KR102182724B1

KR102182724B1 - 풀무치 추출물을 함유하는 항염증용 조성물

Info

Publication number: KR102182724B1
Application number: KR1020180129706A
Authority: KR
Inventors: 윤형주; 서민철; 김미애; 이경용; 김선영; 고현진
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2018-10-29
Filing date: 2018-10-29
Publication date: 2020-11-24
Anticipated expiration: 2038-10-29
Also published as: KR20200048057A

Abstract

본 발명은 풀무치(Locusta migratoria) 추출물을 함유하는 항염증용 조성물에 관한 것이다. 상기 풀무치 추출물은 NO(Nitric oxide), iNOS(inducible Nitric oxide synthase), COX-2(cyclooxygenase-2), TNF-α(tumor necrosis factor-α) 등의 염증 관련 인자의 생성을 억제하는 효과가 우수하여 염증성 장질환, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 패혈증, 방광염, 신장염, 신경염 등의 예방, 개선 또는 치료에 용이하게 사용할 수 있다.

Description

풀무치 추출물을 함유하는 항염증용 조성물 {Antiinflammatory composition comprising Locusta migratoria extract}

본 발명은 풀무치(Locusta migratoria) 추출물을 함유하는 항염증용 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 NO(Nitric oxide), iNOS(inducible Nitric oxide synthase), COX-2(cyclooxygenase-2), TNF-α(tumor necrosis factor-α) 등의 염증 관련 인자의 생성을 억제하는 효과가 우수한 풀무치(Locusta migratoria) 추출물을 함유하여 염증성 장질환, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 패혈증, 방광염, 신장염, 신경염 등의 예방, 개선 또는 치료 효능이 우수한 항염증용 조성물에 관한 것이다.

염증(inflammation)은 어떤 자극에 대한 생체조직의 방어반응의 하나로, 조직 변질, 순환장애와 삼출, 조직 증식의 세 가지를 병발하는 복잡한 병변을 일컫는다. 원인은 기계적 상해작용, 온도, 방사선 등의 물리적 인자, 독물 등의 화학적 인자, 세균감염 등의 기생체에 의한 것 등이며 이 중 세균에 의한 것이 가장 많다. 이러한 주요 원인 외에도, 여러 부수적 요인과 개체의 소인이나 면역 등에 의하여 그 발생은 복잡하다.

또한 염증반응은 상처, 미생물 감염 등에 대항하는 숙주의 방어기제에 따른 병리학적인 기작 중 가장 중요한 반응 중의 하나라고 할 수 있다. 대식세포는 이러한 염증 반응을 조절하는 가장 대표적인 면역세포로서, 활성화된 대식세포는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-6(interleukin-6), PGE2(prostaglandin E2), NO(nitric oxide), ROS(reactive oxygen species) 등과 같은 다양한 염증성 매개체를 분비한다(Laskin, D. L. et al., 2011).

이에 본 발명자들은 풀무치 추출물을 이용하여 다양한 생리활성을 연구하던 중, 상기 풀무치 추출물이 항염증 효능이 있음을 확인하고 이를 각종 염증 질환의 치료제로서 용이하게 사용가능함을 밝혀 본 발명을 완성할 수 있었다.

대한민국 공개특허 제10-2016-0001880호 (발명의 명칭 : 항염증 활성을 갖는 벼메뚜기 추출물 및 이를 함유하는 조성물, 출원인 : 대한민국, 공개일 : 2016.01.07) 대한민국 등록특허 제10-1730065호 (발명의 명칭 : 항염증 활성을 갖는 풀색꽃무지 추출물 및 이를 함유하는 조성물, 출원인 : 대한민국, 등록일 : 2017.04.19)

본 발명의 목적은 풀무치(Locusta migratoria) 추출물을 함유하는 항염증용 조성물을 제공하는 데에 있다. 더욱 상세하게는 본 발명의 목적은 NO(Nitric oxide), iNOS(inducible Nitric oxide synthase), COX-2(cyclooxygenase-2), TNF-α(tumor necrosis factor-α) 등의 염증 관련 인자의 생성을 억제하는 효과가 우수한 풀무치(Locusta migratoria) 추출물을 함유하여 염증성 장질환, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 패혈증, 방광염, 신장염, 신경염 등의 예방, 개선 또는 치료 효능이 우수한 항염증용 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 풀무치(Locusta migratoria) 추출물을 함유하는 항염증용 조성물에 관한 것이다.

상기 풀무치 추출물은 풀무치를 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액을 용매로 하여 추출할 수 있다.

상기 C1~C4 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 및 이소부탄올로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 풀무치 추출물은 NO(Nitric oxide), iNOS(inducible Nitric oxide synthase), COX-2(cyclooxygenase-2) 및 TNF-α(tumor necrosis factor-α)로 이루어진 군 중에서 선택되는 염증반응인자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 풀무치 추출물을 함유하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공할 수 있다.

상기 염증 질환은 염증성 장질환, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 패혈증, 방광염, 신장염 및 신경염으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

또 다른 양태에서 본 발명은 또한 풀무치 추출물을 함유하는 염증질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 풀무치 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 화장료 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 풀무치 추출물의 제조시 사용되는 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액은 풀무치 사용 중량 기준 1~40배 부피(1kg 기준 1~40ℓ)를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 5~40배 부피를 사용할 수 있다. 상기 풀무치 추출물의 추출조건은 20~100℃에서 1분~48시간일 수 있다. 상기 과정은 1~4번까지 반복할 수 있다.

또한, 당분야의 통상적인 방법으로서 상기 풀무치의 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액 추출물을 물에 녹인 후에 n-헥산, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 n-부탄올로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 용매를 사용하여 추가적으로 분획하여 분획물로 제조할 수 있다.

상기 추출물 또는 이의 분획물의 제조온도는 20 내지 100℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 추출 또는 분획 시간은 특별히 제한되는 것은 아니나, 10분 내지 2일 이내에 추출하는 것이 바람직하며, 추출용 기기로는 통상의 추출기기, 초음파분쇄추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 이렇게 제조된 풀무치 추출물 또는 분획물은 열풍건조, 감압건조 또는 동결건조하여 용매를 제거할 수 있다. 또한, 상기 풀무치 추출물 또는 분획물은 칼럼크로마토그래피를 이용하여 정제하여 사용할 수 있다.

또한 본 발명의 풀무치 추출물 제조시, 풀무치의 건조 분말을 용매와 혼합한 후, 200~250J의 세기로 5~30초간 1~3회 파쇄한 후 추출을 시작할 수 있다. 또한 초음파 처리 후 10~60분간 4~30℃에서 방치하여 추출을 진행할 수도 있다. 상기 풀무치의 건조 분말은 동결건조나 4~30℃에서의 자연건조 방법을 통해 건조한 풀무치를 분말화하여 얻을 수 있다.

상기 풀무치 추출물은 상법에 따라, 유기용매(알코올, 에테르, 아세톤 등)에 의한 추출, 헥산과 물의 분배, 칼럼크로마토그래피에 의한 방법 등, 식물체 성분의 분리 추출에 이용되는 공지의 방법을 단독 또는 적합하게 조합한 방법을 이용하여 분획 또는 정제하여 사용할 수 있다.

상기 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 엘에이취-20 컬럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 이온교환수지 크로마토그래피(ion exchange resin chromatography), 중압 액체 크로마토그래피(medium pressure liquid chromatography), 박층 크로마토그래피(TLC; thin layer chromatography), 실리카겔 진공 액체 크로마토그래피(silica gel vacuum liquid chromatography) 및 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 중에서 선택될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 풀무치 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 풀무치 추출물은 본 발명의 약학 조성물에 0.001~100 중량%로 하여 첨가될 수 있다.

보다 구체적으로 설명하면, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 추출물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명은 상기 풀무치 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공할 수 있다.

상기 건강기능식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제가 포함될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 및 비타민 복합제 등이 있다.

또 다른 양태에서 본 발명은 상기 풀무치 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 화장료 조성물을 제공할 수 있다. 상기 화장료 조성물의 제형은 크게 제한되지는 않으나, 바람직하게는 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스쳐크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클렌저로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 본 발명의 장딸기 추출물과 마유 이외에 화장료에 일반적으로 이용되는 성분 모두를 포함할 수 있다. 예를 들면 유화제, 점증제, 유제, 계면활성제, 윤활제, 알코올류, 수용성 고분자제, 겔화제, 안정화제, 비타민, 향료 같은 일반적인 보조 성분을 포함할 수 있다.

도 1은 마우스의 대식세포인 Raw 264.7에 대해 본 발명의 풀무치 추출물이 갖는 세포독성을 MTS 어세이를 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 LPS(Lipopolysaccaride) 처리된 마우스 대식세포인 Raw 264.7에서 본 발명의 풀무치 추출물이 갖는 각종 염증 관련 인자의 활성을 확인한 결과로서, 도 2A는 NO(Nitric oxide)의 분비량 감소효과 결과, 도 2B는 iNOS(inducible Nitric oxide synthase)의 mRNA 억제 결과를 나타내며, 도 2C는 iNOS와 COX-2(cyclooxygenase-2)의 단백질 발현 억제 효과를 확인한 결과(좌측) 및 이를 수치화하여 그래프(우측)로 나타낸 결과를 나타낸다.
도 3은 LPS 처리된 마우스 대식세포인 Raw 264.7에서 본 발명의 풀무치 추출물이 갖는 TNF-α(tumor necrosis factor-α)의 mRNA(도 3A) 및 단백질(도 3B)의 발현 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 LPS 처리된 마우스 대식세포인 Raw 264.7에서 본 발명의 풀무치 추출물이 NF-κB와 MAPK 관련 신호전달 인자들의 변화를 확인한 결과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위하여 제시된 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1. 풀무치 추출물의 제조>

풀무치(Locusta migratoria)는 국립농업과학원 곤충산업과에서 실내 계대 사육한 해남 6세대를 사용하였다. 실험 곤충은 밀을 먹이로 사용하였으며 30℃, 65% R. H., 9L/15D, 1,800 Lux의 조건에서 사육하였다. 상기 풀무치(성충)를 물로 2회 세척한 후, 동결건조기(Eyela, Japan)를 이용하여 건조시켜 수분을 제거한 후, 이를 다기능 분쇄기(Korea Medi, Korea)로 분쇄하여 풀무치 분말을 수득하였다. 이렇게 수득된 풀무치 분말은 70%(v/v) 에탄올 수용액에 용해(100g/1L) 시킨 후 초음파 파쇄기(LabaX, MAm USA)를 이용하여 230J의 세기로 10초간 2회 파쇄 후 30분간 25℃에서 방치하고, 4500rpm에서 10분 동안 원심분리 시킨 후, 상등액을 얻어 0.25㎛ syringe filter(Whatman, ND, USA)로 여과 후 centrifugal evaporator (CVE-3100, Tokyo, Japan)를 이용하여 완전히 건조함으로써 본 발명의 풀무치 추출물(Locusta migratoria ethanol extract, LME)을 제조하였다.

<실시예 2. 풀무치 추출물의 세포 독성 확인>

RAW264.7 세포를 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-streptomycin) 100 unit/㎖과 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; Gibco, MD, USA)이 함유된 Dublecco's Modified Eagle Medium(Gibco)배지를 사용하여 37℃, 5% CO² 인큐베이터 (Incubator; Thermo Scientific, IL, USA)에서 배양하였으며, 2일 간격으로 계대 배양을 실시하였고, 이후의 실험에서는 이렇게 배양된 RAW264.7 세포를 실험에 이용하였다.

세포 독성은 MTS assay를 이용하여 세포 생존율을 측정함으로 확인하였다. 이를 위해 RAW264.7 세포를 4×10⁴ cells/well로 96 well plate에 분주하여 배양하고, 풀무치 추출물을 농도별(100, 500, 1000, 2000 ㎍/㎖) 로 처리 후, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터(incubator)에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 MTS 시약 10 ㎕ CellTiter 96^® AQueous One Solution Reagent (Promega, USA)를 첨가하고 4 시간 반응시켜 색의 변화를 확인하였고 마이크로플레이트 리더(microplate reader; Beckman Coulter,CA,USA)를 이용하여 590 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 측정하였으며, 이에 대한 결과는 도 1에 나타내었다.

도 1을 참고하면, 풀무치 추출물(Locusta migratoria ethanol extract, LME)이 2000 ㎍/㎖의 농도까지 세포 생장을 촉진 시키는 효과를 보이며 독성을 나타내지 않았으나, 2000 ㎍/㎖가 초과된 농도에서 부터는 조금씩 독성이 나타남을 확인할 수 있다. 따라서 이후 실험들에서 사용한 풀무치 추출물(Locusta migratoria ethanol extract, LME)의 최고 농도는 RAW 264.7 세포에 독성을 나타내지 않는 2000 ㎍/㎖ 이하의 농도로 사용하였다.

<실시예 3. 풀무치 추출물의 항염증 활성 검정 - I>

실시예 3-1. NO(Nitric oxide) 생성 억제 효과 확인

정상적인 NO(Nitric oxide)는 신경 보호나 뇌발달에 있어서 매우 중요하다고 알려져 있으나, LPS(Lipopolysaccharide)나 interferon-gamma (IFN-γ), β-amyloid 등으로 인해 활성화된 미세아교세포로부터 과도하게 생성되어 세포독성과 염증반응을 유발하는 것으로 알려져 있다.

이에, Raw264.7 대식세포에 풀무치 추출물을 처리한 후 LPS(Lipopolysaccharide)에 의해 생성되는 NO(Nitric oxide)의 분비량을 측정하였다. Raw264.7 대식세포를 96 well plate에 8×10⁴ cells/well로 분주하고 24시간 배양한 후, 풀무치 추출물(LME)을 농도별로 1시간 동안 전처리 하였다. 그 후 염증을 유발하기 위해 LPS를 100 ng/㎖ 농도로 처리하고 24시간 배양하였다. 배양된 세포의 상등액 100 ㎕를 실험에 사용하였으며 NO detection kit (Intron, Korea)를 이용하여 LPS에 의해 분비되는 NO의 양이 풀무치 추출물에 의해 얼마나 감소되는지를 마이크로 플레이트 리더(microplate reader; Beckman Coulter,CA,USA)를 이용하여 550nm 파장에서 흡광도 측정을 통해 확인하였다. 이에 대한 결과는 도 2A에 나타내었다.

도 2A를 참고하면, 풀무치 추출물을 처리한 실험군에서 농도의존적으로 NO의 분비량이 감소하는 것을 확인할 수 있다.

실시예 3-2. iNOS의 mRNA 발현 억제 효과 확인

iNOS는 평소에는 세포 내에 존재하지 않으나 일단 외부자극에 의해 유도되면 장시간 동안 다량의 NO를 생성하고, 이렇게 생성된 NO는 병리적인 혈관확장, 세포독성, 조직손상 등과 같은 생체에 유해한 작용을 유발한다. 염증상태에서는 iNOS의 생성뿐 아니라 COX를 활성화하여 prostaglandin과 같은 염증매개물질의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다.

따라서, Raw264.7 대식세포에 풀무치 추출물을 처리한 후 LPS(Lipopolysaccharide)에 의해 생성되는 iNOS(inducible Nitric oxide synthase)의 mRNA 발현량을 Quantitative RT-PCR (qRT-PCR)을 이용하여 측정하였다.

이를 위해 Raw264.7 세포를 6 well plate에 각 2×10⁵ cells/well로 분주한 후 풀무치 추출물(LME)을 농도별로 1시간 동안 처리하였다. 그 후 염증을 유발하기 위해 LPS를 100 ng/㎖ 농도로 처리하고 24시간 배양하였다. 그 후 상등액을 제거하고 PBS로 세척한 후 세포를 수거하였다. 수거한 세포에 1 ㎖의 TRIZOL 용액을 혼합하고 5분간 상온에서 반응시킨다. 200 ㎕ chloroform을 첨가하여 섞어준 후 4℃에서 12,000×g로 15분간 원심분리한 뒤 상층액을 취해 500 ㎕ isopropanol을 첨가하고 상온에서 10분간 반응시킨 후 4℃에서 12,000×g로 10분간 원심분리한다. 침전된 RNA는 75%(v/v) 에탄올 수용액으로 3회 세척한 후 건조시킨 다음 멸균수에 녹여 사용하였다. 다음으로는 cDNA 합성을 위해서 1 ㎍의 total RNA를 이용하여 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster city, CA)로 cDNA를 합성하였고, 아래의 primer를 이용하여 qRT-PCR 실험을 진행하였고, 이에 대한 결과를 도2B에 나타내었다.

i-NOS Forward : 5'-CAGCACAGGAAATGTTTCAGC-3'

i-NOS Reverse : 5'-TAGCCAGCGTACCGGATGA-3'

GAPDH Forward : 5'-AAGGTCATCCCAGAGCTGAA-3'

GAPDH Reverse : 5'-CTGCTTCACCACCTTCTTGA-3'

도 2B를 참고하면, NO와 유사한 형태로 풀무치 추출물의 농도의존적으로 iNOS의 유전자 발현양이 감소함을 확인할 수 있다.

실시예 3-3. i-NOS 및 COX-2의 단백질 발현 억제 효과 확인

다음으로는 풀무치 추출물이 갖는 i-NOS 및 COX-2의 단백질 발현 억제 효과를 웨스턴 블롯팅을 통해 확인하였다. 이를 위해 Raw264.7 세포를 6well에 각 2×10⁵ cells/well 세포를 준비한 후 풀무치 추출물(LME)을 농도별로 1시간 동안 처리하였다. 그 후 염증을 유발하기 위해 LPS를 100 ng/㎖ 농도로 처리하고 24시간 배양하였다. 그 후 상등액을 제거하고 PBS로 세척한 후 RIPA lysis buffer를 이용하여 단백질을 추출하였다. 단백질은 BCA kit (Thermo Fisher)를 이용하여 정량하였으며, 이를 SDS-PAGE 겔(Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel)을 이용하여 전개하였다. 전개된 단백질들은 PVDF membrane으로 transfer 시킨 후 5%(w/v) skim milk로 1시간 동안 blocking하고, 1차 항체(1:1000)를 희석하여 4℃에서 18시간 동안 over night 한 다음, 0.05% TBST(TBST; 20mM Tris [pH 7.5], 145mM NaCl, 0.05%(w/v) Tween-20)로 10분 간격으로 3회 세척하고, 각각의 2차 항체를 1:10,000으로 희석하여 실온에서 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 다시 0.05% TBST로 10분간 3회 세척 후 ECL용액으로 반응시키고 signal의 확인은 Image analyzer FluorChem (Alpha Innotech, USA)을 이용하여 측정하였고 이에 대한 결과는 도 2C에 나타내었다. 도 2C의 좌측은 iNOS와 COX-2(cyclooxygenase-2)의 단백질 발현 억제 효과를 확인한 결과이며, 도 2C의 우측은 이를 수치화하여 그래프로 나타낸 결과를 나타낸다.

도 2C를 참고하면, 염증매개인자인 COX-2와 iNOS가 풀무치 추출물의 농도 의존적으로 감소됨을 알 수 있다.

<실시예 4. 풀무치 추출물의 항염증 활성 검정 - II>

Raw264.7 대식세포에 풀무치 추출물을 처리한 후 LPS(Lipopolysaccharide)에 의해 생성되는 염증유발인자 사이토카인인 TNF-α(tumor necrosis factor-α)의 mRNA 및 단백질 발현량을 Quantitative RT-PCR (실시예 3-2 참조)과 ELISAELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용하여 확인하였고, 이에 대한 결과를 도 3에 나타내었다.

이 때 Quantitative RT-PCR에 사용된 프라이머 서열은 하기와 같다.

TNF-α Forward : 5'-ATGAGAAGTTCCCAAATGGC-3'

TNF-α Reverse : 5'-CTCCACTTGGTGGTTTGCTA-3'

GAPDH Forward : 5'-AAGGTCATCCCAGAGCTGAA-3'

GAPDH Reverse : 5'-CTGCTTCACCACCTTCTTGA-3'

또한 ELISA 수행을 위해 Raw264.7 세포를 96 well plate에 각 8×10⁴ cells/well 세포를 준비한 후 풀무치 추출물(LME)을 농도별로 1시간 처리하였다. 그 후 염증을 유발하기 위해 LPS를 100 ng/㎖ 농도로 처리하고 24시간 배양하였다. 배양된 세포의 상등액을 수거하여 TNF-α의 분비량을 ELISA kit(ThermoFisher, Waltham, MA)를 사용하여 측정하였다.

도 3을 참고하면, TNF-α의 발현량이 풀무치 추출물에 의해 농도의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었으며 이와 같은 결과는 풀무치 추출물이 염증 질환에 탁월한 효과를 나타낼 수 있음을 입증한다.

<실시예 5. 항염증 관련 신호전달 물질의 활성 검정>

실시예 3-3에서 이용한 웨스턴 블롯팅 방법을 이용하여 풀무치 추출물의 처리로 인한 NF-κB와 MAPK 관련 신호전달 물질의 변화를 확인하였다.

NF(nuclear factor)-κB는 염증성 cytokine, growth factor, COX-2 및 iNOS와 같은 유전자의 발현을 조절함으로서 염증반응에서 매우 중요한 역할을 수행한다. NF-kB는 대부분의 세포에서 NF-κB의 활성을 억제하는 IκB(inhibitor κB) 단백과 결합하여 세포질 내에서 비활성화 상태로 존재한다. NF-κB의 활성경로는 NF-κB가 억제단백질인 IκB와 세포질에서 분리되어 핵막을 통과하여 핵내로 이동되고 유전자 발현을 조절하는 것으로 보고되어 있다. 이때 분리된 IκB는 인산화와 polyubiquitination과정을 거쳐 proteasome에서 분해된다.

이를 위해 Raw264.7 세포를 6well에 각 1.6×10⁶ cells/well 세포를 준비한 후 풀무치 추출물(LME)을 농도별로 1시간 처리 하였다. 그 후 염증을 유발하기 위해 LPS를 100 ng/㎖ 농도로 30분간 처리하고 PBS로 세척한 후 RIPA lysis buffer를 이용하여 단백질을 추출하여 NF-kB와 MAP kinases의 발현 및 인산화 변화를 관찰하였다

또한 염증반응에서 Mitogen-activated protein kinase (MAPK)들은 면역반응 매개물질의 생산에 중요한 역할을 하고 있어 MAPKs의 인산화 과정을 살필 필요가 있다. 풀무치 추출물을 1시간 전처리 후 LPS로 40분간 염증 반응을 유도하여 각 MAPK의 인산화 과정을 확인하였다.

각 실험결과는 도 4에 나타내었는데, 도 4A를 참고하면, LPS에 의해 증가한 IkB의 인산화가 풀무치 추출물의 농도에 의존적으로 감소됨을 확인할 수 있으며, LPS에 의해 현저히 감소된 IkB 단백질의 양 또한 풀무치 추출물에 의해 증가됨을 알 수 있다.

MAPK 신호전달에서는, 도 4B와 같이 풀무치 추출물을 1시간 전처리 후 LPS로 40분간 염증 반응을 유도하였을 때 LPS 단독 처리군에서 Extracellular Signal-regulated kinases(ERK)와 c-Jun N-terminal Kinase(JNK)의 인산화가 현저히 증가되었으나 풀무치 추출물 처리군에서 두 단백질의 인산화가 풀무치 추출물 농도에 의존적으로 감소됨을 확인할 수 있다. 그러나 LPS에 의해 증가된 p38 MAP kinase의 인산화는 풀무치 추출물을 처리한 군에서 감소하지 않는다. 이러한 결과는 풀무치 추출물이 염증 반응의 주요 매커니즘인 ERK와 JNK의 인산화 억제를 통해 염증반응을 조절하고 있음을 알 수 있다.

<제제예 1. 약학적 제제>

본 발명의 풀무치 에탄올 추출물 200g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

<제제예 2. 식품 제조>

제제예 2-1. 조리용 양념의 제조

본 발명의 풀무치 에탄올 추출물을 조리용 양념에 1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

제제예 2-2. 밀가루 식품의 제조

본 발명의 풀무치 에탄올 추출물을 밀가루에 0.1 중량%로 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

제제예 2-3. 스프 및 육즙(gravies)의 제조

본 발명의 풀무치 에탄올 추출물을 스프 및 육즙에 0.1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 수프 및 육즙을 제조하였다.

제제예 2-4. 유제품(dairy products)의 제조

본 발명의 풀무치 에탄올 추출물을 우유에 0.1 중량%로 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

제제예 2-5. 야채주스 제조

본 발명의 풀무치 에탄올 추출물 0.5g을 토마토주스 또는 당근주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.

제제예 2-6. 과일주스 제조

본 발명의 풀무치 에탄올 추출물 0.1g을 사과주스 또는 포도주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일주스를 제조하였다.

<화장료 제형예 1. 유연 화장수의 제조>

하기 표 1의 조성과 같이, 본 발명의 풀무치 에탄올 추출물을 함유한 유연 화장수(스킨, 100g)를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

원료	함량 (g)
풀무치 에탄올 추출물	0.3
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	2.0
프로필렌글리콜	2.0
폴리옥시에칠렌(60)경화 피마자유	1.0
에탄올	10.0
트리에탄올아민	0.1
방부제	미량
색소	미량
향료	미량
정제수	잔량

<화장료 제형예 2. 영양 화장수의 제조>

하기 표 2의 조성과 같이, 본 발명의 풀무치 에탄올 추출물을 함유한 영양 화장수(로션, 100g)를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

원료	함량 (g)
풀무치 에탄올 추출물	0.1
시토스테롤	1.7
폴리글리세릴 2-올레이트	1.5
세테아레스	1.2
콜레스테롤	1.5
디세틸포스페이트	0.4
농글리세린	5.0
선플라워오일	10.0
카르복시비닐폴리머	0.2
산탄검	0.3
방부제	미량
향료	미량
정제수	잔량

Claims

풀무치(Locusta migratoria) 에탄올 추출물을 함유하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
상기 풀무치 에탄올 추출물은 NO(Nitric oxide), iNOS(inducible Nitric oxide synthase), COX-2(cyclooxygenase-2) 및 TNF-α(tumor necrosis factor-α)로 이루어진 군 중에서 선택되는 염증 반응인자의 발현을 억제하며,
상기 염증 질환은 염증성 장질환, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 관절염, 폐렴, 췌장염, 패혈증, 방광염, 신장염 및 신경염으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 풀무치 에탄올 추출물은 70 % (v/v) 에탄올 수용액 추출물인 것을 특징으로 하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
삭제
삭제
삭제
풀무치(Locusta migratoria) 에탄올 추출물을 함유하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품으로서,
상기 풀무치 에탄올 추출물은 NO(Nitric oxide), iNOS(inducible Nitric oxide synthase), COX-2(cyclooxygenase-2) 및 TNF-α(tumor necrosis factor-α)로 이루어진 군 중에서 선택되는 염증 반응인자의 발현을 억제하며,
상기 염증 질환은 염증성 장질환, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 관절염, 폐렴, 췌장염, 패혈증, 방광염, 신장염 및 신경염으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 건강기능식품.
삭제
풀무치(Locusta migratoria) 에탄올 추출물을 함유하고,
상기 풀무치 에탄올 추출물은 NO(Nitric oxide), iNOS(inducible Nitric oxide synthase), COX-2(cyclooxygenase-2) 및 TNF-α(tumor necrosis factor-α)로 이루어진 군 중에서 선택되는 염증 반응인자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 항염증용 화장료 조성물.