KR20210073558A

KR20210073558A - 안티-에이징 및 피부 재생 특성을 가지는 피츠로야 쿠프레소이데스(알레르세)의 세포로부터의 수용 추출물(aqueous extract from cells of fitzroya cupressoides (alerce) with anti-aging and skin regeneration properties)

Info

Publication number: KR20210073558A
Application number: KR1020217013918A
Authority: KR
Inventors: 조세 펠리페 아쿠아 제발로스
Original assignee: 루비스코 바이오테크놀로지; 폰다시온 코펙-우니베르시다드 카톨리카
Priority date: 2018-10-08
Filing date: 2019-10-08
Publication date: 2021-06-18
Also published as: US20210338755A1; EP3863406A4; CL2018002863A1; BR112021006621A2; WO2020075074A1; EP3863406A1

Abstract

알레르세 세포들의 인비트로 배양으로부터 수득될 수 있는 수성 알레르세(피츠로야 쿠프레소이데스) 세포 추출물들이 제공된다. 수용 알레르세 세포 추출물들은 세포 재생을 촉진하고, 따라서 안티-에이징 특성들을 가진다. 알레르세 세포 추출물들은 인간 세포들에 대하여 독성 효과들을 가지지 않는 것으로 밝혀졌고, 그리고 피부 암 세포들을 증가시키지 않는 것을 밝혀졌다. 이러한 추출물들은 스킨 케어를 위한 약학 또는 미용 제형들에 사용될 수 있고, 특히 피부의 안티-에이징 및/또는 재생을 증진한다.

Description

안티-에이징 및 피부 재생 특성을 가지는 피츠로야 쿠프레소이데스(알레르세)의 세포로부터의 수용 추출물(AQUEOUS EXTRACT FROM CELLS OF FITZROYA CUPRESSOIDES (ALERCE) WITH ANTI-AGING AND SKIN REGENERATION PROPERTIES)

본 개시는 일반적으로 알레르세(Alerce) 추출물들에 관한 것으로, 보다 구체적으로 세포 재생 및 안티-에이징 특성들을 가지고 그리고 스킨 케어용 약학 및/또는 미용 조성물들에 사용하기에 적합한 알레르세 세포 추출물들에 관한 것이다.

피츠로야(Fitzroya)는 측백나무과(Cupresaceae) 계통에 속하는 식물들의 속(genus)이다. 이것은 단형 속(monotypic genus)이며, 그 유일한 종들은 기원인 나라들(아르헨티나 및 칠레)에서 알레르세(Alerce) 또는 파타고니아 알레르세로 알려진 거대한 나무인 피츠로야 쿠프레소이데스(Fitzroya cupressoides)이다. 이 나무는 느리게 자라는 종들이고, 그리고 또한 매우 오래동안 산다. 칠레의 알레르세 해안 국립 공원(Alerce Coastal National Park)에 "Great Grandfather"로 알려진 표본(specimen)은 3622년 이상인 것으로 보고되었으며, 이는 세계에서 3번째로 오래된 살아있는 나무에 해당한다.

이 나무(wood)는 가볍고, 강렬한 붉은 색을 뛰며, 그리고 부패 및 병해충에 강해다. 이것은 나무결을 따라 매우 잘 쪼개질 수 있어, 나무를 도끼로 쪼개어 길고 얇은 판자들을 얻을 수 있게 한다. 이러한 이유들로, 이 나무는 매우 가치가 높다. 20세기 초에, 극심한 삼림 벌채는 이 나무 개체군을 멸종 위기에 처하게 했다. 현재 피츠로야 쿠프레소이데스는 엄격한 보호 프로그램 하에 있어, 그 채벌이 아르헨티나 및 칠레에서 금지되어 있다.

피츠로야 쿠프레소이데스의 생리학(physiology) 또는 물질대사(metabolism)에 대하여 몇 가지 연구들이 있다. 예를 들어, 나무 잎사귀의 세스퀴테르펜류(sesquiterpenes)에 대한 연구가 있었다 (Cool, L. G., Sesquiterpene alcohols from foliage of Fitzroya cupressoides, Phytochemistry, 42(4), 1015-1019 (1996) 참조). 이 연구에서, 알레르세 잎들의 용도는 결정되지 않았다. 이 연구는 몇몇의 파이토케미컬 성분(phytochemical component)들에 대한 설명을 제공하나, 이들의 가능한 기능들이나 응용들에 대한 설명은 제공하지 않았다. 또 다른 예인 미국 특허번호 제 US5955621호에서, 알레르세 종자 및 새싹 세포들이 식물 세포들에서 탁산 화합물의 존재를 추정하는데 사용되었다. 따라서, 알레르세로부터 유용한 조성물들을 수득하기 위한 상용화 가능한 방법들이 본 기술분야에서 요구된다.

본 개시는 약학 및 미용 특성들(특히 피부 재생 및 안티-에이징 효과)을 가지는, 알레르세 세포들로부터 수득되는 수성 추출물을 제공한다. 이 추출물은 건강을 증진하고, 그리고 근래의 부상 또는 흉터 발생시에 조직 재생 뿐만 아니라 표현 선(expression line)들 및 주름들의 출현을 감소시키기 위한 피부의 치료 및 보호를 위한 제품들을 개발하는데 유용하다.

몇몇 양상들에서, 알레르세 세포들을 인비트로(in vitro) 배양하고; 그리고 세포 배양물로부터 알레르세 세포 추출물을 수득하기 위한 방법들이 본 명세서에서 제공된다. 몇몇 실시예들에서, 생성된 조성물들이 적용될 피부 뿐만 아니라 환경에 친화적인 물에서 추출물을 수득하기 위한 방법(process)이 제공된다. 몇몇 변형들에서, 알레르세 세포들의 인비트로 배양물들은 세포를 수성 용매에 기계적으로 용해시키고, 원심분리에 의해 알레르세 세포 추출물을 포함하는 상청액을 분리(isolate)하여 수득된다.

수성 알레르세 세포 추출물들은 각질 세포들 상에 세포 재생을 증진하고, 따라서 안티-에이징 특성들을 가진다(표준 스크래치 테스트(standard scratch test)를 이용함). 몇몇 변형들에서, 알레르세 세포 추출물들은 기저 조건(대조군 물(control water))에서 각질 세포들의 재생을 최대 120%까지 자극한다. 또한, 알레르세 세포 추출물들의 가능한 독성들이 조사되어, HaCaT 세포들의 생존력 상에 추물물의 효과가 연구되었다. 알레르세 세포 추출물들은 인간 세포들 상에 독성 효과들을 가지지 않는 것으로 밝혀졌다. C32 흑색종 세포들에 대한 추출물의 효과를 조사하였을 때 알레르세 세포 추출물들은 피부암 세포들을 촉진(boost)하지 않았다.

상술한 바에 따르면, 알레르세 세포 추출물들은 특히 피부의 안티-에이징 및/또는 재생을 증진하기 위한 스킨 케어용 약학 또는 미용 제형들에 사용하기에 적합한 것으로 밝혀졌다.

본 출원은 첨부되는 도면들과 함께 이루어지는 다음 설명을 참조하여 이해될 수 있다.
도 1은 1(예에서 수득되는 추출물)와 0.002% w/v에서 0.125% w/v까지의 순차적인 희석액(serial dilution)들 사이의 상이한 희석액들에서 알레르세 추출물 1에 24시간 동안 노출된 이후에 HaCaT로 지칭되는 각질 세포주의 타당성(Feasibility) 테스트를 도시한다. 대조군으로, 세포에 비독성인 것으로 알려진, 10% 소태아혈청(10% FBS) 및 물이 사용되었다. 이 결과들은 추출물이 테스트된 조건들 하에서 세포 생존력에 영향을 주지 않는다는 것을 나타낸다.
도 2는 물(음성 대조군), 10% FBS(양성 대조군), 10ng/mL EGF(양성 대조군), 및 0.1250, 0.0313, 0.0078, 0.0020 및 0.0005 % w/v의 희석액들에서 예시 1에서 수득되는 추출물들로 보충된 배양 배지로 배양된 24시간된 표피 세포의 단층 스크래치 회복율에 대한 스크래치 테스트를 도시한다. 이 추출물들은 테스트된 모든 농도에서 대조군 물 보다 나은 결과들을 가지는 것으로 관찰되었다.
도 3은 물(음성 대조군), 10% FBS(양성 대조군), 10ng/mL EGF(양성 대조군), 및 0.1250, 0.0313, 0.0078, 0.0020 및 0.0005 % w/v의 희석액들에서 예시 1에서 수득되는 추출물들로 보충된 배양 배지로 배양된 48시간에서의 표피 세포의 단층 스크래치 회복율에 대한 스크래치 테스트를 도시한다. 이 추출물들은 테스트된 모든 농도에서 대조군 물 보다 나은 결과들을 가지는 것으로 관찰되었다.
도4는 1(예시에서 수득된 추출물)과 0.125% w/v 내지 0.002% w/v의 순차적인 희석액들 사이의 상이한 희석액들에서 알레르세 추출물 1에 24시간동안 노출된 이후에 C-32 흑생종 세포주의 생존력 테스트를 도시한다. 대조군으로, 세포들에 비독성인 것으로 알려진 10% 소태아혈청(10% FBS) 및 물이 사용되었다. 이 결과들은 추출물이 테스트된 최고 농도에서 세포 생존력에 영향을 줌을 나타낸다.
도 5는 상처 치유 회복에서 미토마이신 C의 효과의 평가를 도시한다. 사용된 농도들은 10% 소태아혈청(FBS), 10 ng/mL 표피 성장 인자(EGF), 및 0.125% 알레르세 추출물들이다. 미토마이신 C는 각각의 처치(treatment) 전에 적용되었다. 상이한 문자들은 현저한 차이를 나타낸다. P < .05

이하의 설명은 예시적인 방법들, 수치들 등을 설명한다. 그러나 이러한 설명은 본 개시의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니며 대신 예시적인 실시예들의 설명으로 제공된다는 것이 이해되어야 한다.

몇몇 양상들에서, 피부의 안티-에이징 및 세포 재생을 위한 특성들을 가지는 알레르세(피츠로야 쿠프레소이데스(Fitzroya cupressoides))의 수성 식물 추출물이 제공된다.

몇몇 실시예들에서, 추출물은 하나 이상의 다음 주요 화합물을 포함한다: 4,5-디히드록시프탈레이트(4,5-dihydroxyphthalate);2'',4'',6''-트리아세틸글리신(2'',4'',6''-triacetylglycine); 6-포스포글루콘산(6-phosphogluconic acid); 2-O-카페오일하이드록시시트르산(2-O-cafeoylhydroxycitric acid); 카테킨 7-O-베타-D-자일로사이드(catechin 7-O-beta-D-xyloside); 4,5-디-O-카페오일퀸산 (4,5-di-O-cafeoylquinic acid); 5,7,2',3',4'-펜타히드록시-3,6-디메톡시플라본7-글리코시드(5,7,2',3',4'-pentahydroxy-3,6-dimethoxyfllavone7- glycoside); PE; 미리세틴 3,7-다이글루쿠로나이드(myricetin 3,7-diglucuronide); 및 토로사플라본(torosaflavone).

몇몇 변형들에서, 추출물은 표시되는 양(총 조성물의 중량 백분율)으로 다음의 주요 화합물을 포함한다:

4,5-디히드록시프탈레이트 (0.4%-6.1%),

2'',4'',6''-트리아세틸글리신 (0.25%-6.03%),

6-포스포글루콘산 (0.43%-4.32%),

2-O-카페오일하이드록시시트르산 (0.34%-3.86%),

카테킨 7-O-베타-D-자일로사이드 (0.37%-3.23%),

4,5-디-O-카페오일퀸산 (0.26%-3.09%),

5,7,2',3',4'-펜타히드록시-3,6-디메톡시플라본7-글리코시드 (0.25%-2.68%),

PE (19:0/12:0) (0.3%-2.09%),

미리세틴 3,7-다이글루쿠로나이드 (0.7%-1.29%), 및

토로사플라본 (0.19%-1.26%).

다른 양상에서, 본 명세서에서 설명되는 추출물들을 수득하기 위한 방법들이 제공된다. 몇몇 실시예들에서, 방법은 a) 0.0005% w/v 내지 10% w/v 사이의 농도로 알레르세 세포들을 물과 혼합하는 단계; b) 1시간 내지 5일 사이의 기간 동안 10 내지 40°C 사이의 온도에서 휘저으면서(stirring) 혼합물을 배양하는 단계; 및 c) 수성 상(aqueous phase)을 수득하기 위해 배양된 혼합물을 분리하는 단계를 포함하고, 여기서 수성 상은 추출물을 포함한다.

일 실시예에서, 방법은 a) 0.0005% w/v 내지 10% w/v 사이의 농도로 알레르세 세포들을 물과 점진적으로 혼합하는 단계; b) 1시간 내지 5일 사이의 기간 동안 10 °C 내지 40°C 사이의 온도에서 100 내지 250 rpm으로 휘저으면서 혼합물을 배양하는 단계; 및 c) 수성 상을 수득하기 위해 혼합물을 분리하는 단계를 포함하고, 여기서 수성 상은 추출물을 포함한다.

상술한 몇몇 변형들에서, 방법은 다음 단계들 중 몇몇 또는 모두를 더 포함한다: 추출물을 멸균하는 단계; 및/또는 -80°C 내지 4°C 사이의 온도에서 추출물을 저장하는 단계; 및/또는 추출물을 동결 건조(freeze drying)하는 단계.

몇몇 실시예들에서, 알레르세 세포들은 단계 a)에서 0.001% w/v 내지 5% w/v, 또는 0.05% 내지 3% 사이의 농도로 알레르세 세포들이 물과 혼합된다. 몇몇 변형들에서, 물은 멸균 상태이다. 특정 변형들에서, 물은 멸균 및 여과된다. 일 변형에서, 22 μm 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 필터로 물이 여과된다.

몇몇 실시예들에서, 단계 b)에서의 혼합물의 배양이 더 높은 온도에서 수행되는 경우에 보다 적은 추출 시간이 필요하다. 예를 들어, 일 변형에서, 배양 온도는 40°C이고, 그리고 배양 기간은 1시간 내지 12시간 사이이다. 다른 변형에서, 배양 온도는 30°C이고, 그리고 배양 기간은 1시간 내지 24시간 사이이다. 다른 변형에서, 배양 온도는 20°C이고, 그리고 배양 기간은 12시간 내지 4일 사이이다. 또 다른 변형에서, 배양 온도는 10°C이고, 그리고 배양 기간은 1일 내지 5일 사이이다.

몇몇 실시예들에서, 단계 c)는 추출물을 포함하는 수성 상을 분리하는 단계, 및 펠릿(pellet) 또는 침전물(precipitate)을 폐기하는 단계를 포함한다. 이 분리는 예를 들어, 원심 분리(centrifugation) 또는 여과(filtration)를 포함하는 본 기술 분야에서 공지된 임의의 적합한 방법들 또는 기술들로 수행될 수 있다. 일 변형에서, 분리는 4000 내지 12000 rpm 사이의 속도로 5 내지 30분 동안 원심 분리에 의해 수행된다.

방법이 추출물의 멸균을 포함하는 특정 실시예들에서, 멸균은 예를 들어, 0.22 μm 필터를 이용한 여과에 의하거나, 또는 UV 방사선에 의하거나, 또는 추출물의 안정성 또는 구성을 변화시키지 않는 본 기술분야에서 공지된 임의의 다른 방법 또는 기술에 의해 수행된다.

다른 양상들에서, 스킨 케어용 약학 및/또는 미용 조성물들에서 안티-에이징 및 세포 재생을 위한 본 명세서에서 설명되는 알레르세 세포 추출물들의 용도가 제공된다. 본 명세서에서 설명되는 알레르세 세포 추출물들은 조직 재생에서 훌륭한 특성들을 나타내고, 따라서 안티-에이징 효과들에서 훌륭한 특성들을 나타낸다. 흑생종, 특히 피부암 세포들에 대한 추출물들의 효과들이 연구되었다. 이 연구들은 본 명세서에서 설명되는 알레르세 세포 추출물들이 암 세포들의 세포 생존에 부정적인 영향을 미치고, 세포 증식에 호의적이지 않음을 보여주었다. 이러한 방식으로, 알레르세 세포 추출물들은 피부 상에 문제없이 사용될 수 있어 피부의 재생을 돕거나 안티-에이징을 증진할 수 있다. 피부가 흑색종을 가지는 경우에, 발암성(carcinogenic) 세포들의 성장이 알레르세 세포 추출물들에 의해 향상된다. 오히려, 알레르세 세포 추출물들은 발암성 세포들의 성장을 억제할 수도 있다.

본 명세서에서 설명되는 알레르세 세포 추출물들은 알레르세 세포들의 인비트로 배양으로부터 수득되며 그리고 본 명세서에서 설명되는 이 방법들은 여러 이점들을 나타낸다. 이 방법들은 원 재료들의 수확을 필요로 하지 않으며, 종들에게 해를 끼치지 않으며, 그리고 추출물들은 계절에 의존하지 않고 마음대로(원 재료의 수확을 필요로 하는 대다수의 식물 추출물들에 대조적으로) 수득될 수 있다. 또한, 이것은 그 성분들에서의 추출물의 재현성을 보장하며, 이는 환경 조건들이 제어되고, 바이오매스(biomass)가 균질(homogeneous)하기 때문이다.

본 명세서에서 설명되는 알레르세 세포 추출물들은 인간 피부 상에 사용하기 위한 훌륭한 특성들을 보여주었으며, 그리고 각질 세포들(HaCaT 세포주) 상에 어떠한 독성 또는 부정적인 효과를 나타내지 않는다. 또한, 본 명세서에서 설명되는 알레르세 세포 추출물들은 세포 재생을 촉진하며, 표피 세포의 단측 손상이 수행되고 이 병변(lesion)의 회복 비율이 주어진 시간 동안 측정되는 스크래치 테스트를 이용하면(도 2 및 도3), 48 시간에 손상의 약 70 내지 80%에 달하는, 24시간 및 48시간에서의 대조군 물에 비교하여 2배인 회복률을 추출물들이 보였다. 이 결과들은 추출물이 조직 재생에 효과를 가져, 따라서 안티-에이징 효과 또는 표현 선들 또는 주름들의 예방 또는 회복에 효과를 가지고, 그리고 흉터들 및 상처들에서의 재생에 대해 효과를 가짐을 확인할 수 있게 한다.

피부 상에 사용될 제품들의 기본적인 양상은 이들이 피부암 세포들, 또는 흑색종 상에 보이는 작용(activity)이며, 이는 특히 제품들이 이들의 증식을 촉진하는 경우에 이러한 제품들이 피부 상에 사용될 수 없기 때문이다. 이 경우에, 본 명세서에서 설명되는 알레르세 세포 추출물들이 흑색종 세포주들 상에 테스트되었으며, 이들은 성장 또는 증식을 자극하지 않을 뿐만 아니라 최대 20%까지 억제하여, 약학 및/또는 미용 용도에 대해 안전한 추출물임을 나타내었다.

몇몇 실시예들에서, 본 명세서에서 설명되는 알레르세 추출물들은 표현 선들 및 주름들의 방지, 회복 또는 제거 또는 안티-에이징 효과들을 획득하기 위한 미용 제형들 뿐만 아니라 피부의 재생을 촉진하기 위한 크림류, 세륨류, 연고류와 같은 약학 제형들에 사용될 수 있다. 몇몇 변형들에서, 본 명세서에서 설명되는 알레르세 세포 추출물들을 제형들은 크림들, 세륨, 젤들, 클렌져들, 또는 로션들이다. 몇몇 변형들에서, 제형들은 글리세린, 담체(carrier)들, 향료들, 보존제들, 염료들, 또는 본 명세서에서 설명되는 알레르세 세포 추출물들의 특성들을 변형하지 않는 다른 성분들을 더 포함할 수 있다.

다른 실시예들에서, 약학 및/또는 미용 제형들은 본 명세서에서 설명되는 알레르세 세포 추출물의 특성들에 보완적인 화합물들 또는 다른 활성 화합물을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 변형들에서, 제형은 비타민들(예를 들어, 비타민 E), 미네랄들, 또는 시너지 효과들을 달성할 수 있는 다른 성분들을 더 포함할 수 있다. 일 변형에서, 본 명세서에서 설명되는 세포 추출물들은 선크림 제형으로 통합될 수 있다.

약학 및/또는 미용 조성물들은 본 명세서의 방법들에 의해 수득되는 일 부피의 추출물을 포함함으로써 본 명세서에서 설명되는 알레르세 세포 추출물들을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 변형들에서, 0.0005 내지 1% w/v 사이의 농도인 알레르세 세포 추출물들이 최종 농도 0.03% 내지 1% w/v의 추출물을 가지는 최종 제품(피부 상에 직접적으로 사용될)을 구현하도록 제형화된다.

열거되는 실시예들

이하에 열거되는 실시예들은 본 발명의 몇몇 양상들을 나타낸다.

1. 인비트로(in vitro) 배양되는 알레르세(Alerce) 세포들(피츠로야 쿠프레소이데스(Fitzroya cupressoides))의 수성 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 안티-에이징 및 세포 재생을 위한 조성물.

2. 실시예 1에 따른 조성물에 있어서, 인비트로 배양되는 알레르세 세포들의 추출물에 더하여, 비타민들, 선크림들, 미네랄들 등과 같은, 본 발명의 추출물의 특성들을 보완하는 특성들을 가지는 화합물들 또는 활성 화합물들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.

3. 실시예 1에 따른 조성물에 있어서, 추출물을 포함하는 주요 화합물들은 4,5-디히드록시프탈레이트(0.4%-6.1%), 2'',4'',6''-트리아세틸글리신(0.25%-6.03%), 6-포스포글루콘산(0.43%-4.32%), 2-O-카페오일하이드록시시트르산(0.34%-3.86%), 카테킨 7-O-베타-D-자일로사이드(0.37%-3.23%), 4,5-디-O-카페오일퀸산 (0.26%-3.09%), 5,7,2',3',4'-펜타히드록시-3,6-디메톡시플라본7-글리코시드(0.25%-2.68%), PE(19:0/12:0) (0.3%-2.09%), 미리세틴 3,7-다이글루쿠로나이드(0.7%- 1.29 %), 및 토로사플라본(0.19%-1.26%)에 대응하는 것을 특징으로 하는, 조성물

4. 실시예 1에 따른 인비트로 배양되는 세포들로부터 추출물들을 수득하기 위한 방법에 있어서, 다음과 같은 단계:

a) 0.05% w/v 내지 10% w/v 사이의 농도까지 조금씩 알레르세 세포들을 물과 혼합하는 단계;

b) 1시간 내지 5일 사이의 기간 동안 10 내지 40°C 사이의 온도에서 100 내지 250 rpm으로 휘저으면서 혼합물을 배양하는 단계; 및

c) 상기 추출물을 구성하는 수성 상(aqueous phase)을 분리하는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

5. 실시예 4에 따른 수득 방법에 있어서, 다음의 단계들:

d) 상기 추출물을 멸균하는 단계;

e) -80°C 내지 4°C 사이의 온도에서 상기 추출물을 저장하는 단계;

f) 상기 추출물을 동결 건조(freeze drying)하는 단계:

중 몇몇 또는 모두를 선택적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.

6. 실시예 4 또는 5 중 어느 하나에 따른 수득 방법에 있어서, 단계 a)에서 현탁액의 농도는 0.1% w/v 내지 5% w/v 사이인 것을 특징으로 하는, 방법.

7. 실시예 4 또는 5 중 어느 하나에 따른 수득 방법에 있어서, 단계 b)는 1시간 내지 12시간 사이 동안 40°C에서 배양되는 것을 특징으로 하는, 방법.

8. 실시예 4 또는 5 중 어느 하나에 따른 수득 방법에 있어서, 단계 b)는 1시간 내지 24시간 사이 동안 30°C에서 배양되는 것을 특징으로 하는, 방법.

9. 실시예 4 또는 5 중 어느 하나에 따른 수득 방법에 있어서, 단계 b)는 12시간 내지 4일 사이 동안 20°C에서 배양되는 것을 특징으로 하는, 방법.

10. 실시예 4 또는 5 중 어느 하나에 따른 수득 방법에 있어서, 단계 b)는 1일 내지 5일 사이 동안 10°C에서 배양되는 것을 특징으로 하는, 방법.

11. 실시예 4 또는 5 중 어느 하나에 따른 수득 방법에 있어서, 단계 c)에서 분리는 원심 분리(centrifugation) 또는 여과(filtration)에 의해 수행될 수 있는 것을 특징으로 하는, 방법.

12. 실시예 5에 따른 수득 방법에 있어서, 단계 d)에서, 멸균은 UV 방사선에 의하거나, 또는 0.22 μm 필터를 이용한 여과에 의해 수행될 수 있는 것을 특징으로 하는, 방법.

13. 실시예 1 내지 3 중 어느 하나에 따른 추출물의 용도에 있어서, 약학 또는 미용 스킨 케어 용도를 위한 제형들을 수득하는데 사용되는 것을 특징으로 하는, 용도.

14. 실시예 13에 따른 추출물의 용도에 있어서, 추출물은 피부 재생을 위한 약품을 제조하는데 사용되는 것을 특징으로 하는, 용도.

15. 실시예 13에 따른 추출물의 용도에 있어서, 추출물은 안티-에이징 스킨 효과를 가지는 조성물을 제조하는데 사용되는 것을 특징으로 하는, 용도.

16. 실시예 13에 따른 추출물의 용도에 있어서, 추출물은 표현 선들 또는 주름들을 방지하고 예방하기 위한 조성물을 제조하는데 사용되는 것을 특징으로 하는, 용도.

17. 실시예 13에 따른 추출물의 용도에 있어서, 추출물은 흑색종 세포들의 생존력을 감소시키기 위한 조성물을 제조하는데 사용되는 것을 특징으로 하는, 용도.

18. 스킨 케어용 조성물에 있어서, 0.0005 % w/v 내지 10% w/v 사이의 최종 농도로, 실시예 1 내지 3의 조성물 및 제형 부형제들을 포함하는 것을 특징으로, 조성물.

19. 실시예 18에 따른 스킨 케어용 조성물에 있어서, 0.0005 % w/v 내지 10% w/v 사이의 최종 농도로, 실시예 1 내지 3의 조성물 및 제형 부형제들을 포함하는 것을 특징으로, 조성물.

20. 실시예 19에 따른 스킨 케어용 조성물에 있어서, 0.05 % w/v 내지 1% w/v 사이의 최종 농도로, 실시예 1 내지 3의 조성물 및 제형 부형제들을 포함하는 것을 특징으로, 조성물.

예시들

현재 개시되는 주제는 제한이 아닌 본 발명의 예시로서 제공되는, 이하의 예시들을 참조하여 보다 잘 이해될 것이다.

예시 1: 알레르세 세포 추출물들의 제조

추출물은 이들의 제조에 사용되는 시간, 비용 및 장비를 달리하여 다양한 방식으로 제조될 수 있다. 본 발명의 추출물들을 수득하기 위한 일 방법은 이하에 상세히 설명된다.

0.2g의 신선한 알레르세 세포들이 취해지고 세척되어 배양 배지의 흔적(trace)들을 제거하고, 플라스크에 담겨지고, 20 ml의 물이 조금씩 첨가되어, 1% 중량/부피 현탁액을 수득하였다. 그리고 이것은 2시간 동안 30°C의 온도에서 180 rpm으로 휘저으면서 배양되었다. 그리고, 이것은 실온에서 식혀지고, 전체 내용물은 8000 rpm으로 10분동안 원심 분리된 50 ml 팔콘(Falcon) 튜브에 통과시켰다. 상층액이 제거되고, 고형 조직을 배출하여, 추출물을 수득한다. 추가적으로 수득된 추출물은 0.22 μm 필터로 여과되어 살균되고, 그리고 일부는 -20°C에서 그리고 일부는 -80°C에서 저장되었다.

수득되는 추출물은 고성능 액체 크로마토그래프 방법(또는 HPLC)에 의해 그 조성물에 대하여 분석되었고, 주요 구성 성분은: 4,5-디히드록시프탈레이트 (6.1%), 2'',4'',6''-트리아세틸글리신 (6.03%), 6-포스포글루콘산 (4.32%), 2-O-카페오일하이드록시시트르산 (3.86%), 카테킨 7-O-베타-D-자일로사이드 (3.23%). 4,5-디-O-카페오일퀸산 (3.09%), 5,7,2',3',4'-펜타히드록시-3,6-디메톡시플라본7-글리코시드 (2.68%), PE (19:0/12:0)(2.09%), 미리세틴 3,7-다이글루쿠로나이드 (1.29%), 및 토로사플라본 (1.26%)으로 결정되었다. PE (19:0/12:0)은 각각 12개의 탄소들 및 19개의 불포화 지방산들로 치환된, 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine)의 유도체인 디아실글리세롤이라는 점이 이해되어야 한다.

예시 2: 인간 피부 세포 상에 독성 평가

이 실시예에서, 피부 상에 예시 1에서 획득되는 알레르세 추출물들의 독성이 평가되었다. 이 예시 2는 인간 피부 세포들 상에 수행되었다. 선택된 모델은 인간 표피(피부의 최외층)을 대신하는 HaCaT로 지칭되는 각질 세포주이다.

1% (예시에서 수득되는 추출물)와 0.125% w/v에서 0.002% w/v까지의 이것의 순차적인 희석액들 사이의 상이한 농도들로 희석되어 있는, 알레르세 추출물 1에 24시간 동안 노출된 이후에 세포들의 대사 활성이 평가되는 생존력 테스트가 수행되었다. 모든 농도들은 초기 세포 중량을 최종 부피로 나눈 % w/v으로 표시된다. 또한, 100% 생존력을 유지하는, 세포들에 비-독성인 것으로 알려진, 10% 소태아혈청(10% FBS) 및 물(FBS가 없는)이 대조군들로 테스트되었다. 도 1에서 도시되는 이 결과는 연구된 희석액들 중 어느 하나도 세포 생존력에 영향을 주지 않는 것으로 보이므로, 알레르세 추출물이 피부 세포들에 독성이 아니라는 결과를 내릴 수 있게 하는 증거를 제공한다.

예시 3: 조직 재생에 대한 효과의 평가

이 예시는 표피 세포들의 단층에 손상을 입히는 것에 기초하는, 스크래치 테스트로 지칭되는 제 2 기능성 테스트를 설명한다. 병변의 회복 영역은 상이한 농도의 알레르세 추출물들이 양성 대조군에 비교되는 경우 또는 이것이 대조군이거나 관심 추출물인 것에 관계없이 배양 배지에 첨가되는 상이한 화합물들의 존재 하에서 상처입은 표피 세포들을 배양함으로써 평가되었다. 이 결과들은 초기 병변의 영역과 이 영역이 시간이 지남에 따라 얼마나 감소했는지에 따라 분석되었다. 마지막으로, 병변의 회복 비율을 획득하기 위해 계산이 이루어졌다. 이하의 배지 조성물들이 대조군으로 사용되었다: 1) 음성 대조군: 보충 또는 대조군 물이 없는 불량 배양 배지(소태아혈청 FBS가 없음), 2) 10% FBS: 10% FBS를 가지는 풍부한 배양 배지, 및 3) EGF 10 ng/mL: 10 ng/mL 표피 성장 인자로 보충된 불량 배양 배지. 배양 배지 상에 희석액 0.1250, 0.0313, 0.0078, 0.0020 및 0.0005% w/v으로 사용되었던 예시 1에서 획득되는 추출물들이 평가되었다. 스크래치 회복 비율은 먼저 배양 24시간(이 테스트의 결과들은 도 2에서 도시됨)에 평가되고, 그리고 배양 48시간(이 테스트의 결과들은 도 3에서 도시됨)에 평가되었다.

처리 24시간 이후에, 이 결과들은 추출물들이 테스트되는 모든 농도들에서 대조군 물 보다 나은 결과들을 가짐을 보여준다. 처리 48시간 이후에, 0.125% w/v의 추출물들은 대조군 물에서의 38%의 회복에 비교하여, 70% 이상의 스크래치 회복을 달성하였다. 다시 말해, 추출물들은 테스트된 모든 농도들에서 대조군 물 보다 나은 결과들을 가진다. 이러한 결과들은 조직 재생, 안티-에이징 및 표현 선들 또는 주름들의 예방 또는 회복에 대한 효과, 및 상처들 및 흉터에서의 재생에 대한 효과에 직접적으로 관련되는 세포 재생을 적극적으로 촉진함을 보여준다.

예시 4: 흑색종에 대한 효과의 평가

본 발명의 추출물들이 효과적으로 인간 피부 상에 안전하게 사용될 수 있는지 검사하기 위해, 세포주 C-32를 사용하여 다른 피부 모델인 흑색종에 집중하여 세포 생존력 테스트들이 수행되었다. 이 모델은 무한증식하고(immortal) 높은 증식 능력의 특성들을 나타내는 종양인 특징을 가진다.

생존력 테스트가 수행되었고, 그리고 1% (예시에서 수득되는 추출물)와 0.125% w/v에서 0.002% w/v까지의 순차적인 희석액들 사이의 상이한 농도들로 희석되어 있는, 예시 1에서 수득되는 알레르세 추출물에 24시간 동안 노출된 이후에 C-32 세포들의 대사 활성이 평가되었다. 또한, 10% 소태아혈청(10% FBS) 및 물(FBS 없음)이 대조군으로 포함되었다. 추출물을 이용한 처치와 흑색종 모델의 비교 생존력 테스트의 결과들은 도 4에서 도시된다. 이 결과들은 테스트되는 최고 농도(1% 내지 0.031% 사이)의 알레르세 추출물은 75% 내지 80% 생존력에 달하는, 흑색종 세포 주의 생존력에 영향을 줌을 보여준다.

따라서, 추출물로 치료되는 피부가 흑색종을 앓고 있는 경우, 추출물의 사용이 오히려 유익할 수도 있다. 암 세포들이 알레르세 추출물들에 의해 자극되지 않는다는 것이 밝혀졌다.

예시 5: 미용 또는 약학 스킨 케어 조성물

예시 1에서 수득되는 알레르세 추출물은 피부에 직접적으로 사용될 수 있는 최종 농도 0.03% w/v의 글리세린-기반 크림에 포함되었다. 앞선 예시들은 피부에 대한 본 명세서에서 설명되는 알레르세 추출물들의 유익한 특성들을 보여준다. 추출물들의 특성들을 유지하게 되는 이러한 실시예들에 대한 변형들은 본 기술 분야의 통상의 기술자들에게 명백할 것이며, 모든 이러한 변형들은 첨부되는 청구범위에서 표시되는 바와 같이 본 발명의 범위 내에 속한다.

예시 6: 상처 치유 회복에서의 미토마이신 C의 효과에 대한 연구

이 예시는 알레르세 추출물의 유익한 효과들을 설명하는 특정 메커니즘을 식별하기 위해 상처 치유에 포함되는 상이한 프로세스들의 분리에 초점을 둔다. 세포 분열 억제제들을 이용하는 48 시간 상처 스크래치 실험들은 상처 봉합에 대한 알레르세 세포 배양 추출물의 긍정적인 효과의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공했다. 미토마이신의 적용은 세포 이주와 함께, 상처 치유 회복에 포함되는 2가지 메커니즘들인 HaCaT 세포들의 분열을 억제한다. 미토마이신 C의 사용은 48 시간에 0.125% v/v의 알레르세 세포 배양 추출물에 의해 유도되는 상처 봉합을 현저하게 억제했다(도 5). 이 예시에서, 알레르세 세포 배양 추출물들은 기저 세포주 조건들에 비교하여 세포 분열 억제제의 존재 하에 33%로 감소되었던, 치유 프로세스를 미토마이신 C가 없을 때 190%까지 가속화했다. 이 결과는 알레르세 세포 배양 추출물이 각질 세포 분열을 자극함으로써 상처 치유를 가속화했음을 시사했다.

Claims

안티-에이징 및 세포 재생을 위한 조성물에 있어서,
인비트로(in vitro) 배양되는 알레르세(Alerce) 세포들(피츠로야 쿠프레소이데스(Fitzroya cupressoides))의 수성 추출물을 포함하는,
조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 수성 추출물은: 4,5-디히드록시프탈레이트(4,5-dihydroxyphthalate), 2'',4'',6''-트리아세틸글리신(2'',4'',6''-triacetylglycine), 6-포스포글루콘산(6-phosphogluconic acid), 2-O-카페오일하이드록시시트르산(2-O-cafeoylhydroxycitric acid), 카테킨 7-O-베타-D-자일로사이드(catechin 7-O-beta-D-xyloside), 4,5-디-O-카페오일퀸산 (4,5-di-O-cafeoylquinic acid), 5,7,2',3',4'-펜타히드록시-3,6-디메톡시플라본7-글리코시드(5,7,2',3',4'-pentahydroxy-3,6-dimethoxyfllavone7- glycoside), PE, 미리세틴 3,7-다이글루쿠로나이드(myricetin 3,7-diglucuronide), 및 토로사플라본(torosaflavone)을 포함하는,
조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 조성물은 약제 또는 미용 스킨 케어 용도로 제형화되는,
조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
적어도 하나의 스킨 케어 부형제(excipient)를 더 포함하는,
조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
비타민들, 일광차단제(sunscreen active)들, 또는 미네랄들, 또는 이들의 조합을 더 포함하는,
조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 추출물은 0.0005 % w/v 내지 10% w/v 사이의 최종 농도로 상기 조성물에 존재하는,
조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 추출물은 0.0005 % w/v 내지 5 % w/v 사이의 최종 농도로 상기 조성물에 존재하는,
조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 추출물은 0.05 % w/v 내지 1 % w/v 사이의 최종 농도로 상기 조성물에 존재하는,
조성물.
인비트로 배양되는 알레르세 세포들(피츠로야 쿠프레소이데스)로부터 추출물들을 수득하기 위한 방법에 있어서,
a) 0.05% w/v 내지 10% w/v 사이의 농도로 알레르세 세포들을 물과 혼합하여 혼합물을 수득하는 단계;
b) 1시간 내지 5일 사이의 기간 동안 10 내지 40°C 사이의 온도에서 상기 혼합물을 배양하는 단계; 및
c) 상기 추출물을 포함하는 수성 상(aqueous phase)을 수득하기 위해 상기 혼합물을 분리하는 단계;
를 포함하는,
방법.
제 9 항에 있어서,
상기 추출물을 멸균하는 단계; 또는
-80°C 내지 4°C 사이의 온도에서 상기 추출물을 저장하는 단계; 또는
상기 추출물을 동결 건조(freeze drying)하는 단계: 또는
이들의 어느 한 조합;
을 포함하는,
방법.
제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
단계 a)에서, 상기 농도는 0.1% w/v 내지 5% w/v 사이인,
방법.
제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
단계 b)에서, 상기 배양은 1시간 내지 12시간 사이의 기간 동안 40°C에서 수행되는,
방법.
제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
단계 b)에서, 상기 배양은 1시간 내지 12시간 사이의 기간 동안 30°C에서 수행되는,
방법.
제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
단계 b)에서, 상기 배양은 12시간 내지 4일 사이의 기간 동안 20°C에서 수행되는,
방법.
제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
단계 b)에서, 상기 배양은 1일 내지 5일 사이의 기간 동안 10°C에서 수행되는,
방법.
제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
단계 c)에서, 상기 분리는 원심 분리(centrifugation) 또는 여과(filtration)에 의해 수행되는,
방법.
제 10 항에 있어서,
상기 멸균은 UV 방사선에 의하거나, 또는 0.22 μm 필터를 이용한 여과에 의해 수행되는,
방법.
제 9 항에 따라 제조되는 조성물.
미용 용도로 사람의 피부에 제 1 항, 제 2 항, 및 제 18 항 중 어느 한 항의 조성물을 적용하는 단계;
를 포함하는,
방법.
제 19 항에 있어서,
상기 미용 용도는: 피부 재생; 피부 노화 현상 감소; 또는 주름들 및 표현 선(expression line)을 예방 또는 방지하는 것을 포함하는,
방법.
제 19 항에 있어서,
상기 사람은 흑색종(melanoma)을 앓고 있고, 그리고 상기 미용 용도는 흑색종 세포들의 생존 능력(viability)을 감소시키는 것을 더 포함하는,
방법.