KR102576222B1 - 포도나무 줄기 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

포도나무 줄기 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 포도나무 줄기 추출물 및 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 유효성분인 포도나무 줄기(결과모지) 추출물은 포도나무 원줄기 껍질 추출물에 비해 HSV-1 바이러스의 세포내 감염을 억제하였고, 포도나무 줄기 추출물로부터 분리된 화합물의 HSV-1 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 확인한 결과, 비티신 A 및 B의 세포내 감염 억제 효과가 분리된 타 화합물(ε-비니페린, 카라페놀 A, 베투인, cis-비티신 A, 암펠롭신 A, 루페올, 말리바톨 A, 비니페에테르 B, 루페논 및 레스베라트롤)에 비해 현저한 것을 확인하였다.
또한, HSV-1 감염 동물모델의 뇌 조직에서 포도나무 줄기 추출물 또는 비티신 A 투여에 의해 바이러스 단백질 발현이 감소하였고, 알츠하이머 유발 인자인 아밀로이드 베타의 생성 및 타우 단백질의 인산화를 억제하는 효과가 우수하였으므로, 포도나무 줄기 추출물 및 비티신 A를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 알츠하이머 치료제, 알츠하이머 예방 또는 개선용 건강기능식품 또는 사료 첨가제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

포도나무 줄기 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Composition for preventing, ameliorating or treating Alzheimer's disease comprising Vitis vinifera stem extract or compound isolated therefrom as effective component}
본 발명은 포도나무 줄기 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
알츠하이머 병(Alzheimer's Disease, AD)은 학습이나 기억에 관계하는 대뇌의 뉴런(신경세포)이 죽음에 이름으로써 기억을 잃고, 계산력, 언어능력, 시공간 이해력 및 판단력을 포함하는 사고력이 점차 낮아지는 질환이다.
알츠하이머 병은 만성 신경퇴행성 질환의 하나로 치매(dementia)를 유발하는 원인의 60~70%를 차지하고 있다. 알츠하이머 병의 원인은 잘 알려져 있지 않으나, 공통적으로 기억을 관장하는 변연계 신경 경로(limbic pathway)에서 신경세포의 사멸이 관찰되는 소견을 보인다. AD 환자의 주요 특징인 인지 작용의 점진적 상실의 유력한 원인은 비정상적으로 축적된 Aβ(Amyloid beta)에 의한 것으로 보인다.
현대의 알츠하이머 연구는 비정상적 단백질의 축적을 제어하는 것에 초점이 맞춰져 있고, 지금까지 Aβ의 응집을 억제하는 치료제들이 많이 개발돼 임상실험을 했지만, 특별한 치료효과를 나타낸 물질은 없었다.
한편, 헤르페스(Herpes)는 피부나 입술, 눈, 성기 등에 물집을 만드는 단순포진 바이러스다. 헤르페스의 어원인 그리스어 '헤르핀(herpin)'은 '잠복'이라는 뜻이다. 단순포진의 원인균인 헤르페스 바이러스(herpes simplex virus, HSV)는 어린 시절 감염돼 오랜 기간 잠복한다. 누구나 피곤하거나 스트레스 많이 받을 때 입가나 눈가에 반복되는 물집으로 고생한 경험이 있다. 바로 몸 안에 잠복해 있던 HSV가 활성화돼서 재발하기 때문에 일어나는 일이다. 피부와 점막의 경계 부위에 급성으로 나타나는 수포성 병변이 특징이지만 모양 때문에 괜히 창피한 느낌이 든다. 또 엄청나게 고통스러운 대상포진의 원인이 되는 바이러스도 헤르페스의 한 종류이다. 신경절에 숨어 있다가 노화와 면역력 저하에 의해 대상포진의 형태로 나타나는 것이다. 성인의 95%가 HSV에 감염돼 있다는 조사결과가 있을 만큼 HSV는 사람에게 아주 흔한 바이러스이다.
최근 알츠하이머 치매가 바이러스에 의해 발생한다는 학설이 주목받고 있고, 실제 HSV-1 감염이 알츠하이머와 관련되어 있음이 추가로 관찰되었다. 2014년 10월에 스웨덴 우메아대학 의과대 후고 뢰브하임 박사의 연구실에서는 HSV-1에 감염됐던 사람은 그렇지 않은 사람에 비해 치매 위험이 높은 것으로 보고했다. 특히 60세 이상 노인들의 경우에 단순포진 증상이 나타난 기간이 6.6년을 넘으면 알츠하이머 치매의 위험도가 2.3배나 높아지며 헤르페스 단순포진 감염 횟수가 많으면 알츠하이머 치매 발병 가능성도 높아진다는 것이다. 따라서 HSV-1 감염의 재활성화 및 확산은 특히 알츠하이머와 관련될 수 있는 인지 쇠퇴의 원인이 되는 것으로 제안되었다.
한편, 포도(Vitis vinifera)는 포도과에 속하는 낙엽덩굴성 수목으로 세계 과일 생산량 중 약 30%로 가장 많이 재배되는 과일 중 하나이다. 포도에는 포도당, 과당, 자당, 구연산, 주석산, 초산 및 사과산 등의 다양한 유기산과 비타민 A, B 및 C 등이 많이 함유되어 있으며, 포도의 껍질에는 페오니딘, 델피니딘, 말비딘 및 페츄니딘 등의 안토시안계 성분들이 잘 알려져 있지만, 포도나무 줄기 추출물 또는 줄기 껍질 추출물에 대한 연구는 미비한 실정이다.
포도나무는 매해 가지치기를 통해 잘려진 포도나무 줄기가 발생하는데 경제성이 없다는 이유로 농가에서 버려지고 있다. 따라서 버려지던 포도나무 줄기 또는 포도나무 줄기 껍질의 기능성 연구를 통해 기능성 식품 및 고부가가치 상품을 개발할 수 있다면, 농가의 새로운 소득원으로 이용 가능할 것이다.
포도와 관련된 선행기술로는, 한국등록특허 제2025572호에 고욤나무 잎 및 포도송이 줄기 추출물의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2020-0004134호에 포도 캘러스 배양액을 유효성분으로 함유하는 피부 개선용 조성물이 개시되어 있으며, 한국공개특허 제2018-0136201호에 포도근 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 노로바이러스성 설사병의 예방 또는 치료용 조성물이 개시되어 있지만, 본 발명의 포도나무 줄기 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관해서는 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로, 포도나무 줄기 추출물 및 이로부터 분리된 비티신 A를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하고, 상기 포도나무 줄기 추출물 또는 비티신 A가 단순포진 바이러스의 감염을 억제하고, 단순포진 바이러스에 감염된 동물모델의 뇌 조직에서 알츠하이머 유발 인자인 아밀로이드 베타의 생성 및 타우 단백질의 인산화를 억제하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 포도나무 줄기 추출물 또는 비티신 A(vitisin A)를 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 포도나무 줄기 추출물 또는 비티신 A(vitisin A)를 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 포도나무 줄기 추출물 또는 비티신 A(vitisin A)를 유효성분으로 함유하는 알츠하이머의 예방 또는 개선용 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명은 포도나무 줄기 추출물 및 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 유효성분인 포도나무 줄기(결과모지) 추출물은 포도나무 원줄기 껍질 추출물에 비해 HSV-1 바이러스의 세포내 감염을 억제하였고, 포도나무 줄기 추출물로부터 분리된 화합물의 HSV-1 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 확인한 결과, 비티신 A 및 B의 세포내 감염 억제 효과가 분리된 타 화합물(ε-비니페린, 카라페놀 A, 베투인, cis-비티신 A, 암펠롭신 A, 루페올, 말리바톨 A, 비니페에테르 B, 루페논 및 레스베라트롤)에 비해 현저한 것을 확인하였다.
또한, HSV-1 감염 동물모델에서, 포도나무 줄기 추출물은 바이러스 감염에 의한 사망률을 감소시키고, 체중감소를 억제하였다.
또한, HSV-1 감염 동물모델의 뇌 조직에서 포도나무 줄기 추출물 또는 비티신 A 투여에 의해 바이러스 단백질 발현이 감소하였고, 알츠하이머 유발 인자인 아밀로이드 베타의 생성 및 타우 단백질의 인산화를 억제하는 효과가 우수하였다.
도 1은 Vero 세포에서 본 발명의 포도나무 줄기(결과모지) 에탄올 추출물, 포도나무 줄기(결과모지) 물 추출물 또는 포도나무 원줄기 껍질 에탄올 추출물 처리에 따른 단순포진 바이러스 감염 억제 효과를 확인한 결과이다. control은 바이러스 및 시료 무처리 군이고, virus는 시료를 처리하지 않고 단순포진 바이러스만 처리한 군이며, ACV는 아시클로버를 처리한 양성대조군이다. ###은 control 대비 virus군의 바이러스 감염 정도가 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, p<0.001이다. ***은 virus군 대비 시료 처리군의 바이러스 감염 정도가 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.001이다.
도 2는 Vero 세포에서 본 발명의 포도나무 줄기 추출물에 함유된 화합물 처리에 따른 단순포진 바이러스 감염 억제 효과를 확인한 결과이다. control은 바이러스 및 시료 무처리 군이고, virus는 시료를 처리하지 않고 단순포진 바이러스만 처리한 군이며, ACV는 아시클로버를 처리한 양성대조군이다. ***은 control 대비 virus군의 바이러스 감염 정도가 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, p<0.001이다. #, ##, ###은 virus군 대비 시료 처리군의 바이러스 감염 정도가 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, #은 p<0.05, ##은 p<0.01, ###은 p<0.001이다.
도 3은 SK-N-SH 세포에서 본 발명의 포도나무 줄기(결과모지) 에탄올 추출물, 포도나무 줄기(결과모지) 물 추출물, 포도나무 원줄기 껍질 물 추출물 또는 포도나무 원줄기 껍질 에탄올 추출물 처리에 따른 단순포진 바이러스 감염 억제 효과를 확인한 결과이다. control은 바이러스 및 시료 무처리 군이고, virus는 시료를 처리하지 않고 단순포진 바이러스만 처리한 군이며, ACV는 아시클로버를 처리한 양성대조군이다. ###은 control 대비 virus군의 바이러스 감염 정도가 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, p<0.001이다. **, ***은 virus군 대비 시료 처리군의 바이러스 감염 정도가 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, **은 p<0.01, ***은 p<0.001이다.
도 4는 U373-MG 세포에서 본 발명의 포도나무 줄기(결과모지) 에탄올 추출물 또는 포도나무 원줄기 껍질 물 추출물 처리시, 단순포진 바이러스 감염에 따른 세포 생존율 변화를 확인한 결과이다. control은 바이러스 및 시료 무처리 군이고, virus는 시료를 처리하지 않고 단순포진 바이러스만 처리한 군이며, ACV는 아시클로버를 처리한 양성대조군이다. ***은 control 대비 virus군의 세포 생존율이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것을 의미하며, p<0.001이다. #, ###은 virus군 대비 시료 처리군의 세포 생존율이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, #은 p<0.05, ###은 p<0.001이다.
도 5는 U373-MG 세포에서 본 발명의 포도나무 줄기 추출물에 함유된 화합물 처리시, 단순포진 바이러스 감염에 따른 세포 생존율 변화(A)와 바이러스 단백질의 발현 정도(B)를 확인한 결과이다. control은 바이러스 및 시료 무처리 군이고, virus는 시료를 처리하지 않고 단순포진 바이러스만 처리한 군이며, ACV는 아시클로버를 처리한 양성대조군이다. ##, ###은 virus군 대비 시료 처리군의 세포 생존율이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하거나, virus군 대비 시료 처리군의 gB 바이러스 단백질 발현이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것을 의미하며, ##은 p<0.01, ###은 p<0.001이다.
도 6은 바이러스 감염 동물모델에서, 포도나무 줄기(결과모지) 추출물 또는 포도나무 원줄기 껍질 추출물 투여에 의한 생존율을 확인한 결과이다.
도 7은 바이러스 감염 동물모델에서, 포도나무 줄기(결과모지) 추출물 또는 포도나무 원줄기 껍질 추출물 투여에 의한 체중 변화를 확인한 결과이다.
도 8은 바이러스 감염 동물모델의 뇌 조직에서, 포도나무 줄기(결과모지) 에탄올 추출물 또는 포도나무 줄기(결과모지) 물 추출물 투여에 의한 gB 바이러스 단백질의 발현을 확인한 결과이다. (A)는 웨스턴 블랏 결과이고, (B)는 이를 정량한 결과이다. control은 바이러스 및 시료 무처리 군이고, virus는 시료를 처리하지 않고 단순포진 바이러스만 감염시킨 군이고, VV-E100은 바이러스 감염 및 포도나무 줄기(결과모지) 에탄올 추출물 100mg/kg 투여군이며, VV-D300은 바이러스 감염 및 포도나무 줄기(결과모지) 물 추출물 300mg/kg 투여군이다. ***은 virus군 대비 시료 투여군의 gB 단백질 발현이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것을 의미하며, p<0.001이다.
도 9는 바이러스 감염 동물모델의 뇌 조직에서, 포도나무 줄기(결과모지) 에탄올 추출물 또는 포도나무 줄기(결과모지) 물 추출물 투여에 의한 치매 관련 인자인 아밀로이드 베타(Aβ1-42) 단백질 발현 변화 및 타우 단백질의 인산화(p-tau) 정도를 확인한 결과이다. (A)는 웨스턴 블랏 결과이고, (B)는 이를 정량한 결과이다. control은 바이러스 및 시료 무처리 군이고, virus는 시료를 처리하지 않고 단순포진 바이러스만 감염시킨 군이고, VV-E100은 바이러스 감염 및 포도나무 줄기(결과모지) 에탄올 추출물 100mg/kg 투여군이며, VV-D300은 바이러스 감염 및 포도나무 줄기(결과모지) 물 추출물 300mg/kg 투여군이다. ##, ###은 control 대비 virus군의 아밀로이드 베타(Aβ1-42) 단백질 발현 및 타우 단백질의 인산화(p-tau) 정도가 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며 ##은 p<0.01, ###은 p<0.001이다. **, ***은 virus군 대비 시료 투여군의 아밀로이드 베타(Aβ1-42) 단백질 발현 및 타우 단백질의 인산화(p-tau) 정도가 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것을 의미하며, **은 p<0.01, ***은 p<0.001이다.
도 10은 바이러스 감염 세포모델에서, 포도나무 줄기로부터 분리된 화합물 투여에 의한 치매 관련 인자인 아밀로이드 베타(Aβ1-42) 단백질 발현 변화 및 타우 단백질의 인산화(p-tau) 정도를 확인한 결과이다. (A)는 웨스턴 블랏 결과이고, (B)는 이를 정량한 결과이다. control은 바이러스 및 시료 무처리 군이고, virus는 시료를 처리하지 않고 단순포진 바이러스만 감염시킨 군이고, 비티신 A(vitisin A)는 바이러스 감염 및 비티신 A 10μM 투여군이고, cis-비티신 A(cis-vitisin A)는 바이러스 감염 및 cis-비티신 A 10μM 투여군이며, 비티신 B(vitisin B)는 바이러스 감염 및 비티신 B 10μM 투여군이다. ##, ###은 control 대비 virus군의 아밀로이드 베타(Aβ1-42) 단백질 발현 및 타우 단백질의 인산화(p-tau) 정도가 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며 ##은 p<0.01, ###은 p<0.001이다. **, ***은 virus군 대비 시료 투여군의 아밀로이드 베타(Aβ1-42) 단백질 발현 및 타우 단백질의 인산화(p-tau) 정도가 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것을 의미하며, **은 p<0.01, ***은 p<0.001이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 포도나무 줄기 추출물 또는 비티신 A(vitisin A)를 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 알츠하이머는 헤르페스 바이러스 감염에 의해 유발된 알츠하이머성 치매일 수 있고, 상기 헤르페스 바이러스는 바람직하게는 단순포진 바이러스 타입 1(herpes simplex virus type 1, HSV-1)인 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 비티신 A는 포도나무 줄기 추출물로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 상기 포도나무 줄기 추출물은 포도나무 원줄기, 원가지, 결과모지, 곁가지, 결과지, 원줄기의 껍질, 원가지의 껍질, 결과모지의 껍질, 곁가지의 껍질, 결과지의 껍질 중에서 선택된 하나의 추출물일 수 있고, 열매가 달리는 가지인 결과지가 붙는 결과모지의 추출물인 것이 바람직하지만, 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 결과모지는 가지치기를 통해 잘려진 부위이다.
상기 추출물의 추출 용매는 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물일 수 있고, 바람직하게는 에탄올을 이용하여 추출한 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 비티신 A는 하기 화학식 1의 화합물이다.
본 발명의 일 구현 예에서, 상기 포도나무 줄기 추출물 또는 비티신 A(vitisin A)는 아밀로이드 베타의 생성 및 타우 단백질의 인산화를 억제하는 특징이 있다.
본 발명에 따른 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 캡슐제, 산제, 과립제, 정제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다.
또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당하는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구투여의 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 포도나무 줄기 추출물 또는 비티신 A(vitisin A)를 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 알츠하이머는 헤르페스 바이러스 감염에 의해 유발된 알츠하이머성 치매일 수 있고, 상기 헤르페스 바이러스는 바람직하게는 단순포진 바이러스 타입 1(herpes simplex virus type 1, HSV-1)인 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 총 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 하는 장기간의 섭취인 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 포도나무 줄기 추출물 또는 비티신 A(vitisin A)를 유효성분으로 함유하는 알츠하이머의 예방 또는 개선용 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 사료 첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당한다. 본 발명에서 용어 '사료'는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있다. 상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
이하, 제조예 및 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 제조예 및 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
제조예 1. 포도나무 줄기 추출물의 제조
본 발명의 포도나무(Vitis vinifera) 줄기는 한국 대전 유성(2008년) 및 대구, 경북지역(2021년)의 포도밭에서 포도를 수확한 후, 가지치기(전정)를 통해 잘려진 결과모지(열매가 달리는 가지인 결과지가 자라는 부분, Bearing mother branch)를 사용하였다.
상기 획득한 절단된 상태 그대로의 포도나무 줄기 10kg에 10배(v/v)의 에탄올(100%)을 가하고, 7일 동안 가열용 맨틀(heating mantle)에서 환류(75℃) 냉각하여 2회에 걸쳐 추출한 다음, 부흐너 깔대기에 여과지를 깔고 감압하여 여과한 여액을 감압농축기를 사용하여 농축함으로써 708.8g의 포도나무 줄기 에탄올 추출물을 수득하였다.
또한, 절단된 상태 그대로의 포도나무 줄기 750g에 2L의 증류수를 첨가한 후, 약탕기에서(100℃) 2시간 동안 추출한 다음, 부흐너 깔대기에 여과지를 깔고 감압하여 여과한 여액을 동결건조기를 사용하여 건조함으로써 포도나무 줄기(결과모지) 물 추출물(31.83g)을 획득하였다.
또한, 포도나무 원줄기(뿌리에서 올라온 나무의 중심축의 가지, Trunk) 껍질 750g을 상기 동일한 방법으로 추출하여 포도나무 원줄기 껍질 에탄올 추출물(2.9g); 또는 포도나무 원줄기 껍질 물 추출물(2.86g)을 획득하였다.
제조예 2. 포도나무 줄기 추출물로부터 화합물의 분리
상기 제조예 1의 포도나무 줄기 에탄올 추출물을 물에 현탁시키고, 동일한 부피의 CH2Cl2, EtOAc 및 n-BuOH로 순차적으로 분배하였다. 실리카겔(230~400mesh; 250g) 크로마토그래피로 3개의 분획물(1-3)을 각각의 분획물 특성에 따라 유기용매에 현탁하여 9:1 크기의 컬럼을 만든 후, 초기 이동상에 용해하여 컬럼에 로딩하였고, 이동상 용매로 2~8L 흘려 받은 후, 순수한 화합물이 있는 분획들을 TLC로 확인하여 합한 후, 농축하여 분획을 획득하였다.
상기 분획을 MeOH 용매에 가온하여 녹인 후, 실온에 방치하여 결정을 석출하였고, 여과한 후, 재결정하여 순수 화합물을 획득하였다. 분리된 화합물들을 2시간 동안 40℃에서 감압 건조시킨 다음 분획 1에서 루페논(lupenone), 루페올(lupeol) 및 베투인(betuin)을 분리하였고, 분획 2에서 비티신 A(vitisin A), cis-비티신 A(cis-vitisin A), 비티신 B(vitisin B), 말리바톨 A(malibatol A) 및 ε-비니페린(ε-viniferin)을 분리하였으며, 분획 3에서 암펠롭신 A(ampelopsin A), 비니페에테르 B(viniferether B), 카라페놀 A(caraphenol A) 및 레스베라트롤(resveratrol)을 분리하였다.
분리된 화합물은 1D(1H 및 13C) NMR 분석을 통해 1차 평면구조를 확인하였고, 2D NMR(COSY, HSQC, HMBC 및 NOESY) 분석을 통해 2차 입체구조를 확인하였다.
또한 질량분석기(MS/MS)를 통해 화합물들의 분자량 및 질량을 확인하였다.
비티신 A(vitisin A): 갈색 분말(brown amorphous powder); [α]20/D = +209.2°(c 0.15, MeOH) HRFABMS: 907.2757 [M+H]+; C56H43O12), calcd. 907.2755
비티신 A의 1H 및 13C NMR 값은 하기 표 1에 개시된 바와 같다.
실시예 1. Vero 세포에서의 포도나무 줄기 및 포도나무 원줄기 껍질추출물의 항바이러스 효과
Vero 세포를 10% FBS(Fetal bovine serum)와 1% 페니실린(penicillin)/스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양 후 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지하에서 상기 세포를 단순포진 바이러스(HSV-1, 0.1 MOI)로 2시간 동안 감염시킨 후 감염액을 제거하고 PBS로 세척한 다음 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM에 상기 제조예 1의 시료를 농도별로 처리한 후 18시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 회수하고, 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 세포를 고정한 다음 PBS를 이용하여 세척한 후 유세포분석기를 통해 바이러스의 GFP를 정량화하였다. 세포 감염율은 시료를 처리하지 않은 군 (virus) 대비 감염율로 표시하였다.
그 결과, 도 1에 개시된 바와 같이 본 발명의 포도나무 줄기(결과모지) 추출물 및 포도나무 원줄기 껍질 추출물 처리시 단순포진 바이러스의 감염이 억제되는 것을 확인하였다.
또한, 상기 제조예 2에서 획득한 포도나무 줄기 추출물에 함유된 성분인 비티신 A(vitisin A), ε-비니페린(ε-viniferin), 카라페놀 A(caraphenol A), 베투인(betuin), cis-비티신 A(cis-vitisin A), 암펠롭신 A(ampelopsin A), 루페올(lupeol), 비티신 B(vitisin B), 말리바톨 A(malibatol A), 비니페에테르 B(viniferether B), 루페논(lupenone) 및 레스베라트롤(resveratrol)의 항바이러스 효과도 상기와 동일한 방법으로 실험을 진행하여 확인하였다.
그 결과, 도 2에 개시된 바와 같이 5μM 농도에서 비티신 A와 비티신 B는 각각 80%의 바이러스 복제 억제율을 보였으며, 10μM 농도에선 비티신 A는 96%, ε-비니페린은 42%, 카라페놀 A는 41%, 암펠롭신 A는 54%, 루페올은 59%, 비티신 B는 76%, 레스베라트롤은 67%의 바이러스 감염 억제를 보였다.
따라서, 포도나무 줄기 추출물의 함유성분들 중 비티신 A와 비티신 B가 가장 좋은 항바이러스 효과를 가짐을 확인하였다.
실시예 2. SK-N-SH 세포에서의 포도나무 줄기 및 포도나무 원줄기 껍질 추출물의 항바이러스 효과
SK-N-SH 세포를 10% FBS(Fetal bovine serum)와 1% 페니실린(penicillin)/스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양 후 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 MEM 배지하에서 상기 세포를 단순포진 바이러스(HSV-1, 0.1 MOI)로 감염시킨 후 2 시간 후 감염액을 제거하고 PBS로 세척한 후 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 배지에 상기 제조예 1의 시료를 농도별로 18시간 동안 처리하였다. 그 후, 세포를 회수한 다음 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 세포를 고정하고, PBS를 이용하여 세척한 후 유세포분석기를 통해 바이러스의 GFP를 정량화 하였다. 세포 감염율은 포도나무 줄기 또는 포도나무 원줄기 껍질 추출물을 처리하지 않은 군(virus) 대비 감염율로 표시하였다.
그 결과, 도 3에 개시된 바와 같이 포도나무 줄기(결과모지) 에탄올 추출물, 포도나무 줄기(결과모지) 물 추출물, 포도나무 원줄기 껍질 물 추출물 및 포도나무 원줄기 껍질 에탄올 추출물 처리시 단순포진 바이러스의 감염이 억제되는 것을 확인하였고, 특히 포도나무 줄기(결과모지) 에탄올 추출물의 감염 억제 효과가 현저한 것을 확인하였다.
실시예 3. U373-MG 세포에서의 포도나무 줄기 추출물과 함유성분의 항바이러스 효과
사람 유래 교모세포종인 U373-MG 세포를 10% FBS(Fetal bovine serum)와 1% 페니실린(penicillin)/스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가된 RPMI1640 배지에서 배양하였다. 배양 후 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 RPMI1640 배지하에서 상기 세포를 단순포진 바이러스(HSV-1, 0.1 MOI)로 감염시킨 후 2 시간 후 감염액을 제거하였고, PBS로 세척한 후 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 RPMI1640에 시료를 18시간 처리하였다. 그 후, U373-MG 세포에서 바이러스에 의해 감소한 세포 생존율이 처리한 시료에 의해 증가하는지를 확인하고자 MTT assay를 진행하였다. 세포 생존율은 아무것도 처리하지 않은 군(control) 대비로 세포 생존율로 표시하였다.
그 결과, 도 4에 개시된 바와 같이 U373-MG 세포에 포도나무 줄기(결과모지) 에탄올 추출물 및 포도나무 원줄기 껍질 물 추출물 처리시 단순포진 바이러스의 감염이 억제되어 바이러스 감염에 의해 감소된 세포 생존율을 회복시키는 것을 확인하였다.
또한, 도 5A에 개시된 바와 같이 10μM 농도에서 비티신 A, cis-비티신 A와 비티신 B는 바이러스 감염군(virus)보다 2.2배, 2.1배 및 1.8배 증가한 87%, 84% 및 76%의 세포 생존율을 보였다.
또한, 세포 내 단백질을 분리하여 단순포진 바이러스의 단백질을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과, 도 5B에 개시된 바와 같이 10μM 농도에서 비티신 A, cis-비티신 A와 비티신 B는 바이러스 감염군(virus)보다 gB 단백질을 99%, 27% 및 66% 감소시킴을 확인하였다. 뿐만 아니라 단순포진 바이러스 단백질인 ICP27과 VP16에 대한 비티신 A의 억제율을 확인한 결과, 바이러스 감염군(virus)보다 93%와 100%의 억제율을 보였다.
실시예 4. 바이러스 감염 동물모델에서, 포도나무 줄기 및 포도나무 원줄기 껍질 추출물에 의한 항바이러스 효능 확인
6주령 BALB/c 암컷 마우스를 4군 각 10마리씩 무작위 배정한 후, 단순포진 바이러스를 비강으로 감염시킨 다음 7일 동안 멸균 증류수로 녹인 100mg/kg의 포도나무 줄기(결과모지) 에탄올 추출물과 100 또는 300mg/kg의 포도나무 줄기(결과모지) 물 추출물 및 300mg/kg의 포도나무 원줄기 껍질 물 추출물을 경구투여하였다. 바이러스 미감염군(음성대조군)과 시료는 투여하지 않고 바이러스만 감염시킨 군(바이러스 감염군)은 멸균 증류수를 투여하였다. 감염 전의 개시 체중 20% 이상 체중감소는 윤리적인 관점에서 희생시켜 사망으로 간주하였다.
바이러스 감염 후 11일 동안 체중과 생존율을 확인한 결과, 도 6에 개시된 바와 같이 바이러스만 감염시킨 군에 비해 포도나무 줄기 추출물을 투여한 군의 생존율이 증가하여, 본 발명의 포도나무 줄기 추출물은 바이러스 감염에 의한 사망을 크게 줄일 수 있었다. 특히 100mg/kg의 포도나무 줄기(결과모지) 에탄올 추출물 또는 300mg/kg의 포도나무 줄기(결과모지) 물 추출물 투여군의 생존율 개선 효과가 가장 우수하였다.
또한, 도 7에 개시된 바와 같이 포도나무 줄기(결과모지) 에탄올 추출물은 바이러스 감염에 의한 체중감소를 억제하는 것을 확인하였고, 감염 9일차에서부터는 바이러스를 감염시키지 않은 음성대조군과 비교하여 체중의 차이가 없음을 확인하였다.
또한, 마우스 뇌 조직에서 바이러스 단백질의 발현정도를 확인한 결과, 도 8에 개시된 바와 같이 바이러스 감염군에 비해 포도나무 줄기(결과모지) 추출물 투여군에서 gB 바이러스 단백질의 발현이 현저히 감소된 것을 확인하였고, 특히 포도나무 줄기(결과모지) 에탄올 추출물 투여시, gB 바이러스 단백질 발현 감소 효과가 현저하였다.
실시예 5. 포도나무 줄기(결과모지) 추출물 처리에 의한 단순포진 바이러스 감염에 의해 증가된 치매 관련 인자의 발현 변화 확인
상기 실시예 4의 동물실험과 동일한 방법으로 실험을 진행하되, 감염 8일 차에 무작위로 3마리의 마우스를 선정하여 뇌 조직을 채취한 다음 치매 관련 단백질의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 9에 개시된 바와 같이 바이러스 감염군은 아밀로이드 베타(Aβ1-42)의 발현이 증가하고, 타우 단백질의 인산화(p-tau)가 촉진되었고, 포도나무 줄기(결과모지) 추출물 투여군은 바이러스 감염군에 비해 아밀로이드 베타(Aβ1-42)의 발현 및 타우 단백질의 인산화(p-tau)를 현저히 감소시킴을 확인하였다.
실시예 6. U373-MG 세포에서의 포도나무 줄기 추출물 함유성분에 의한 단순포진 바이러스 감염에 의해 증가된 치매 관련 인자의 발현 변화 확인
상기 실시예 3의 세포실험과 동일한 방법으로 실험을 진행하되, 실험의 시료로 포도나무 줄기 추출물로부터 분리한 비티신 A, cis-비티신 A 및 비티신 B를 처리하였고, 세포의 단백질을 분리하여 치매와 관련된 단백질의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 10에 개시된 바와 같이 바이러스 감염에 의해 아밀로이드 베타(Aβ1-42)의 발현이 증가하고, 타우 단백질의 인산화(p-tau)가 촉진되었고, 포도줄기 추출물의 함유성분인 비티신 A 처리군은 바이러스 감염군에 비해 아밀로이드 베타(Aβ1-42)의 발현 및 타우 단백질의 인산화(p-tau)를 현저히 감소시킴을 확인하였다.

Claims (11)

  1. 포도나무 결과모지 추출물을 유효성분으로 함유하는 헤르페스 바이러스 감염에 의해 유발된 알츠하이머성 치매의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 헤르페스 바이러스는 단순포진 바이러스 타입 1(herpes simplex virus type 1, HSV-1)인 것을 특징으로 하는 헤르페스 바이러스 감염에 의해 유발된 알츠하이머성 치매의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 포도나무 결과모지 추출물의 추출 용매는 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 헤르페스 바이러스 감염에 의해 유발된 알츠하이머성 치매의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 포도나무 결과모지 추출물은 아밀로이드 베타의 생성 및 타우 단백질의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 하는 헤르페스 바이러스 감염에 의해 유발된 알츠하이머성 치매의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 헤르페스 바이러스 감염에 의해 유발된 알츠하이머성 치매의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 포도나무 결과모지 추출물을 유효성분으로 함유하는 헤르페스 바이러스 감염에 의해 유발된 알츠하이머성 치매의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  9. 삭제
  10. 제8항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 헤르페스 바이러스 감염에 의해 유발된 알츠하이머성 치매의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  11. 포도나무 결과모지 추출물을 유효성분으로 함유하는 헤르페스 바이러스 감염에 의해 유발된 알츠하이머성 치매의 예방 또는 개선용 사료 첨가제.
KR1020220141967A 2022-10-31 2022-10-31 포도나무 줄기 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 예방, 개선 또는 치료용 조성물 KR102576222B1 (ko)

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Yeon Hee Choi 외. A New Specific BACE-1 Inhibitor from the Stembark Extract of Vitis vinifera. Planta Med. 2009, Vol. 75, pp. 537-540.* *

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