KR101689656B1 - 머위 잎 추출물을 포함하는 기억력 개선용 조성물 - Google Patents
머위 잎 추출물을 포함하는 기억력 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 기억력 개선 효과를 갖는 머위 잎 추출물의 제조방법 및 머위 잎 추출물을 포함하는 기억력 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 제조방법으로 얻어진 머위 잎 추출물은 신경세포의 보호 및 재생에 우수한 효과를 나타낸다.
Description
본 발명은 기억력 개선 효과를 갖는 머위 잎 추출물의 제조방법 및 머위 잎 추출물을 포함하는 기억력 개선용 조성물에 관한 것이다.
기억력 개선과 관련된 연구는 주로 생약 등의 천연물로부터 추출하거나 복합추출물을 이용한 것으로 동물실험에서 일정부분의 인지능력 개선을 보였으나 미비한 수준의 개선효과를 나타내는 한계가 있고, 확실한 기전이나 작용 부위가 밝혀지지 않은 실험 결과에 의존하는 경우가 많고 생약을 이용한 단일 추출물이나 한의학 처방전을 근거로 한 복합추출물들은 실제독성을 포함하고 있으며, 다량 섭취 시 간 독성을 일으키는 등의 문제점이 있었다. 또한, 머위 추출물을 제조하기 위한 기존의 연구는 유기용매인 에탄올, 헥산, 부탄올을 연속해서 사용하는 추출과정이 포함되어 매 과정마다 용매를 제거하기 위해 감압농축을 시행하는 방법을 이용하는데 이러한 과정은 오랜 시간이 소요되고 복잡한 과정에서 실수가 발생할 가능성이 높으며, 추출과정에서 헥산, 부탄올 등의 인체에 유독한 화학물질을 사용하므로 별도의 추출시설이 필요할 뿐만 아니라 유효성분의 수율이 1% 정도로 매우 낮아 경제성이 떨어지는 단점이 있다.
관련 선행기술(등록특허 제10-0535655호)은 알코올을 이용하여 추출한 항산화 활성을 갖는 머위 추출물 및 이를 함유하는 뇌질환 예방 및 치료용 항산화제에 관하여 기재하고 있으나, 머위 잎에서 신경세포 보호 효과를 나타내는 성분만을 최적으로 추출하는 제조방법의 개발이 요구되어, 이에 본 발명자들은 머위 잎을 단순한 물 추출이나 에탄올 추출이 아닌 물 추출 후 동결 건조, 그 후 에탄올 침전물을 제조하는 방법을 통해 해마의 신경세포를 직접적으로 보호하는 효과를 나타내는 성분을 수득하게 되었고, 경구 투여를 통해 대사 후 뇌 조직에까지 직접적으로 작용할 수 있고 독성이 없어 장기적으로 섭취할 경우에도 부작용이 없도록 개발하게 되었다.
본 발명의 목적은 (a) 머위 잎에 물을 첨가하여 추출하는 단계; (b) 상기 머위 잎 추출물을 동결 건조하는 단계; (c) 상기 머위 잎 추출물의 동결 건조물에 에탄올을 첨가한 후 침전시키는 단계; 및 (d) 상기 침전물의 상층액을 제거하고 침전물을 동결 건조하는 단계를 포함하는 머위 잎 추출물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, (a) 머위 잎에 물을 첨가하여 추출하는 단계; (b) 상기 머위 잎 추출물을 동결 건조하는 단계; (c) 상기 머위 잎 추출물의 동결 건조물에 에탄올을 첨가한 후 침전시키는 단계; 및 (d) 상기 침전물의 상층액을 제거하고 침전물을 동결 건조하는 단계를 포함하는 머위 잎 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 (c) 단계에서 에탄올은 50 내지 80% 에탄올인 것을 특징으로 하고, 상온에서 20 내지 30 시간 동안 침전시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 머위 잎 추출물은 기억력 개선능을 가지고, 3,5-di-O-caffeoylquinic acid(3,5-디-O-카페오일퀴닉산), 4,5-di-O-caffeoylquinic acid(4,5-디-O-카페오일퀴닉산), 3,4-di-O-caffeoylquinic acid(3,4-디-O-카페오일퀴닉산) 및 6,7-dihydroxy-4-(3,4-dihydroxyphenyl)naphthalene-2-carboxylic acid(6,7-디히드록시-4-(3,4-디히드록시페닐)나프탈렌-2-카르복시산) 로 구성된 군에서 선택되는 성분을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 얻어진 머위 잎 추출물을 포함하는 기억력 개선용 약학 조성물 및 건강기능식품을 제공한다.
상기 약학 조성물은 신경세포의 보호 및 재생 효과를 갖는 것을 특징으로 하고,
경구, 피하, 정맥 내, 근육 내, 비강 내 또는 복강 내로 투여되는 것을 특징으로 하는 할 수 있고, 정제, 캡슐제, 과립제, 환제, 시럽제, 액제, 유제, 현탁제 또는 주사제의 형태로 제조되는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 건강기능식품은 신경세포의 보호 및 재생 효과를 갖는 것을 특징으로 하고, 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제 중 하나 이상을 더 포함하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액제 제형으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 제형으로 제형된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물 또는 건강기능식품은 3,5-di-O-caffeoylquinic acid(3,5-디-O-카페오일퀴닉산), 4,5-di-O-caffeoylquinic acid(4,5-디-O-카페오일퀴닉산), 3,4-di-O-caffeoylquinic acid(3,4-디-O-카페오일퀴닉산) 및 6,7-dihydroxy-4-(3,4-dihydroxyphenyl)naphthalene-2-carboxylic acid(6,7-디히드록시-4-(3,4-디히드록시페닐)나프탈렌-2-카르복시산) 로 구성된 군에서 선택되는 성분을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
기존의 물 추출이나 주정 추출을 통한 머위 잎 추출물에는 머위 잎의 여러 성분이 함께 추출되어 신경 세포 보호 효과를 나타내는 성분만을 효과적으로 추출하는 데 한계가 있었다.
본 발명에 있어서, 머위 잎을 물 추출한 후 동결 건조하는 단계를 거치지 않으면 에탄올에 머위 잎 물 추출물의 불필요한 성분이 녹아나지 않게 된다. 에탄올은 50 내지 80% 에탄올인 경우에 불필요한 성분이 잘 녹아나게 되고 특히 에탄올 70%에서 머위 잎 물 추출 동결건조품의 불필요한 성분이 잘 녹아나게 되어, 불필요한 성분이 녹아 있는 상층부를 제거하고 침전물만 회수하여 유용한 머위 잎 추출물을 획득할 수 있다. 본 발명에 따르면, 머위 잎을 물 추출하는 단계, 동결 건조하는 단계, 에탄올 추출하는 단계를 순차적으로 거침으로써, 머위 잎의 불필요한 성분을 효과적으로 제거하고 유용한 성분만을 회수하여 신경 세포 보호 효과를 나타내는 머위 잎 추출물을 수득할 수 있게 된다.
본 발명에 따른 기억력 개선용 건강기능식품은 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제 중 하나 이상을 더 포함하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액제 제형으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 제형된 것을 특징으로 한다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 식품류 등이 있다. 상기 본 발명에 더 포함될 수 있는 첨가제로는, 천연 탄수화물, 향미제, 영양제, 비타민, 광물(전해질), 풍미제(합성 풍미제, 천연 풍미제 등), 착색제, 충진제(치즈, 초콜렛 등), 팩트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH조절제, 안정화제, 방부제, 산화 방지제, 글리세린, 알콜, 탄산화제 및 과육으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 사용할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명에 따른 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명에 따른 조성물은 천연 과일 쥬스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
상기 담체, 부형제, 희석제 및 첨가제의 구체적인 예로는 이에 한정하는 것은 아니나, 락토즈, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 에리스리톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 미세결정성 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸셀룰로즈, 물, 설탕시럽, 메틸셀룰로즈, 메틸 하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 활석, 스테아트산 마그네슘 및 미네랄 오일로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상이 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 기억력 개선용 건강기능식품을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 상기 상술한 제형 내 유효성분으로서의 본 발명에 따른 추출물의 함량은 사용 형태 및 목적, 환자 상태, 증상의 종류 및 경중 등에 의하여 적절하게 조절할 수 있으며, 고형분 중량 기준으로 0.001 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 50 중량%일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
한편, 머위(일반명: Butterbur 또는 학명: Petasites japonicus)는 유럽뿐만 아니라 아시아 일부 및 북미에서 발견되는 다년생 관목이다. 머위의 뿌리 및 잎으로부터 분리한 추출물은 2,000년 이상 동안 치료제의 용도로 사용되었다. 오늘날 머위 추출물은 근육을 이완하는데 주로 사용되고, 위장내 복통, 평활근의 경련과 같은 상태에 처치하며, 통증 완화 효과가 있고 또한 두통에도 사용될 수 있다고 보고되었다(Eaton J., Townsend Lett, 2000, 202, 104-106). 또한, 머위는 천식 및 알레르기성 질환에 대해 치료 효과가 있다고 보고된 바 있다(Thomet OA, Simon HU, Int Arch Allergy Immunol, 2002, 129(2), 108-12).
본 발명에 따른 제조방법으로 얻어진 머위 잎 추출물은 신경세포의 보호 및 재생에 우수한 효과를 나타낸다.
도 1은 머위 잎 추출물에 따른 세포 생존률을 나타낸 것이다.
도 2는 KP-1의 농도별 투여에 따른 세포 독성 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 KP-1의 농도별 투여에 따른 신경 세포 보호 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 KP-1의 1차 분리물 F1-F8의 세포 생존률을 나타낸 것이다.
도 5는 KP-1의 2차 분리물 f3-f11의 세포 생존률을 나타낸 것이다.
도 6은 KP-1의 농도별 투여에 따른 기억력 개선 효과를 확인한 것이다.
도 7은 실험 쥐의 해마조직의 조직 손상 여부 및 회복 여부를 관찰한 것이다.
도 8은 KP-1의 농도별 투여에 따른 해마조직의 조직 재생 및 보호 효과를 확인한 것이다.
도 9는 단순한 물 추출, 에탄올 추출에서 신경세포 보호 효과가 나타나지 않는 것을 확인한 것이다.
도 2는 KP-1의 농도별 투여에 따른 세포 독성 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 KP-1의 농도별 투여에 따른 신경 세포 보호 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 KP-1의 1차 분리물 F1-F8의 세포 생존률을 나타낸 것이다.
도 5는 KP-1의 2차 분리물 f3-f11의 세포 생존률을 나타낸 것이다.
도 6은 KP-1의 농도별 투여에 따른 기억력 개선 효과를 확인한 것이다.
도 7은 실험 쥐의 해마조직의 조직 손상 여부 및 회복 여부를 관찰한 것이다.
도 8은 KP-1의 농도별 투여에 따른 해마조직의 조직 재생 및 보호 효과를 확인한 것이다.
도 9는 단순한 물 추출, 에탄올 추출에서 신경세포 보호 효과가 나타나지 않는 것을 확인한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1]
머위 잎 추출물(KP-1)의 제조 및 세포독성과 신경세포 보호 효과의 확인
머위 잎 1kg에 20배수의 물을 첨가하여 추출한 뒤 추출물을 동결 건조시켜, 동결건조품 250g을 수득하였다(머위 잎 대비 25%). 그 다음, 머위 잎 물 추출 동결건조품에 70% 에탄올을 첨가하여 24 시간 동안 상온에서 용출시켰다. 24 시간 경과 후, 불필요한 물질이 녹아있는 상층부를 제거하고 머위 잎 추출물만 남아있는 침전물을 회수하여 동결 건조하여 동결건조품 150g을 수득하였다(물 추출 동결건조품 대비 60%). 최종 수득율은 사용된 머위 잎 대비 15%, 머위 잎 물 추출 동결건조품 대비 60%에 해당하였다. 하기 표 1과 같이, 머위 잎의 추출방법에 따른 샘플을 제작하고 세포 독성과 신경세포 보호 효과를 확인하였다. 그 결과, 샘플 4에서 가장 우수한 효과를 나타내어, 이를 KP-1이라 명명하였다(도 1).
| 시료명 | 추출방법 |
| Sample 1 | 등록특허 제10-0535655호의 제조방법 |
| Sample 2 | 머위 물 추출물 동결건조품의 -25℃에서의 에탄올 침전의 상층액 |
| Sample 3 | 머위 물 추출물 동결건조품의 상온에서의 에탄올 침전의 상층액 |
| Sample 4 | 머위 물 추출물 동결건조품의 상온에서의 에탄올 침전의 침전물 |
| Sample 5 | 머위 물 추출물 동결건조품의 레진칼럼 물 분리물질 |
| Sample 6 | 머위 물 추출물 동결건조품의 레진칼럼 에탄올 분리물질 |
기억력을 주관하는 해마의 세포 조직인 HT22세포는 96 웰 세포 배양 플레이트(1 x 104 cell/well)에 10% FBS (열-비활성), 1% PS가 함유된 DMEM 배지에 24시간 동안 배양 후, 시료만을 처리(세포 독성)하거나 시료 및 Aβ 독성을 처리(신경보호 효능)하고 37℃에서 12시간 배양한 후 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide(MTT) 용액을 넣고 2시간 반응시킨 후 570 nm에서의 흡광도를 측정하여 평가하였다. KP-1의 농도별 투여를 통한 세포 독성을 확인한 결과, 독성을 나타내지 않음을 확인하였다(도 2). 또한, KP-1의 농도별 투여를 통한 신경 세포 보호 효과를 확인한 결과, KP-1 300㎍/㎖ 에서 80% 이상의 세포 생존률을 나타내었다(도 3).
[실시예 2]
머위 잎 추출물(KP-1)의 유효성분 확인
KP-1의 유효성분을 탐색하기 위하여 레진 DIAION HP-20을 이용하여 KP-1을 F1-F8로 분리한 후, 가장 높은 세포 생존률을 나타내는 F4를 KP-1F4로 명명하였다(도 4). KP-1F4를 SEPHADEX LH2로 f1-f11까지 2차 분리하였다. 그 결과, f1 및 f2는 예비실험에서 활성을 보이지 않았고, f9와 f11에서 75% 이상의 세포 생존률을 나타내었다(도 5). f9 및 f11을 LC-MASS 및 NMR을 통해 유효성분을 정제하였고, f9의 성분은 하기 화학식 1 내지 3이고 f11의 성분은 하기 화학식 4인 것으로 확인되었다:
[화학식 1]
3,5-di-O-caffeoylquinic acid (3,5-디-O-카페오일퀴닉산)
[화학식 2]
4,5-di-O-caffeoylquinic acid (4,5-디-O-카페오일퀴닉산)
[화학식 3]
3,4-di-O-caffeoylquinic acid (3,4-디-O-카페오일퀴닉산)
[화학식 4]
6,7-dihydroxy-4-(3,4-dihydroxyphenyl)naphthalene-2-carboxylic acid (6,7-디히드록시-4-(3,4-디히드록시페닐)나프탈렌-2-카르복시산)
[실시예 3]
머위 잎 추출물의 기억력 개선 효과 확인
ICR(male, 7주령)을 1주일간 순화 및 사육을 거쳐 사용하였다. 본 실험의 사육 환경은 온도 20-24℃, 상대습도 50-60%, 환기 횟수 15회/h, 조명시간 light & dark system 12시간 (07:00-19:00), 조도 150-200 Lux로 설정된 곳에서 사육하였고, 마우스용 고형사료와 물은 자유 섭취하도록 하였다. 미국 국립보건원(NIH, National Institutes of Health)에서 제시한 기준(No. 86-23, revised 1985)을 준수한 경희대학교 동물사육 규정을 따라 사육하였다.
Aβ 유도 알츠하이머형 치매 모델에서의 머위 잎 추출물의 기억력 개선 효능을 확인하기 위하여 수동회피실험을 수행하였다. 쥐의 밝은 곳에서 어두운 곳으로 가려는 습성을 이용하여 어두운 곳에 전기적 충격을 가하는 장치를 이용하였다. 상자를 칸막이를 이용하여 두 구획으로 구분하고 동물이 어두운 구획으로 넘어가는 즉시 0.5 mA의 전류를 바닥의 스테인리스 그리드를 통해 3초 동안 흘려 전기충격을 가하고, 쥐가 조명이 켜진 구획으로 넘어간 뒤 입구가 닫힐 때까지의 시간(latency)을 측정하였다. 24시간 후 다시 밝은 구역에 위치시켰을 때 어두운 구획으로 들어가기까지의 시간을 측정하였고 측정시간은 최대 5분으로 하였다. 그 결과, 머위 잎 추출물을 투여한 경우에 유의적인 기억력 개선 효과가 나타나는 것을 확인하였다. 도 6에 나타난 바와 같이, KP-1을 3㎍/㎖, 10㎍/㎖, 30㎍/㎖ 투여한 경우 모두 유의적인 기억력 개선 효과를 나타내었다((a) 정상대조군: 머위시료 대신 생리식염수를 경구투여하면서 기억력 감퇴를 유도하지 않은 군, (b) Aβ 유도 기억력 감퇴 대조군: 머위시료 대신 생리식염수를 경구투여하면서 Aβ stereotaxic injection하여 기억력 감퇴를 유도한 군, (c) 양성 대조군: donepezil을 경구투여하면서 Aβ stereotaxic injection하여 인지기능을 저하시킨 군, (d) 머위 투여군: 머위시료를 경구투여하면서 Aβ stereotaxic injection하여 인지기능을 저하시킨 군).
[실시예 4]
뇌 조직 내 해마세포의 활성 확인
동물실험 결과 머위 잎 추출물이 기억력 개선 효과를 나타내는 것을 확인하였으나, 좀 더 객관적인 효능을 확인하고자 동물 행동 실험 쥐의 해마조직을 슬라이스한 후 조직 손상 여부 및 회복 여부를 객관적으로 관찰하였다. 해마 세포의 CA1 부위의 조직 절편을 PBS로 세척한 후 cresyl violet 시약과 반응시키고 조직의 탈수 및 투명화 과정을 거친 후 현미경으로 관찰하였다(cresyl violet 염색). 조직 절편을 0.6% 과산화수소와 PBS로 세척한 후 10% normal serum과 1차 항체를 4℃에서 하루 밤 동안 반응시킨 뒤, 다시 1시간 동안 37℃에서 2차 항체를 반응시키고 ABC와 DAB 발색 과정을 거친 후 현미경으로 관찰하였다(면역조직화학염색)(도 7). 조직 염색 결과를 정량화한 결과 KP-1을 3㎍/㎖, 10㎍/㎖, 30㎍/㎖ 투여한 경우 모두 유의적으로 해마 조직 내 CA1 부위에서 조직 재생 및 보호 효과가 나타나는 것을 확인하였다(도 8).
[비교예]
머위 잎을 단순히 물 추출, 에탄올 추출한 경우에 머위 잎 추출물이 신경 세포 보호 효과를 나타내는지 실험한 결과, 머위 잎의 다양한 성분들이 함께 추출되어 효과적으로 조직에 침투되지 않아 신경 세포 보호 효과를 나타내지 못하였다(도 9).
Claims (14)
- (a) 머위 잎에 물을 첨가하여 추출하는 단계;
(b) 상기 머위 잎 추출물을 동결 건조하는 단계;
(c) 상기 머위 잎 추출물의 동결 건조물에 에탄올을 첨가한 후 침전시키는 단계; 및
(d) 상기 침전물의 상층액을 제거하고 침전물을 동결 건조하는 단계를 포함하고,
상기 (c) 단계에서 동결 건조물의 불순물은 에탄올에 녹아 있는 것을 특징으로 하는 머위 잎 추출물을 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 에탄올은 50 내지 80% 에탄올인 것을 특징으로 하는 머위 잎 추출물을 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (c) 단계는 상온에서 20 내지 30 시간 동안 침전시키는 것을 특징으로 하는 머위 잎 추출물을 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 머위 잎 추출물은 기억력 개선능을 가지는 것을 특징으로 하는 머위 잎 추출물을 제조하는 방법.
- 제4항에 있어서,
상기 머위 잎 추출물은 3,5-di-O-caffeoylquinic acid(3,5-디-O-카페오일퀴닉산), 4,5-di-O-caffeoylquinic acid(4,5-디-O-카페오일퀴닉산), 3,4-di-O-caffeoylquinic acid(3,4-디-O-카페오일퀴닉산) 및 6,7-dihydroxy-4-(3,4-dihydroxyphenyl)naphthalene-2-carboxylic acid(6,7-디히드록시-4-(3,4-디히드록시페닐)나프탈렌-2-카르복시산)로 구성된 군에서 선택되는 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 머위 잎 추출물을 제조하는 방법.
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