马血清的DMEM完全培养液，用吸管轻轻吹打使细胞分散完全，以5×10⁴个/mL密度，每孔100μL接种于预先用多聚赖氨酸(0.1mg/mL)处理过的96培养板中，培养24h即可用于实验。实验分为空白组、模型组和加药组。空白组给予完全培养基，鱼藤酮造模组是加入终浓度为4μM鱼藤酮的完全培养基作用细胞48h(模拟PD模型)，氧糖剥夺(OGD)组是采用低糖完全培养基及加入终浓度为5mM的连二亚硫酸钠作用细胞24h(模拟脑缺血模型)，Aβ_25-35造模组是加入终浓度为15μM Aβ_25-35的去血清培养基作用细胞24h(模拟AD模型)。加药组则在造模的同时加入10μM、1μM或0.1μM受试化合物。细胞增殖实验是除空白组外，加药组加入终浓度为1μM受试化合物的完全培养基作用48h。然后加入10μL 5mg/mL MTT,4h后去上清，加入100μLDMSO，以550nm吸光度值表示存活细胞数。

结果见表1、表2。如表1，鱼藤酮、氧糖剥夺、Aβ_25-35可明显减少PC12细胞存活率，而10μM化合物forsythoneoside A、forsythoneoside B、forsythoneoside C、forsythoneoside D对鱼藤酮所导致的PC12细胞损伤均有很好的改善作用，可改善60-90％，对缺糖缺氧损伤均无保护作用，forsythoneoside A、C、D对Aβ_25-35模型无改善作用，虽然forsythoneoside B对Aβ_25-35模型具有改善作用，但改善程度远低于对鱼藤酮模型损伤的改善程度。

实验结果见表2。结果表明在筛选的4个单体化合物中，forsythoneoside B、forsythoneoside D在1μM和0.1μM剂量下均显现明显的保护作用，效果强于其他受试样本。另外，经增殖实验可知，forsythoneoside B、forsythoneoside D不具有促进细胞增殖的作用，即其在鱼藤酮模型中对P12细胞的保护作用不来源于化合物的促增殖作用。

表1连翘系列化合物对PC12细胞损伤的影响(10μM means±SD，n＝6)

^###p<0.001vs空白对照组,^***p<0.001vs模型对照组

表2连翘系列化合物对鱼藤酮所致PC12细胞损伤的影响(1μM、0.1μM means±SD,n＝6)

^###p<0.001vs空白对照组,^*p<0.05,^**p<0.01,^***p<0.001vs模型对照组

实验例2

连翘化合物对体外脂多糖(LPS)所致小胶质细胞(BV2)激活的影响

取铺满单层的BV2细胞(模拟神经小胶质细胞)，弃去原培养液，加入10％FBS的DMEM完全培养液，用吸管轻轻吹打使细胞分散完全，以5×10⁵个/mL密度，每孔300μL接种于预先用多聚赖氨酸(0.1mg/mL)处理过的24孔培养板中，培养24h即可用于实验。实验分为空白组、模型组和加药组。空白组给予完全培养基，LPS造模组是加入终浓度为100ng/mL LPS的完全培养基(模拟神经炎症模型)。加药组则在造模的同时加入10μM、1μM或0.1μM受试化合物。作用细胞24h，显微镜观察细胞形态，取上清离心后，按欣博盛小鼠TNF-α、IL-1βELISA试剂盒说明书方法，检测上清中炎症因子TNF-α、IL-1β的含量。

显微镜观察结果表明，较空白组比较，100ng/mL LPS的模型组细胞胀大变圆，细胞平趴开在底面，呈阿米巴状。给予连翘化合物细胞状态明显好转，细胞光度良好，阿米巴状细胞数明显减少，提示连翘化合物可以抑制LPS所致BV2细胞激活。

如表3，炎性因子TNF-α、IL-1β释放的检测结果表明，100ng/mL LPS可显著提高BV2细胞培养上清中TNF-α、IL-1β的含量(P<0.001，P<0.001)，而连翘化合物forsythoneosideA～D在10μM剂量下均可不同程度抑制两种炎症因子的释放。其中TNF-α：forsythoneosideD在1μM剂量下能显著降低TNF-α含量(P<0.001，P<0.01)，forsythoneoside B在1μM、0.1μM两个剂量下均可显著抑制TNF-α释放(1μM：P<0.001，P<0.001；0.1μM：P<0.001，P<0.01)。IL-1β：除了forsythoneoside C，在1μM剂量下的其它连翘提取物均能显著降低IL-1β的释放，forsythoneoside B在0.1μM剂量下也可显著抑制IL-1β释放(P<0.01，P<0.01，P<0.01，P<0.01)，并且均呈剂量依赖关系。

表3连翘系列化合物对LPS所致小胶质细胞BV2炎症反应的影响(10μM、1μM、0.1μM，means±SD，n＝4)

^###p<0.001vs空白对照组,^*p<0.05,^**p<0.01，^***p<0.001vs模型对照组

化合物A：forsythoneoside A

化合物B：forsythoneoside B

化合物C：forsythoneoside C

化合物D：forsythoneoside D

由实验例1和实验例2中结果可知，连翘化合物forsythoneoside A～D在10μM剂量下均能显著改善鱼藤酮所导致的神经细胞毒性，其中forsythoneoside B、forsythoneoside D在0.1～10μM各剂量均能改善鱼藤酮神经毒性，具有剂量依赖关系，说明它们对于环境因素所导致的帕金森氏病症可能具有改善作用。另外，已有大量研究表明，连翘类中化合物多具有抗氧化和抗炎的作用。因此，我们对其抗氧化和抗炎作用进行进一步研究，以确定其神经保护作用的机制。通过研究发现，这几种连翘化合物在10μM的高浓度情况下，均不能改善缺糖缺氧所导致的神经细胞损伤，即它们不能对抗脑缺血，或者说它们几乎没有抗氧化作用或作用不强。但是，这些化合物对抗LPS所导致的小胶质细胞炎症作用却十分明显，其中forsythoneoside B、forsythoneoside D具有最好的抗炎作用。另外，forsythoneoside B较低的对抗Aβ_25-35神经毒性的作用可能与其较好的抗神经炎症作用有关。而forsythoneoside B和forsythoneoside D作为具有最好的神经保护作用的新化合物，具有进一步研究的价值。

实验例3

连翘提取化合物forsythoneoside B对LPS所致BV2激活的影响——NF-κB通路

BV2细胞培养方式同实例2，以1×10⁶个/mL密度，每孔1.5mL接种于预先用多聚赖氨酸(0.1mg/mL)处理过的6孔培养板中，培养24h即可用于实验。实验分为空白组、模型组和加药组。空白组给予完全培养基，LPS造模组是加入终浓度为100ng/mL LPS的完全培养基。加药组则在造模的同时加入0.1μM、1μM或10μM受试化合物。作用细胞24h，裂解细胞，参照胞浆蛋白提取方法获得胞浆蛋白，采用10％的SDS-PAGE胶电泳，分别加入NF-κB、IκB及β-actin抗体，采用ECL显色检测蛋白表达情况。

NF-κB、IκB与炎症的关系：炎症物质LPS能够使胞浆中IκB磷酸化后被泛素化降解，IκB含量显著降低，NF-κB与IκB解离，NF-κB移位入核使胞核中的NF-κB显著增加，同时这种NF-κB的反馈激活又会导致核中的IκB反馈性表达升高。即炎症发生过程中小胶质细胞胞浆中NF-κB、IκB的表达均显著降低。

实验结果如图1所示，和空白组比较，LPS组胞浆中NF-κB、IκB蛋白表达变化均明显下降，即IκB磷酸化后被泛素化降解、NF-κB移位入核，启动炎症反应。给予化合物forsythoneoside B能剂量依赖性增加胞浆中NF-κB、IκB蛋白的表达，从而减少IκB的降解与NF-κB的入核，减少NF-κB下游炎症相关蛋白的表达，最终抑制小胶质细胞的炎症反应。

因此，由上述实验结果可见，forsythoneoside B对LPS导致的神经炎症反应有较好的改善作用，这可能与其抑制NF-κB通路的激活，保护小胶质细胞免受炎症损伤有关。

Claims

1.如下结构式所示的化合物及其药学上可接受的盐：

2.根据权利要求1所述的化合物及其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的其药学上可接受的盐选自化合物和无机酸、有机酸成的盐。

3.一种药物组合物，其特征在于，含有作为有效成分的如权利要求1～2任一所述的化合物及其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。

4.根据权利要求3的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型选自片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液或混悬剂。

5.权利要求1所述的任一化合物及其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗帕金森病的药物中的应用。