CN102020623B - 蜂斗菜提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，是蜂斗菜提取物及从中分离得到的新的倍半萜内酯化合物蜂斗菜内酯VIa及其用途。蜂斗菜内酯VIa的化学结构式如下：

Description

蜂斗菜提取物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，是蜂斗菜提取物及从中分离得到的新的倍半萜内酯化合物蜂斗菜内酯VIa以及它们在制备防治心脑血管疾病、过敏性鼻炎、肿瘤、老年痴呆、抑郁症、组胺和/或白细胞三烯成分相关疾病药物中的应用。

背景技术

蜂斗菜Petasites japonicus(Sieb.et Zucc.)Maxim，为多年生草本，以全草或根状茎入药，能够解毒祛瘀，治疗扁桃体炎，并且对痈肿疔毒和毒蛇咬伤也有一定的功效。

菊科蜂斗菜属植物作为植物药，其根茎的提取物用于治疗偏头疼，泌尿生殖道痉挛，哮喘，过敏性鼻炎等，倍半萜类化合物被认为是其主要有效成分。但至今未见有关蜂斗菜提取物具有防治心脑血管疾病、过敏性鼻炎、肿瘤、老年痴呆、抑郁症、组胺和/或白细胞三烯成分相关疾病的报道，也未见从蜂斗菜提取物中分离到蜂斗菜内酯VIa的报道。

发明内容

本发明提供一种蜂斗菜提取物及从中分离得到的新的倍半萜内酯化合物蜂斗菜内酯VIa用于制备防治心脑血管疾病、过敏性鼻炎、肿瘤、老年痴呆、抑郁症、组胺和/或白细胞三烯成分相关疾病药物的新用途，所说蜂斗菜内酯VIa的化学结构式如下：

研究表明，本发明蜂斗菜提取物的活性成分主要为蜂斗菜内酯VIa、蜂斗菜内酯-B、蜂斗菜内酯-D和呋喃蜂斗菜醇。

本发明的蜂斗菜提取物和蜂斗菜内酯VIa制备方法如下：

1.制备蜂斗菜提取物

将蜂斗菜干燥根茎粉碎后，用水或乙醇水溶液按常规渗漉提取或浸泡提取，提取液减压浓缩成浸膏，然后用水混悬后用石油醚萃取，将萃取液减压浓缩，得蜂斗菜提取物。

2.制备蜂斗菜内酯VIa

将上述蜂斗菜提取物用硅胶H(60型，青岛海洋化工集团公司)拌样，上硅胶H层析柱，以石油醚∶乙酸乙酯为10∶1→8∶1→5∶1→2∶1→1∶1的溶剂系统进行梯度洗脱，每个极性的洗脱剂分别洗脱五个柱体积，并根据薄层板(HSGF₂₅₄)检测，展开剂为石油醚∶乙酸乙酯(6∶1或3∶1)，紫外灯254nm荧光显色，收集石油醚∶乙酸乙酯为5∶1的洗脱液，减压浓缩，用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以石油醚∶乙酸乙酯(10∶1)常压等度恒速洗脱，根据薄层板(HSGF₂₅₄)检测，展开剂为石油醚∶乙酸乙酯(8∶1)，紫外灯254nm荧光显色，收集纯的组分并分别用丙酮重结晶，依次得到蜂斗菜内酯-B、蜂斗菜内酯-D、呋喃蜂斗菜醇、蜂斗菜内酯VIa，其中，蜂斗菜内酯VIa为新化合物。

经动物实验，本发明蜂斗菜提取物或化合物蜂斗菜内酯VIa均具有防治心脑血管疾病、过敏性鼻炎、肿瘤、老年痴呆、抑郁症、组胺和/或白细胞三烯成分相关疾病的活性，因此可用于制备防治心脑血管疾病、过敏性鼻炎、肿瘤、老年痴呆、抑郁症、组胺和/或白细胞三烯成分相关疾病的药物。

本发明蜂斗菜提取物和化合物蜂斗菜内酯VIa制备方法简单，成本低廉，本发明为防治心脑血管疾病、过敏性鼻炎、肿瘤、老年痴呆、抑郁症、组胺和/或白细胞三烯成分相关疾病提供了一种新的药物来源。

具体实施方式

现结合实施例对本发明作详细描述。

实施例1.制备蜂斗菜提取物。

所用的蜂斗菜采集于浙江湖州。

(1)蜂斗菜干燥根茎50kg，粉碎后用50％乙醇水溶液按常规渗漉提取，提取液减压浓缩至无醇味的浸膏，然后用水混悬至体积为50L，再分别用50L石油醚萃取3次，合并石油醚萃取液，减压浓缩，得蜂斗菜提取物9.6kg。

(2)蜂斗菜干燥根茎50kg，粉碎后用95％乙醇水溶液按常规渗漉提取，提取液减压浓缩至无醇味的浸膏，得蜂斗菜提取物2.4kg，然后用水混悬至体积为50L，再分别用50L石油醚萃取3次，合并石油醚萃取液，减压浓缩，得蜂斗菜提取物2.4kg。

(3)蜂斗菜干燥根茎50kg，粉碎后用70％乙醇水溶液按常规渗漉提取，提取液减压浓缩至无醇味的浸膏，然后用水混悬至体积为50L，再分别用50L石油醚萃取3次，合并石油醚萃取液，减压浓缩，得蜂斗菜提取物5.5kg。

实施例2.制备蜂斗菜内酯VIa

将实施例1中(1)制备的蜂斗菜提取物5g用硅胶H(60型，青岛海洋化工集团公司)拌样，上硅胶H层析柱，以石油醚∶乙酸乙酯为10∶1→8∶1→5∶1→2∶1→1∶1的溶剂系统进行梯度洗脱，每个极性的洗脱剂分别洗脱五个柱体积，并根据薄层板(HSGF₂₅₄)检测，展开剂为石油醚∶乙酸乙酯(6∶1)，紫外灯254nm荧光显色，收集石油醚∶乙酸乙酯为5∶1的洗脱液，减压浓缩，用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以石油醚∶乙酸乙酯(10∶1)常压等度恒速洗脱，根据薄层板(HSGF₂₅₄)检测，展开剂为石油醚∶乙酸乙酯(8∶1)，紫外灯254nm荧光显色，收集纯的组分并分别用丙酮重结晶，依次得到蜂斗菜内酯-B 105mg，蜂斗菜内酯-D120mg，呋喃蜂斗菜醇75mg，蜂斗菜内酯VIa 342mg。

结构鉴定：

将实施例2制备的化合物经过¹H和¹³C-NMR谱和质谱分析，并与文献对照，分别确定为已知内酯类化合物蜂斗菜内酯-B(详见程捷恺，中国药学杂志，1999，34：734-736)，蜂斗菜内酯-D(详见Shirahata K，Tetrahedron Lett，1968，16：1993)，呋喃蜂斗菜醇(详见Yamakawa K，SatohT，Chem Pharm Bull，1979，27：1747-1752)以及新化合物蜂斗菜内酯VIa。

新化合物蜂斗菜内酯VIa的结构鉴定：白色晶体，ESI-MS：m/z 431[M-H]^-，确定化合物分子量为432，HR-MS显示分子式为：C₂₄H₃₂O₇。

从¹³C-NMR谱和DEPT谱中可知该化合物中含有24个C信号，包括8个季C、7个-CH、3个-CH₂和6个CH₃。依据HMQC谱可以对该化合物的碳氢作进一步的归属。从以上信息得出该化合物为倍半萜类化合物。

HMBC中，δ＝6.45的H与δ＝119.7，36.3的C相关，说明一个侧链连接在6位的C上；δ＝5.38的H与δ＝25.9的C相关，δ＝0.98的H与δ＝722的C相关，说明另一个侧链连接在3位的C上。其余各信号之间的偶合相关关系如表1所示。

综合以上分析，确定该化合物的完整结构，其结构式为：

表1.蜂斗菜内酯VIa的¹H、¹³C-NMR数据(400MHz，δ，CDCl₃)

药理、药效实验

本发明蜂斗菜提取物和蜂斗菜内酯VIa的药理或药效学实验方法基本相同，现详述如下：

一、对小鼠全脑缺血的防治作用

本发明用小鼠断头全脑缺血模型研究蜂斗菜提取物和蜂斗菜内酯VIa对脑缺血的防治作用。

1、实验材料与方法

实验动物由中国人民解放军第二军医大学动物中心提供(下同)；实验所用的蜂斗菜提取物为实施例1中(1)制备的提取物，蜂斗菜内酯VIa由实施例2制备(下同)。

ICR小鼠40只，体重：18～22g，雌雄各半，随机分为4组，即蜂斗菜提取物组、蜂斗菜内酯VIa组、空白对照组和阳性对照组，每组10只，药物配成溶液，溶剂为0.5％的西黄蓍胶水溶液，分别灌胃给药，阳性对照药为尼莫地平，空白对照组灌胃等体积溶剂，给药剂量分别见表2～表4，5天后断头处死小鼠，记录断头后小鼠张口呼吸次数和呼吸时间。取大脑右半球约100mg，用生理盐水匀浆，测定组织匀浆液中的肌酸激酶、乳酸含量。所用肌酸激酶、乳酸含量测定试剂盒为南京建成生物工程研究所出品，使用方法详见产品说明。

2、实验结果

计量资料以均数±标准差(

±SD)表示，各组分别与空白对照组比较，采用双侧两样本t检验进行统计分析。结果见表2～表4。

表2.小鼠断头后张口呼吸持续时间统计表(

±SD)

与空白对照组比较*P＜0.05

表3.小鼠脑组织匀浆液中肌酸激酶含量统计表(x±SD)

与空白对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01

表4.小鼠脑组织匀浆液中乳酸含量统计表(x±SD)

与空白对照组比较**P＜0.01

由表2～表4可见，蜂斗菜提取物或蜂斗菜内酯VIa能显著延长小鼠断头后张口呼吸持续时间(P＜0.05)，而且能显著提高脑组织中肌酸激酶含量(P＜0.05)并显著降低脑组织中乳酸的含量(P＜0.01)。说明本发明蜂斗菜提取物或蜂斗菜内酯VIa对小鼠全脑缺血具有显著疗效。

二、对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用

1、实验材料与方法

以0.5％的西黄蓍胶水溶液为溶剂，配制蜂斗菜提取物及蜂斗菜内酯VIa溶液，尼莫通为阳性对照药。

取雄性SD大鼠50只，体重180～230g，随机分成5组，每组10只，第1组为假手术组，第2组为阴性对照组，亦即溶剂组，注射等体积溶剂，第3组为蜂斗菜提取物组，给药剂量为40mg/kg，第4组为蜂斗菜内酯VIa组，给药剂量为10mg/kg，第5组为尼莫通组，给药剂量2mg/kg。给药时间为缺血后立即腹腔注射，给药体积为1ml。

参照Longa EZ报道的线栓模型制备脑缺血再灌注损伤模型(Longa EZ，et al：Reversablemiddle cerebral artery occlusion without craniectomy in rat.Stroke，1989，20：84)。缺血2小时再灌注24小时后进行行为学评分，断头取脑，TTC染色，留取样本进行脑梗塞体积测定(详见张均田主编：现代药理实验方法学，第1241页，北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998年10月第1版)。

所有数据均采用

±SD表示，统计学分析采用t检验。

2、实验结果结果见表5。

表5蜂斗菜提取物及蜂斗菜内酯VIa对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用(n＝10，

±SD)

^*P＜0.05，^**P＜0.01与溶剂组比较

从表5可以看出，蜂斗菜提取物或蜂斗菜内酯VIa可显著降低大鼠行为评分，缩小脑梗死面积，减轻缺血侧脑半球水肿程度。表明蜂斗菜提取物或蜂斗菜内酯VIa对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤均有较强保护作用。

三、对异丙肾上腺素(ISO)所至大鼠心肌缺血治疗作用

1、实验材料与方法

健康雌性SD大鼠32只，体重180～230g，随机均分为4组，分别为空白对照组、模型对照组、蜂斗菜提取物组和蜂斗菜内酯VIa组。空白对照组和模型对照组分别按体重预先腹腔注射生理盐水2ml/kg，蜂斗菜提取物组和蜂斗菜内酯VIa组分别腹腔注射2ml/kg，每日1次，剂量见表6，连续给药三天。模型对照组、蜂斗菜提取物组以及蜂斗菜内酯VIa组第二天和第三天给药后0.5h按体重皮下注射ISO 0.15ml/100g，空白对照组注射等容量的生理盐水，分别记录最后一次给药前及第2次注射ISO后30min的心电图(标准II导联)，测量J点值，计算注射ISO后各组大鼠J点位移的绝对值。大鼠腹主动脉采血，肝素抗凝后离心分离血浆，分光光度法测定血浆中LDH活性单位。各给药组统计结果和模型组比较进行t检验。乳酸脱氢酶计算公式如下：

2、实验结果结果见表6。

表6、蜂斗菜提取物及蜂斗菜内酯VIa对ISO所致大鼠心肌缺血J点位移的影响(n＝8，

±SD)

^*p＜0.05，^**p＜0.01，与模型对照组比较

^△p＜0.05，^△△p＜0.01，与空白对照组比较

表7、蜂斗菜提取物及蜂斗菜内酯VIa对ISO大鼠LDH活性单位的影响(

±SD，n＝8)

^*p＜0.05，^**p＜0.01，与模型对照组比较

^△p＜0.05，^△△p＜0.01，与空白对照组比较

实验结果表明，在大鼠皮下注射ISO后，模型组动物出现J点位移增大，血浆中LDH活力单位增加的显著性心肌缺血改变，蜂斗菜提取物或蜂斗菜内酯VIa腹腔注射给药可以显著性降低J点位移和血浆中LDH水平，与空白对照组相比，蜂斗菜提取物或蜂斗菜内酯VIa组均呈现抗心肌缺血作用。

由此可见，蜂斗菜提取物或蜂斗菜内酯VIa对ISO引起的大鼠心肌缺血有显著的抑制作用，并可减轻缺血心肌的损伤，因此对心肌缺血有明显保护作用。

四、对大鼠冠状动脉结扎所致急性心肌缺血的保护作用

1、实验材料与方法

剂量设置：按体重，蜂斗菜提取物组给药剂量为40mg/kg，蜂斗菜内酯VIa组给药剂量为10mg/kg，阳性对照药为β受体拮抗剂普萘洛尔，剂量为5mg/kg。

取体重200g左右的健康SD大鼠40只，雌雄各半，随机均分成4组：模型对照组(生理盐水10ml/kg)，普萘洛尔组(5mg/kg)，蜂斗菜提取物组和蜂斗菜内酯VIa组(剂量见表7、表8)。所有样品经灌胃给药，每天1次，连续2天。

于末次给药后1h，按体重腹腔注射12％水合氯醛3ml/kg进行麻醉，记录正常心电图，胸部去毛、消毒，沿左锁骨中线纵行切开皮肤约2cm，在第4或第5肋间钝性分离肌层，打开胸腔，剪开心包，轻压右侧胸廓，挤出心脏，在右侧圆锥与左心耳之间冠状静脉处结扎左冠状动脉后，把心脏放回胸腔，充分排出胸腔内空气，缝合关闭胸腔，呼吸机辅助呼吸，频率20次/分，潮气量5ml。分别于结扎后即刻，1h，24h，48h描记一段心电图，并于24h、48h分别灌胃给药。

在冠脉结扎50h后，大鼠再次麻醉，腹主动脉采血，肝素抗凝，3000转离心10min后采血浆，测定LDH，并于取血后迅速取出心脏，用生理盐水冲洗，除去血污，剔除血管、脂肪等非心肌组织，用吸水纸吸去水分，称全心湿重。沿冠状沟切除心房，留下心室，称重，顺房室沟从心尖到心基部平行将心室肌横切成厚约0.1cm的心肌片4片，用生理盐水冲洗干净，将心肌片放在0.1％的N-BT溶液中，在37℃水浴条件下染色15min，染色后立即用水冲洗去多余的染料。梗死区不着色，非梗死区被N-BT溶液染成蓝色。剪去梗死心肌，称湿重，以梗死区湿重占全心湿重的百分比表示心肌梗死范围。各给药组统计结果和模型组比较进行t检验。

2、实验结果结果见表7、表8。

表7、蜂斗菜提取物及蜂斗菜内酯VIa对冠状动脉结扎致大鼠急性心肌缺血模型LDH活性的影响(

±SD，n＝10，U/L)

^**p＜0.01，与模型对照组比较

表8、蜂斗菜提取物和蜂斗菜内酯VIa对冠状动脉结扎致大鼠急性心肌缺血模型缺血范围的影响(±S，n＝10，％)

^**p＜0.01，与模型对照组比较

实验结果表明，大鼠行冠状动脉结扎术后J点位移迅速升高并且在结扎后1小时达到高峰，结扎50小时后模型组动物血浆中LDH活性有非常显著性上升，心肌缺血面积也显著增加。蜂斗菜提取物或蜂斗菜内酯VIa能显著降低LDH活性(P＜0.01)和心肌梗塞范围(P＜0.01)。

由此可见，蜂斗菜提取物或蜂斗菜内酯VIa灌胃给药对冠脉结扎引起的大鼠心肌缺血有明显的保护作用，能显著降低心肌缺血引起的组织坏死，对缺血组织有明显的保护作用。

五、对豚鼠过敏性鼻炎的防治作用

本发明利用卵清白蛋白诱导的过敏性鼻炎豚鼠动物模型研究蜂斗菜提取物和蜂斗菜内酯VIa对过敏性鼻炎的防治作用。

1、实验材料与方法

24只豚鼠，首日在4足肉垫内各注射0.15ml抗原佐剂混悬液(每毫升含卵白蛋白1mg，百日咳杆菌1×10¹⁰个及氢氧化铝2mg)进行初次致敏。5天后，在背部皮下分10个位点共注射1ml含有0.5mg卵白蛋白的生理盐水溶液强化致敏。在第14～28天每天在双侧鼻腔中用微量移液器滴注OVA生理盐水溶液(1mg/ml，每鼻孔10μl)进行局部抗原攻击，并立即计数豚鼠30min内的搔鼻次数观察记录豚鼠鼻涕，喷嚏症状，评价标准见表9。从第15-20天连续计数后，第20天将致敏成功豚鼠依据搔鼻次数分成2组，第21～27天给予受试药物，受试药物和对照样品在抗原攻击前1小时灌胃给予，并记录豚鼠搔鼻次数。第28天将豚鼠处死。

2、实验结果

表9.豚鼠鼻部症状观察标准

在给药后30分钟和2小时内观察以上症状，以叠加法记录总分，总分超过5分即为建模成功，观察结果见表10。

表10.鼻部症状豚鼠观察结果

搔鼻次数	数量(N)	鼻痒分数	清涕分数	喷嚏分数	分数备注
						5070	3	2	1	2	5
3050	13	3	1	2	6
						2030	8	2	1	2	5
基本不抓	0	0	0	0	0

由实验结果可见，致敏攻击后，豚鼠抓鼻次数显著上升，且伴有清涕及喷嚏症状，反应强烈，第21～27天，给药后后以卵清白白蛋白攻击，蜂斗菜提取物和蜂斗菜内酯VIIa与阴性对照组比较在统计学上有显著性意义；但是给药一段时间后，蜂斗菜提取物和蜂斗菜内酯VIIa与阴性对照组均表现出搔鼻次数略微上升趋势，各组豚鼠搔鼻次数统计结果，见表11。

表11.给药后，豚鼠抓鼻次数统计结果

与模型对照组相比，^*P＜0.05

六、对肿瘤细胞的体外抗肿瘤作用

1、实验材料与方法

MTT方法测定

原理：MTT(3-(4，5-dimethyl-2-thiazoyl)-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide)【3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5.二苯四氮唑溴盐】，是一种能接受H⁺的黄色染料。在活细胞线粒体呼吸链中，琥珀酸脱氢酶和细胞色素C可使MTT的四氮唑环开裂，生成蓝紫色的formazan结晶。而死细胞中不含这种脱氢酶。formazan结晶的生成量与活细胞数成正比，该结晶的DMSO溶液在570nm处有最大吸收峰，所以，可通过检测formazan结晶的量来评价药物对细胞增殖的影响。具体操作步骤如下：

(1)取对数生长期的肿瘤细胞(见表12)，将细胞密度用细胞培养液DMEM调至每毫升5×10⁴个细胞，加到96孔细胞培养板中，每孔100μl。蜂斗菜提取物组浓度设定为5μg/ml，蜂斗菜内酯VIa组浓度设定为5μg/ml，每组设6个平行样，每孔加入100μl，同时设空白对照组，每孔加入细胞培养液DMEM100μl，于37℃、5％CO₂的恒温培养箱中培养12h。

(2)每孔加入浓度为5mg/ml的MTT液30μl，37℃通入5％CO₂的培养箱中继续培养4h。

(3)吸去上清液，每孔加入DMSO150μl，在微量振荡器上振荡15分钟，至结晶完全溶解后，酶标仪测定每孔570nm处的吸光值(OD值)。

(4)取三孔平均OD值按公式IR％＝(OD空白对照-OD样品)/OD空白对照×100％计算蜂斗菜提取物或蜂斗菜内酯VIa对细胞增殖的抑制率(IR％)。

2、实验结果

表12MTT实验受试样品对肿瘤细胞增殖的抑制率

MTT实验表明，蜂斗菜提取物或蜂斗菜内酯VIa对HepG2、MCF-7、A549或Hela均有显著抑制作用。

七、对ICR小鼠体内S180肉瘤的抗肿瘤作用

1、实验材料与方法

ICR小鼠50只，体重：18～22g，随机分成5组(见表13)，S180细胞计数1.6×10⁷个/ml，生理盐水稀释到6×10⁵个/ml，然后每只老鼠脖颈处皮下接种0.2ml，于接种第二天给药，给药剂量见表13，阳性对照组为环磷酰胺，接种第7天左右小鼠背部有突起，继续给药，第15天，眼眶取血，脱颈处死，剥离肿瘤、脾脏和胸腺，称重。

2、实验结果

(1)血液标本：由长海医院检验科测定WBC，HGB，PLT，结果见表13。

表13各实验组小鼠血液中WBC，HGB，PLT测定结果

与模型对照组相比：^**P＜0.01，^*P＜0.05，WBC，HGB，PLT分别是白细胞、红细胞、血红蛋白，血小板。

(2)肿瘤重量以及胸腺、脾脏数据，见表14。

表14各实验组小鼠肿瘤脾脏、脾脏和胸腺结果

与模型对照组相比：^**P＜0.01，^*P＜0.05

由表14可见，蜂斗菜提取物或蜂斗菜内酯VIa有一定的抗肿瘤活性，环磷酰胺对ICR小鼠的脾脏影响很大。

八、对老年痴呆的治疗作用

老年性痴呆症的临床症状主要表现之一就是学习记忆功能障碍。学习和记忆是脑的重要功能之一，它反应脑的智力水平。而通过动物行为中所犯的错误多少可以衡量其学习和记忆的能力。东莨菪碱诱导的大鼠痴呆模型就是利用这种原理来研究药物对动物智力的影响。我们采用MORRIS水迷宫法及避暗实验两种方法，应用东莨菪碱学习记忆障碍模型，来观察蜂斗菜提取物和蜂斗菜内酯VIa对大鼠学习记忆的影响。

1、实验材料与方法

MORRIS水迷宫为一直径120cm、高50cm的圆柱形水池，以池底圆心为中心将迷宫划分成四个象限，将一直径12cm、高30cm的透明圆柱型有机玻璃平台置于某一象限中心，迷宫上方安置带有与电脑系统相连接的摄象机，可同步记录大鼠运动轨迹及寻找平台潜伏期等，实验期间迷宫外参照物及平台位置保持不变。实验时在池壁选择4个入水点，相邻两个入水点间距离不小于25cm，向水池内加入自来水，用奶粉染成不透明的乳白色，水面约高于平台面2cm，水温保持在25℃左右。70×20×30cm大鼠穿梭避暗箱有大小相等的明暗两个室，室底部铺设有钢栅，暗室钢栅可通38V交流电作为刺激条件，中间隔板上有一直径10cm的圆洞将两室相连。穿梭箱与电脑相连，能自动记录大鼠进入暗室的时间和次数等。

MORRIS水迷宫实验：SD大鼠50只，体重180～230g，随机分成5组，分别为空白对照组、模型对照组、阳性对照组、蜂斗菜提取物组和蜂斗菜内酯VIa组，药物溶剂为0.5％西黄蓍胶的水混悬液，阳性对照药为Hup A，空白对照组与模型对照组以0.5％西黄蓍胶的水混悬液灌胃，阳性对照组灌胃Hup A 4mg/kg，蜂斗菜提取物组按40mg/kg灌胃给药，蜂斗菜内酯VIa组按10mg/kg灌胃给药，每天2次，共8天。每天第一次给药后1小时，开始进行MORRIS水迷宫训练。实验前一天让大鼠自由游泳2分钟以适应周围环境，从第一天开始，每天训练4次，每次随机选择一个入水点，将大鼠面向池壁放入水中，观察并记录大鼠寻找并爬上平台的路线图及所需时间(潜伏期)。4次训练大鼠分别从四个不同的人水点人水，如果大鼠在120秒内未找到平台，需将其引至平台。这时潜伏期记为120秒，每次训练间隔60秒，连续7天。第8天末次给药后1小时，空白组大鼠腹腔注射生理盐水1ml/kg，其余各组大鼠腹腔注射氢溴酸东莨菪碱2mg/kg。每只大鼠注射结束后25min由一固定入水点面向池壁被投入水中，观察并记录其寻找平台路线及找到平台的时间(潜伏期)。

避暗实验：SD大鼠50只，体重180～230g，分组和给药剂量同上述MORRIS水迷宫实验，灌胃给药，每天2次，共8天。第8天末次给药后1小时开始训练，除空白对照组外，每组大鼠于训练前25min腹腔注射氢溴酸东莨菪碱2.0mg/kg，空白对照组为生理盐水1.0ml/kg。训练时将大鼠先放入箱内适应3min，然后接通电源，将动物背向洞口置于避暗箱明室，观察动物首次进入暗室的时间(潜伏期)和5min内进入暗室的总次数(犯错次数)。第9天重复避暗实验操作并记录潜伏期及犯错误数作为记忆指标。

2、实验结果

在适应训练中，所有动物活动正常；在最初的训练中，大鼠主要以边缘式(D)和随机式(C)寻找平台，随着训练增加，除模型对照组动物仍有大部分保持此搜索策略外，其余各组均主要为直线式(A)和趋向式(B)。由表17可以看出，与模型对照组相比，蜂斗菜提取物组或蜂斗菜内酯VIa组的大鼠寻找平台的潜伏期明显缩短，差异有统计学意义。

表15各组大鼠寻找平台的潜伏期

^*P＜0.05，^**P＜0.01与模型对照组比较

在避暗实验中，蜂斗菜提取物组和蜂斗菜内酯VIa组的大鼠所犯错误数显著低于模型对照组，而潜伏期则大大延长。结果见表16。

表16各组大鼠犯错次数及潜伏期比较

^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001与模型对照组比较

上述结果表明，蜂斗菜提取物或蜂斗菜内酯VIa能明显改善痴呆大鼠的学习记忆功能，因此对老年性痴呆具有一定的预防和治疗作用。

九、对抑郁症作用

小鼠强迫游泳实验(mouse forced swimming test)是经典的抑郁动物模型，故用其考察蜂斗菜提取物和蜂斗菜内酯VIa对实验性动物抑郁症的防治作用。

1、实验材料与方法

按张均田主编的《现代药理实验方法》(上册)第104页的方法进行。将小鼠40只，体重：18～22g，随机分成4组，每组10只，分别为空白对照组、阳性对照组、蜂斗菜提取物组和蜂斗菜内酯VIa组，放入水深10厘米，水温25±1℃的量筒(20厘米高，14厘米直径)中游泳，使其产生恐惧心理，5分钟后取出，32℃下将毛烘干后，24小时内分别给实验动物灌胃给药，空白对照组，给予等体积的生理盐水；阳性对照组，给予药物丙咪嗪，剂量为20mg/Kg；蜂斗菜提取物组，剂量为：60mg/Kg；蜂斗菜内酯VIa组，剂量为：15mg/Kg。再将小鼠放入上述环境中，测定小鼠在6分钟的后4分钟内保持游泳不动的时间，以不动时间的缩短作为判断药物抗抑郁作用的标准，实验重复三次。

2、实验结果

表17对小鼠强迫游泳实验行为的影响结果

与空白对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01

从表17中可以看出，蜂斗菜提取物或蜂斗菜内酯VIa均能显著减少小鼠强迫游泳不动时间，表明蜂斗菜提取物或蜂斗菜内酯VIa均具有抗抑郁活性，因此可以用于制备防治抑郁症的药物。

十、对人全血中白三烯B₄(LTB₄)产生的抑制作用

本试验测定蜂斗菜提取物和蜂斗菜内酯VIa抑制由钙离子载体激发的白三烯B₄的产生。由于LTB₄的产生是通过5-脂氧化酶的活化而介导的，所以，本试验可预测样品抑制5-脂氧化酶的能力。

1、实验材料与方法

实验分成3组，蜂斗菜提取物组、蜂斗菜内酯VIa组和空白对照组。将蜂斗菜提取物和蜂斗菜内酯VIa分别溶于DMSO溶液，蜂斗菜提取物的浓度为15μg/ml，蜂斗菜内酯VIa的浓度为5μg/ml。抽取正常人志愿者血液，肝素抗凝，在容积为1.5ml的聚丙烯管中分别加入1ml血液，按上述分组，蜂斗菜提取物组加入5μl的蜂斗菜提取物溶液，蜂斗菜内酯VIa组加入5μl的蜂斗菜内酯VIa溶液，空白对照组加入5μl DMSO溶液。然后将蜂斗菜提取物组、蜂斗菜内酯VIa组和空白对照组的聚丙烯管放在37℃的水浴中培养15分钟，再向各管中加入5μl的钙离子载体A23187(最终浓度为50μM)，混匀后，重新放回水浴锅中放置30分钟，以转速2500rpm低温(4℃)离心10分钟，分别将50μl上清液转移到预先冷却好的、含有950μl的酶免疫试验(EIA)缓冲液的微量离心管中，然后用EIA试剂盒(Cayman Chemical Co.，美国)测定LTB₄。将蜂斗菜提取物组、蜂斗菜内酯VIa组与空白对照组进行对比，据此计算产生LTB₄的抑制百分率和其IC₅₀。

2、实验结果

蜂斗菜提取物和蜂斗菜内酯VIa对LTB₄的IC₅₀分别为1010nM和898nM，表明蜂斗菜提取物或蜂斗菜内酯VIa对LTB₄均有明显的抑制作用。

十一、对组胺所致豚鼠离体气管平滑肌收缩的影响

1、实验材料与方法

参照文献(详见胡国胜，黄先菊，DDPH对多种介质所致豚鼠离体气管平滑肌收缩的影响中国现代应用药学杂志1998，15(4)：11-14)的方法，取雄性豚鼠20只，体重：300-500g，分成2组，击毙，立即分离剪下气管，放入盛有克-亨氏(Kerb-Henseleit)营养液的平皿中，气管腹面(软骨环面)纵行切开，再在2-3个软骨环的间隔横切，每段气管片在其纵切口处用针线缝上，每2-3段气管片相互连成一串，即成气管片标本，将标本悬挂在10ml浴管中，负荷1.5g，37℃保温，于克亨氏液中通氧(95％O₂+5％CO₂)，标本平衡约半小时，在张力稳定后，开始在浴管中加入不同浓度(M)组胺，使气管片收缩，记录组胺不同浓度(10^-7，10^-6，10^-5，10^-4)的紧张效应(累加剂量)。冲洗浴管，使气管片张力回复到原先位置(1g)，稳定一段时间后，加入受试样品，温孵5min后，加入不同浓度(M)组胺，使气管片收缩，记录组胺不同浓度(10^-7，10^-6，10^-5，10^-4)的收缩效应，每加一次受试样品观察3分钟。

数据统计结果用平均值±标准差(

±SD)表示。

2、实验结果结果见表18。

表18.不同样品对豚鼠离体气管平滑肌收缩的影响

*P＜0.05**P＜0.01，均与同组给药前比较

从实验结果可以看出，蜂斗菜提取物或蜂斗菜内酯VIa对组胺引起的豚鼠离体气管片收缩均有抑制作用。

综上所述，本发明蜂斗菜提取物或蜂斗菜内酯VIa具有防治脑缺血、心肌缺血、过敏性鼻炎、肿瘤、记忆障碍等活性，因此可用于制备防治心脑血管疾病、过敏性鼻炎、肿瘤、老年痴呆、抑郁症、组胺和/或白细胞三烯成分相关疾病的药物。

Claims (2)

1.一种蜂斗菜内酯Ⅵa，其特征在于化学结构如下：

2.权利要求1所述蜂斗菜内酯Ⅵa在制备防治心脑血管疾病、过敏性鼻炎、肿瘤、老年痴呆、抑郁症、组胺或白细胞三烯成分相关的疾病的药物中的应用。