CN110101758A - 刺梨在制备心肌缺血再灌注损伤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了刺梨在制备心肌缺血再灌注损伤药物中的应用,具体地说,刺梨及刺梨提取物可制备心肌缺血再灌注损伤药物,具有开发利用价值。
Description
技术领域
本发明涉及刺梨及刺梨提取物的新用途,具体涉及刺梨在制备心肌缺血再灌注损伤药物中的应用。
背景技术
刺梨(Rosa roxbunghii)为蔷薇科多年生落叶灌木缫丝花的果实,又名山王果、刺莓果、佛朗果、茨梨、木梨子,别名刺菠萝、送春归、刺酸梨子、九头鸟、文先果,是滋补健身的营养珍果,是一种稀有的果实。生于海拔500-2500米的向阳山坡、沟谷、路旁以及灌木丛中,是贵州、鄂西山区、湘西、凉山、冕宁山区等地的天然野果,在贵州省和河南省开封市有大面积的人工种植。
刺梨富含超氧化物歧化酶(简称SOD),维生素P,糖、维生素、胡萝卜素、有机酸和20多种氨基酸、10余种对人体有益的微量元素。以及过氧化物歧化酶。尤其是维生素C含量极高,是当前水果中最高的,每100克鲜果中含量841.58-3541.13毫克,是柑橘的50倍,猕猴桃的10倍,具有“维生素C之王”的美称。
刺梨果实中还含有大量的各种高级脂肪酸和多元酸成分,特别是不饱和脂肪酸含量较高,如亚油酸、亚麻酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸、枸橼酸、苹果酸等
刺梨及刺梨提取物常用于排铅、抗衰老、降三高、治疗脚气病、治疗口腔炎症、治疗夜盲症、健脾助消化解疼痛、促进人体正常发育、增强机体对传染的抵抗力以及防癌抗癌等方面。因此,对其进行深入研究具有深远意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题提供了刺梨在制备心肌缺血再灌注损伤药物中的应用,有利于对刺梨的深入研究,具有开发价值。
本发明的技术方案:刺梨在制备心肌缺血再灌注损伤药物中的应用。
刺梨提取物在制备心肌缺血再灌注损伤药物中的应用。
前述刺梨提取物在制备心肌缺血再灌注损伤药物中的应用中,所述刺梨提取物是以50%乙醇按照液料比20:1,70-90℃回流提取2-3小时,共提取3次,hpd-600大孔树脂吸附1h,10倍柱体积水洗脱杂质,10倍柱体积40%乙醇洗脱,挥去乙醇,冻干得到的。
一种心肌缺血再灌注损伤药物,所述药物原料中包含有刺梨或刺梨提取物。
一种心肌缺血再灌注损伤药物,所述药物主要由刺梨或刺梨提取物制备而成。
申请人对刺梨提取物对心肌缺血再灌注损伤的保护作用进行了实验研究,并通过以下实施来进一步阐述本发明。
实验例1:
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物
清洁级雄性SD大鼠,体重(260±30)g,由贵州医科大学实验动物中心提供,实验动物生产许可证:SCXK(黔)2012-0001,实验动物使用许可证:SYXK(黔)2012-0001。
1.1.2药物和试剂
刺梨提取物,本实验室自制(50%乙醇按照液料比20:1,70-90℃回流提取2-3小时,共提取3次,hpd-600大孔树脂吸附1h,10倍柱体积水洗脱杂质,10倍柱体积40%乙醇洗脱,挥去乙醇,冻干即得。);复方丹参滴丸,天士力医药集团股份有限公司,批号:171021;乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒,南京建成生物工程研究所,批号:20181127;超氧化物气化酶(SOD)测定试剂盒,南京建成生物工程研究所,批号:20181128;谷草转氨酶(AST)测定试剂盒,南京建成生物工程研究所,批号:20181128;丙二醛(MDA)测定试剂盒,购自武汉伊莱瑞特生物技术有限公司,批号:9YPBG4X9WT;肌酸激酶同工酶(CK-MB)试剂盒,购自武汉伊莱瑞特生物技术有限公司,批号:RQQLWFUI7C;2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC),北京博奥拓达科技有限公司。组织标本固定液(4%多聚甲醛固定液):多聚甲醛,批号:20180112,规格:500g/瓶,国药集团化学试剂有限公司生产。PBS磷酸盐缓冲液(0.01M PH7.2-7.4),批号ZLI-9062,北京中杉金桥生物技术有限公司生产。
1.1.3主要仪器
BL-420N生物信号采集与分析系统、BI-2000图像分析软件,成都泰盟科技有限公司;V-300小动物呼吸机,上海玉研科学仪器有限公司。Dk-98-IIA电热恒温水浴锅,天津市斯特仪器有限公司;FA1004N电子天平,上海菁海仪器有限公司;Epoch多功能微孔板读数仪,美国BioTek公司;TGL-10B高速离心机,上海安亭科技仪器厂;ULTS1368医用超低温冰箱,赛默飞世尔仪器有限公司。
1.2方法
1.2.1分组和给药
取雄性SD大鼠48只,称重并标记,将其随机分为6组,分别为缺血再灌注模型组,假手术组(只穿线不结扎),阳性药组(复方丹参滴丸,72.9mg/kg),刺梨提取物高、中、低剂量组(400、200、100mg/kg)。各组大鼠连续灌胃给药7d,每天1次,其中假手术组和模型组每天按1ml/100g灌胃纯净水。由于手术难度较大,且需要剔除心电图异常和造模过程中死亡的大鼠。因此保证各组存活且心电图正常的大鼠有8只。其中,每组取5只大鼠进行TTC染色,3只大鼠进行HE染色,8只大鼠进行血清生化酶检测。
1.2.2大鼠心肌缺血再灌注损伤模型建立
(1)造模前禁食不禁水12h,末次给药60min后,以戊巴比妥钠按照60mg/kg的剂量对大鼠实施腹腔注射麻醉,仰卧位固定于手术台上。
(2)接肢体导联线,连接BL-420N生物机能实验信号采集系统,记录Ⅱ导联心电图。
(3)顿性分离大鼠气管,剪一个“倒T形”口,通过三通阀气管插管连接小动物呼吸机(频率为75次/min,潮气量5mL,呼吸比为2:1),打结固定气管与气管插管。
(4)剃掉胸前毛,碘酒、酒精消毒,剪开皮肤外层,从第2-3肋骨间钝性分离组织与肌肉,用开胸器扩开胸腔的同时把肺挡住,露出心脏,小心撕开心脏包膜。在肺动脉圆锥与左心耳的交界处,找到与左冠状动脉伴行的冠状静脉。用5-0无损伤缝合线在左心耳下方1.5-2mm处进针,肺动脉圆锥侧出针,结扎冠状动脉左前降支,造成心肌缺血,剪断多余线头,关闭胸腔,用生理盐水润湿的纱布遮住伤口。
(5)以左室前壁呈苍白色以及心电图显示ST段较结扎前抬高1/2或T波高耸为结扎成功标志。
(6)结扎30min后打开胸腔,提起缝合线,贴近结扎处剪开结,从而恢复血液灌注,记录心电图,再灌注120min。以心脏表面颜色转红、ST段抬高或T波较结扎时下降在1/2以上为再灌注成功标志。假手术组按照以上方法操作,仅穿线不结扎。图1与图2分别为大鼠心脏结扎前与结扎后。
1.2.3心电图T波和ST段的测定
除了假手术组只穿线不结扎之外,其余各组分别于冠状动脉左前降支结扎前(BL-15min),结扎15min(I-15min)、30min(I-30min),再灌注30min(R-30min)、60min(R-60min)、120min(R-120min)记录心电图的ST段和T波,每次取6个心动周期;以TP线作为ST段与T波偏移的基线,ST段与T波作为评价心肌损伤程度的指标。
1.2.4样本的采集与处理方法
1.2.4.1血清的采集
当大鼠心肌缺血再灌注末,立即剪开下肢靠近腹部的皮肤,钝性撕开肌肉,分离股动脉。10mL EP管口接触股动脉下端,剪开股动脉上端取血,室温静置40min,3500r/min离心10min,取上层淡黄色血清,用1.5mL EP管分装,置于-80℃超低温冰箱中冷冻保存,待测血清指标。
1.2.4.2心肌梗死面积标本制备与处理方法
再灌注末期,立即取出心脏(每组5个样本),生理盐水洗净心脏血液。-20℃冷冻40min,将心肌组织切成5片,每片厚度为0.1-0.2mm。通过浓度为1%的2,3,5-三苯基四唑氯化物(TTC)溶液于37℃的恒温水浴振荡器中匀速震荡20min,然后置于4%甲醛溶液中固定12h。通过BI-2000软件计算心肌梗死面积和心肌总面积,心肌梗死率=(梗死面积/总面积)。
1.2.4.3心肌组织病理学检测
再灌注末期,每组取3个大鼠心脏样本,放置于10%中性甲醛溶液中固定2周左右,然后用进行组织脱水,用石蜡进行包埋、再切片。苏木精染色10-20min,自来水冲洗1-3min;盐酸酒精分化5-10s;自来水冲洗1-3min;加入85%的酒精3-5min;伊红染色3-5min;水洗3-5s;梯度酒精脱水;中性树胶封固,在显微镜下拍摄病理照片。
1.2.4.4血清指标检测
血清指标均严格参照试剂盒说明书进行检测。
1.3数据统计
所有实验数据的均值、方差和统计学差异分析均采用Graphpad prism 6.0软件处理。
2实验结果
2.1刺梨提取物对心电图的影响
2.1.1刺梨提取物对大鼠心肌缺血再灌注损伤ST段的影响
在结扎心脏冠动脉左前降支前(即BL-15min),各组大鼠的ST段无显著性差异(P>0.05)。结扎后,各组与假手术组比较,模型组在缺血15min、30min和再灌注30min、60min、120min各点ST段显著抬高,差异具有统计学意义(P<0.05),其中缺血期间、再灌注30min和60min差异更为明显(P<0.001);再灌注120min的ST段约为缺血30min时的1/2,这标志着模型建立成功。与模型组比较,阳性药物复方丹参滴丸在缺血期和再灌注期各时间点ST段显著降低(P<0.01,P<0.05);刺梨提取物高、中、低剂量组在缺血期、复灌30min和60min的ST段有统计学意义(P<0.05),再灌注120min各组与模型组相比无统计学意义(P>0.05)。(见表1,图3)
表1刺梨提取物对心肌缺血再灌注损伤大鼠的ST段影响(n=8)
Tab.1Effect of RRT on ST segments in rats of MIRI(n=8)
注:与假手术组比较,#P<0.05,###P<0.001;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01。
Note:compared with sham group,#P<0.05,###P<0.001;compared with modelgroup,*P<0.05,**P<0.01.
2.1.2刺梨提取物对心肌缺血再灌注损伤大鼠心电图T波的影响
结扎冠状动脉左前降支前(即BL-15min),各组T波之间无统计学差异(P>0.05)。与假手术组比较,模型组缺血期和再灌注期T波显著增高(P<0.01,P<0.001),这标志着模型建立成功。与模型组比较,阳性药复方丹参滴丸在缺血15min、30min和再灌注30min、60min、120min各时间点T波显著降低(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,刺梨提取物高、中、低剂量组在缺血15min、30min和再灌注30min时能减小T波增高,差异具有统计学意义(P<0.05);复灌60min和120min时与模型组相比无统计学意义(P>0.05),说明刺梨提取物对T波的影响主要在缺血时期与再灌注初期。(见表2,图4)
表2刺梨提取物对心肌缺血再灌注损伤大鼠的T波影响(=8)
Tab.2Effect of RRT on T waves in rats of MIRI(n=8)
注:与假手术组比较,#P<0.05,###P<0.001;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01。
Note:compared with sham group,#P<0.05,###P<0.001;compared with modelgroup,*P<0.05,**P<0.01.
2.2刺梨提取物对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌梗死面积的影响
由于脱氢酶存在于心肌细胞,在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)作用下,可以与无色的氯化三苯基四氮唑(简称TTC)反应,从而使心肌组织染成红色。当心肌收受到损伤后,心肌细胞中脱氢酶因细胞膜损伤而释放,随后失活。所以心肌的梗死部位不能还原TTC,故呈苍白色。与假手术组比较,模型组心肌梗死面积显著增加(P<0.001),这标志着心肌缺血再灌注模型制备成功;与模型组比较,阳性药复方丹参滴丸与刺梨提取物各剂量组与阳性药物组大鼠心肌梗死范围均明显的降低(P<0.05,P<0.001)。其中高剂量组与阳性药组心肌梗死范围相对模型组最低。见表3,图5和图6。
表3刺梨提取物对心肌缺血再灌注损伤大鼠梗死面积的影响.(n=8)
Tab.3Effect of RRT on infarction size of rats with myocardialischemia-reperfusion injury(n=8)
注:与假手术组比较,,###P<0.001;与模型组比较,*P<0.05,***P<0.001。
Note:compared with sham group,###P<0.001;compared with model group,*P<0.05,**P<0.001.
2.3刺梨提取物对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌病理组织改变的影响
HE染色病理形态学观察结果见图7。通过综合分析HE染色结果,在模型组中,部分心肌纤维变性坏死,可见坏死细胞着色不均,部分有空泡变性,胞核固缩、碎裂或溶解,部分血管周围纤维组织增生,心肌纤维间可见炎细胞浸润,主要为淋巴细胞和中性粒细胞。假手术组中,间质内未见明显纤维组织增生和炎细胞浸润;心内膜内皮细胞完好;未见坏死及瘢痕组织形成;其他未见明显病理变化。阳性药组中,心外膜结构较为完整,心肌膜及心内膜心肌纤维形态较为正常,肌间血管充血扩张;其他未见明显病理变化。高剂量组中,部分心肌纤维灶状变性坏死,可见坏死细胞结构模糊,胞核固缩碎裂,周围较多炎细胞浸润,轻微水肿,透光度增强;其他未见明显病理变化。中剂量组中,部分心肌纤维灶状变性坏死,可见坏死细胞结构模糊,胞核固缩碎裂,周围较多炎细胞浸润,并有网状纤维组织增生,轻微水肿,透光度增强。低剂量组中,部分心肌纤维变性坏死,可见坏死细胞着色不均,部分有空泡变性,胞核固缩、碎裂或溶解,心肌纤维间可见炎细胞浸润,主要为淋巴细胞和中性粒细胞。综上所述,按病变程度由重到轻依次为模型组、中剂量组、低剂量组、阳性药组、高剂量组、假手术组。
2.4血清检测结果
AST、LDH和CK-MB作为临床上判断心肌细胞损伤和坏死最常用的生化标志物及诊断标志物,称为心肌酶;其中CK-MB是诊断AMI的特异性指标,在临床治疗中有着极其重要意义。当发生心肌缺血再灌注时,会产生大量的氧自由基(ROS),主要攻击生物膜上的不饱和脂肪酸,导致生物膜脂质过氧化。而细胞内的超氧化酶歧化酶(SOD)作为自由基清除剂,能够抑制脂质过氧化反应降低ROS对心肌组织的损伤。丙二醛(MDA)是ROS发生脂质过氧化后的最终产物,因此通过比较各组SOD活性及MDA浓度可以判定组织受损伤的程度。统计结果见表4。
表4刺梨提取物对心肌缺血再灌注损伤大鼠血清含量活性的影响
Tab.4Effect of RRT on content in rats of myocardial ischemia-reperfusion injury(n=8)
注:与假手术组比较,##P<0.05,###P<0.001;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01,
***P<0.001。
Note:compared with sham group,##P<0.05,###P<0.001;compared with modelgroup,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.
2.4.1血清中AST活性
如图8所示。与假手术组比较,模型组大鼠血清中AST的活性显著升高,具有显著性差异(P<0.001);表明模型建立成功。与模型组比较,阳性药物组与刺梨提取物各剂量组明显降低AST活性,差异有统计学意义(P<0.05)。说明刺梨提取物具有一定的降低血清中AST活性的作用。
2.4.2血清中LDH水平
如图9所示。与假手术组比较,模型组LDH活性显著升高(P<0.001),这标志着模型制备成功,与模型组比较,阳性药物组与刺梨提取物各剂量组LDH活性均明显降低(P<0.05及P<0.001)。表明刺梨提取物能够降低LDH活性。
2.4.3血清中CK-MB活性
如图10所示。与假手术组比较,模型组血清中CK-MB活性显著升高(P<0.001),表明模型建立成功。与模型组比较,阳性药物组与刺梨提取物各剂量组CK-MB活性均明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。
2.4.4血清中SOD活性
如图11所示。与假手术组比较,模型组SOD活性显著降低(P<0.001),这标志着心肌缺血再灌注模型建立成功。与模型组比较,阳性药复方丹参滴丸组与刺梨提取物各剂量组能明显增加SOD活性(P<0.05,P<0.001)
2.4.5血清中MDA活性
如图12所示。与假手术组比较,模型组MDA活性显著降低(P<0.001),这标志着心肌缺血再灌注模型建立成功。与模型组比较,阳性药复方丹参滴丸组与刺梨提取物各剂量组能明显降低MDA活性(P<0.05,P<0.001)
4结论
刺梨提取物能明显降低ST段的抬高和T波的增大,减少心肌梗死面积,抑制心肌酶谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)的漏出,降低血清中丙二醛(MDA)的浓度,改善SOD活性。刺梨提取物对心肌缺血再灌注损伤的保护作用是通过抑制自由基的产生、增强自由基的清除功能、维持心肌细胞氧化和抗氧化的动态平衡,从而达到对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。
与现有技术相比,本发明提供了刺梨提取物在制备心肌缺血再灌注损伤药物中的应用,有利于对刺梨的深入研究。
附图说明
图1是实验例中大鼠心脏结扎前的照片;
图2是实验例中大鼠心脏结扎后的照片;
图3是实验例中刺梨提取物对心肌缺血再灌注大鼠ST段的影响;
图4是实验例中刺梨提取物对心肌缺血再灌注大鼠T波的影响;
图5是实验例中刺梨提取物对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌梗死面积的影响(注:与假手术组比较,,###P<0.001;与模型组比较,*P<0.05,***P<0.001);
图6是实验例中刺梨提取物对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌梗死面积的影响;
图7是实验例中刺梨提取物对心肌缺血再灌注损伤大鼠组织病理学影响(×400);
图8是实验例中刺梨提取物对心肌缺血再灌注损伤大鼠血清AST活性的影响(注:与假手术组比较,##P<0.05,###P<0.001;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001);
图9是实验例中刺梨提取物对心肌缺血再灌注损伤大鼠血清LDH活性的影响(注:与假手术组比较,##P<0.05,###P<0.001;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001);
图10是实验例中刺梨提取物对心肌缺血再灌注损伤大鼠血清CK-MB活性的影响(注:与假手术组比较,##P<0.05,###P<0.001;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)
图11是实验例中刺梨提取物对心肌缺血再灌注损伤大鼠血清SOD活性的影响(注:与假手术组比较,##P<0.05,###P<0.001;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)
图12是实验例中刺梨提取物对心肌缺血再灌注损伤大鼠血清MDA的影响(注:与假手术组比较,##P<0.05,###P<0.001;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明,但并不作为对本发明限制的依据。
实施例1。心肌缺血再灌注损伤药物,取刺梨,干燥粉碎成微粉,取刺梨微粉50g,另取药用淀粉100g,混合均匀,按照胶囊剂的常规制备工艺制成胶囊剂,每粒重0.8g。
用法用量:成人口服,每次3-5粒,每天2次。
实施例2。心肌缺血再灌注损伤药物,取刺梨提取物50g,另取药用淀粉200g,混合均匀,按照胶囊剂的常规制备工艺制成胶囊剂,每粒重0.8g。
用法用量:成人口服,每次3-5粒,每天2次。
实施例3。心肌缺血再灌注损伤药物,取刺梨,干燥粉碎成微粉,取刺梨微粉50g,另取药用淀粉100g,混合均匀,按照片剂的常规制备工艺制成片剂,每粒重1g。
用法用量:成人口服,每次2-4片,每天2次。
实施例4。心肌缺血再灌注损伤药物,取刺梨提取物50g,另取药用淀粉200g,混合均匀,按照片剂的常规制备工艺制成片剂,每片重1g。
用法用量:成人口服,每次2-4片,每天2次。
Claims (5)
1.刺梨在制备心肌缺血再灌注损伤药物中的应用。
2.刺梨提取物在制备心肌缺血再灌注损伤药物中的应用。
3.根据权利要求2所述刺梨提取物在制备心肌缺血再灌注损伤药物中的应用,其特征在于:所述刺梨提取物是以50%乙醇按照液料比20:1,70-90℃回流提取2-3小时,共提取3次,hpd-600大孔树脂吸附1h,10倍柱体积水洗脱杂质,10倍柱体积40%乙醇洗脱,挥去乙醇,冻干得到的。
4.一种心肌缺血再灌注损伤药物,其特征在于:所述药物原料中包含有刺梨或刺梨提取物。
5.一种心肌缺血再灌注损伤药物,其特征在于:所述药物主要由刺梨或刺梨提取物制备而成。
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WO2024114117A1 (zh) * | 2022-11-29 | 2024-06-06 | 普济生物科技(台州)有限公司 | 一种心肌缺血再灌注模型的建立和评价方法 |
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JPH0383548A (ja) * | 1989-08-28 | 1991-04-09 | Maruzen Kasei Co Ltd | スーパーオキサイド消去剤、飲食物および化粧料 |
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