CN107158008A - 一种治疗心肌梗死的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种治疗心肌梗死的药物组合物，包括式(Ⅰ)所示的丹参酮类化合物和含有一个或多个式(Ⅱ)所示取代基的酚酸类化合物，优选地，包括丹参酮I和丹参素或丹参酮IIA和丹酚酸B或二氢丹参酮I和原儿茶醛或隐丹参酮和丹酚酸C。本发明通过将含有特定取代基的酚酸类化合物与特定结构的丹参酮类化合物制备成药物组合物，该药物组合物能够有效缩小急性心肌梗死大鼠的心肌梗死面积，而且毒副作用低；该组合物中的酚酸类化合物不但可以显著降低丹参酮类化合物的体内外毒副作用，而且还可以增强丹参酮类化合物对急性心肌梗死大鼠的心肌保护作用。

Description

一种治疗心肌梗死的药物组合物
技术领域
本发明属于医药领域，涉及已知化学成分的联合用药，具体涉及一种治疗心肌梗死的药物组合物。
背景技术
急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)是最严重的冠状动脉疾病，在发达国家每年死亡人数的三分之一死于该疾病。在美国，超过240万人死于心肌梗死，在欧洲和亚洲北部，超过400万人死于心肌梗死[Worldwide trends in bloodpressure from1975to 2015:apooled analysis of 1479population-based measurement studies with19·1million participants,Lancet.2016Nov 15.pii:S0140-6736(16)31919-5]。近几十年来，临床多通过经皮冠状动脉介入治疗或者溶栓治疗的方式来降低冠心病的死亡率，药物多用于二级预防，目前临床使用的药物有抗血小板制剂(阿斯匹林)、β-受体阻滞剂、他汀类调脂药物及血管紧张素转换酶抑制剂等[Future treatment strategies in ST-segment elevation myocardial infarction,Lancet.2013Aug 17；382(9892):644-57]，能够有效治疗AMI，但是仍有继发性的梗死、心率衰竭等心血管事件发生，并且这些药物或多或少都存在一些不良反应，治疗AMI新药研发迫在眉睫。
心肌缺血再灌注损伤是指在心肌缺血一段时间后，再次恢复血供后发生的更为严重的损伤，可以导致缺血面积扩大、无复流、心肌顿抑和再灌注心律失常等。急性心肌梗死缺血再灌注会对急性心肌梗死患者的机体产生严重损伤。丹参酮是丹参中具有较强生物活性和广泛药理作用的一类脂溶性二萜醌类化合物，是目前国际上广泛认可的有效治疗心脑血管疾病的天然药物之一，多项研究均表明丹参酮对心肌缺血再灌注损伤具有明显的保护作用(丹参酮对兔急性心梗再灌注损伤的心肌保护，中国现代应用药学2013年10月第30卷第10期)。
但是，丹参酮类化合物对机体也存在毒副作用。W.Y.W.Lee等发现，隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA、二氢丹参酮I这四种丹参酮类化合物具有明显的体外细胞毒性[Cytotoxicity of major tanshinones isolated from Danshen(Salvia miltiorrhiza)on HepG2cells in relation to glutathione perturbation,Food ChemToxicol.2008Jan；46(1):328-38]。发明人所在课题组也证实了这种体外细胞毒性，同时还证实了这四种丹参酮类化合物的体内毒性，其在降低急性心肌梗死模型大鼠梗死面积的同时，也明显导致模型大鼠的死亡率升高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种用于治疗心肌梗死的药物组合物，该组合物中含有丹参酮类成分，更为重要的是含有一种对丹参酮类成分具有减毒增效作用的酚酸类成分，以制备出对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用且毒副作用明显降低的药物。
本发明通过如下技术方案实现：
一种治疗急性心肌梗死的药物组合物，包括式(Ⅰ)所示的丹参酮类化合物和含有一个或多个式(Ⅱ)所示取代基的酚酸类化合物；
其中，R为-H或-CH3；R为-H时，C3-C4和C5-C6为双键；R为-CH3时，C3-C4和C5-C6为单键；C1-C2为单键或双键。
优选地，所述丹参酮类化合物为丹参酮I，所述酚酸类化合物为丹参素。
优选地，所述丹参酮类化合物为丹参酮IIA，所述酚酸类化合物为丹酚酸B。
优选地，所述丹参酮类化合物为二氢丹参酮I，所述酚酸类化合物为原儿茶醛。
优选地，所述丹参酮类化合物为隐丹参酮，所述酚酸类化合物为丹酚酸C。
一种治疗急性心肌梗死的药物制剂，包括上述药物组合物，还包括药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。
优选地，所述药学上可以接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。
优选地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂、液体制剂。
酚酸类化合物在降低丹参酮类化合物对机体毒性方面的应用，所述丹参酮类化合物如式(Ⅰ)所示，所述酚酸类化合物含有一个或多个式(Ⅱ)所示的取代基；
R为-H或-CH3，R为-H时C3-C4、C5-C6为双键，R为-CH3时C3-C4、C5-C6为单键。
优选地，所述丹参酮类化合物为丹参酮I，酚酸类化合物为丹参素；或所述丹参酮类化合物为丹参酮IIA，酚酸类化合物为丹酚酸B；或所述丹参酮类化合物为二氢丹参酮I，酚酸类化合物为原儿茶醛；或所述丹参酮类化合物为隐丹参酮，酚酸类化合物为丹酚酸C。
本发明有益效果：
本发明通过将含有特定取代基的酚酸类化合物与特定结构的丹参酮类化合物制备成药物组合物，该药物组合物能够有效缩小急性心肌梗死大鼠的心肌梗死面积，而且毒副作用低；该组合物中的酚酸类化合物不但可以显著降低丹参酮类化合物的体内外毒副作用，而且还可以增强丹参酮类化合物对急性心肌梗死大鼠的心肌保护作用。
附图说明
图1为不同浓度二氢丹参酮I对乳鼠原代心肌细胞活力的影响(其中，横坐标是二氢丹参酮I浓度(mol/L)以2为底取对数变换后的值，纵坐标是细胞活力)；
图2为4μM二氢丹参酮I辅以不同浓度原儿茶醛对乳鼠原代心肌细胞活力的影响(横坐标是原儿茶醛浓度(mol/L)以2为底取对数变换后的值，纵坐标是细胞活力)；
图3为不同浓度二氢丹参酮I对大鼠心肌梗死面积的影响(其中，Sham代表假手术，Model代表模型组，DT 0.1mg/kg、DT 0.5mg/kg、DT 1mg/kg分别表示二氢丹参酮I的给药剂量为0.1mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg)；
图4为不同浓度二氢丹参酮I对大鼠心肌梗死面积的影响(其中，横坐标是图3所示各组别，纵坐标是梗死面积)；
图5为0.5mg/kg二氢丹参酮I联合不同剂量原儿茶醛对心肌梗死面积的影响；
图6为二氢丹参酮I联合不同剂量原儿茶醛对心肌梗死面积的影响(其中，横坐标是各组别，纵坐标是梗死面积)；
图7为二氢丹参酮I联合不同剂量原儿茶醛对CK-MB含量的影响(其中，横坐标是各组别，纵坐标是CK-MB的含量)；
图8为二氢丹参酮I联合不同剂量原儿茶醛对LDH含量的影响(其中，横坐标是各组别，纵坐标是LDH的含量)；
图9为二氢丹参酮I联合不同剂量原儿茶醛对cTn-I含量的影响(其中，横坐标是各组别，纵坐标是cTn-I的含量)；
图10为不同浓度丹参酮I对乳鼠原代心肌细胞活力的影响(其中，横坐标是丹参酮I浓度(mol/L)以2为底取对数变换后的值，纵坐标是细胞活力)；
图11为4μM丹参酮I辅以不同浓度丹参素对乳鼠原代心肌细胞活力的影响(横坐标是丹参素浓度(mol/L)以2为底取对数变换后的值，纵坐标是细胞活力)；
图12为不同浓度丹参酮I对大鼠心肌梗死面积的影响(其中，Sham代表假手术，Model代表模型组，TI 0.1mg/kg、TI 0.5mg/kg、TI 1mg/kg分别表示丹参酮I的给药剂量为0.1mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg，纵坐标是梗死面积)；
图13为0.5mg/kg丹参酮I联合不同剂量丹参素对心肌梗死面积的影响(其中，横坐标是各组别，纵坐标是梗死面积)；
图14为丹参酮I联合不同剂量丹参素对CK-MB含量的影响(其中，横坐标是各组别，纵坐标是CK-MB的含量)；
图15为丹参酮I联合不同剂量丹参素对LDH含量的影响(其中，横坐标是各组别，纵坐标是LDH的含量)；
图16为丹参酮I联合不同剂量丹参素对cTn-I含量的影响(其中，横坐标是各组别，纵坐标是cTn-I的含量)；
图17为不同浓度丹参酮IIA对乳鼠原代心肌细胞活力的影响(其中，横坐标是丹参酮IIA浓度(mol/L)以2为底取对数变换后的值，纵坐标是细胞活力)；
图18为8μM丹参酮IIA辅以不同浓度丹酚酸B对乳鼠原代心肌细胞活力的影响(横坐标是丹酚酸B浓度(mol/L)以2为底取对数变换后的值，纵坐标是细胞活力)；
图19为不同浓度丹参酮IIA对大鼠心肌梗死面积的影响(其中，Sham代表假手术，Model代表模型组，TIIA 0.5mg/kg、TIIA 1mg/kg、TIIA 2mg/kg分别表示丹参酮IIA的给药剂量为0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg，纵坐标是梗死面积)；
图20为1mg/kg丹参酮IIA联合不同剂量丹酚酸B对心肌梗死面积的影响(其中，横坐标是各组别，纵坐标是梗死面积)；
图21为丹参酮IIA联合不同剂量丹酚酸B对CK-MB含量的影响(其中，横坐标是各组别，纵坐标是CK-MB的含量)；
图22为丹参酮IIA联合不同剂量丹酚酸B对LDH含量的影响(其中，横坐标是各组别，纵坐标是LDH的含量)；
图23为丹参酮IIA联合不同剂量丹酚酸B对cTn-I含量的影响(其中，横坐标是各组别，纵坐标是cTn-I的含量)；
图24为不同浓度隐丹参酮对乳鼠原代心肌细胞活力的影响(其中，横坐标是隐丹参酮浓度(mol/L)以2为底取对数变换后的值，纵坐标是细胞活力)；
图25为8μM隐丹参酮辅以不同浓度丹酚酸C对乳鼠原代心肌细胞活力的影响(横坐标是丹酚酸C浓度(mol/L)以2为底取对数变换后的值，纵坐标是细胞活力)；
图26为不同浓度隐丹参酮对大鼠心肌梗死面积的影响(其中，Sham代表假手术，Model代表模型组，CT 0.5mg/kg、CT 1mg/kg、CT 2mg/kg分别表示隐丹参酮的给药剂量为0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg，纵坐标是梗死面积)；
图27为1mg/kg隐丹参酮联合不同剂量丹酚酸C对心肌梗死面积的影响(其中，横坐标是各组别，纵坐标是梗死面积)；
图28为隐丹参酮联合不同剂量丹酚酸C对CK-MB含量的影响(其中，横坐标是各组别，纵坐标是CK-MB的含量)；
图29为隐丹参酮联合不同剂量丹酚酸C对LDH含量的影响(其中，横坐标是各组别，纵坐标是LDH的含量)；
图30为隐丹参酮联合不同剂量丹酚酸C对cTn-I含量的影响(其中，横坐标是各组别，纵坐标是cTn-I的含量)；
具体实施方式
下面结合实施例和附图具体介绍本发明的技术方案。
下述实施例中，丹参酮类化合物和酚酸类化合物的缩写为：丹参酮I，TI；丹参素，DSS；丹参酮IIA，TIIA；丹酚酸B，SAB；二氢丹参酮I，DT；原儿茶醛，PCA；隐丹参酮，CT；丹酚酸C，SAC。
实施例1：原儿茶醛对二氢丹参酮I的减毒作用
1.实验材料
1.1仪器与设备
超净台(Thermo Scientific 1300A2型，美国)；多功能酶标仪FLUOstar Omega(BMG LABTECH，德国)；电子秤(天津天马衡基仪器有限公司)；Sartorius分析天平(北京多利斯天平有限公司)；BL-420S生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)；HX-100E小动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司)；HW-1000水浴锅(成都泰盟科技有限公司)。
1.1试剂
标准品：二氢丹参酮I，原儿茶醛，均购自成都曼思特生物科技有限公司。
试剂：DMEM高糖培养基、胎牛血清、100×青霉素和链霉素(Thermo Fisher，美国)；II型胶原酶(Worthington，美国)；5-溴代脱氧尿嘧啶(sigma，美国)；PBS(北京博奥森生物技术有限公司)；CCK8(上海东仁化学科技有限公司)；乌拉坦(国药集团化学试剂有限公司，上海)；水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司，上海)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(sigma，美国)；DMSO(sigma，美国)；羧甲基纤维素钠(国药集团化学试剂有限公司，上海)。
1.2动物来源
Sprage-Dawley大鼠购置于上海西普尔-必凯实验动物有限公司，合格证号SCXK(沪)2013-0016。
2.实验方法
2.1溶液和药物配制
乌拉坦：生理盐水充分溶解乌拉坦，配制成20％溶液，常温保存。
水合氯醛：生理盐水充分溶解水合氯醛，配制成3％溶液，常温保存。
1％2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)：磷酸缓冲盐溶液充分溶解TTC，配制成1％溶液，避光保存。
二氢丹参酮I、原儿茶醛药液的配制：细胞给药：二氢丹参酮I用DMSO配制成5mM的母液，原儿茶醛用灭菌水配制成400mM的母液；动物给药：二氢丹参酮I用DMSO配成5mg/ml的母液，用0.5％CMC-Na溶液混悬；原儿茶醛直接用0.5％CMC-Na溶液溶解。
2.2乳鼠原代心肌细胞提取
(1)实验准备：
a)出生1～3天的乳大鼠，进超净台前酒精擦拭灭菌。
b)用1×PBS(要求高压灭菌)将II型胶原酶溶解成0.8mg/ml浓度。先用少量PBS溶解，过滤，再稀释。
c)高压灭菌过的预冷1×PBS，加双抗，倒入P100板，用于心脏取出后放置，后面清洗时也需PBS
d)将滴管，移液管，窄口锥形瓶，手术器械等高压灭菌后放入超净台紫外杀菌。准备15ml离心管或者玻璃具塞离心管，鼠板紫外灭菌。打开37℃水浴锅。
(2)解剖取材：
准备两个培养皿，分别装入5ml 4℃预冷的1×PBS溶液，冰浴，并加入双抗溶液使终浓度为青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml。左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手取一把眼科直剪剪开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科直剪沿胸骨剑突左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。左手稍顶，挤出乳鼠的心脏。然后用眼科弯镊从心脏中部直接将心室部分剪下，放入冰浴的1×PBS中。取材完毕后，撤掉取材的手术器械。为了保证心肌细胞的活力，取心的操作过程尽量快。
(3)用第二套手术器械进行下列操作。把培养皿中的心脏周边的血凝块及纤维组织剔除掉，用眼科弯剪将心脏组织均匀剪成3～5碎块，放在另一个预先装好预冷的1×PBS中，将剪好的心脏组织用PBS洗3～5遍，直至血液清洗干净。
(4)将剪碎心脏转移至窄口锥形瓶中，加入II型胶原酶5～8ml，37℃水浴锅匀速摇晃消化3min，第一遍弃去。
(5)第二遍消化的细胞开始收集，一开始可以5min/次，后面可以逐渐减至3min/次，10次左右，收集的细胞放于事先加好培养液的离心管中终止消化，2000rpm，5min。
(6)重悬放入P100板培养。
(7)在培养皿中的细胞待贴壁3h后，下面贴壁的为心肌成纤维细胞。上清中为心肌细胞，计数种板，六孔板中每孔接种一只乳鼠心脏的细胞量。
(8)细胞贴壁后(24～48h)，可以加入0.1mM的BrdU以阻止成纤维细胞增殖，大约能维持1周跳动。
(9)接种后24h，用温的培养基或平衡盐液轻轻冲洗培养的心肌细胞一次，以除去未贴壁的细胞避免重叠生长，并更换培养液。按照实验需要可在培养48h或72h后施加处理因素。
2.3二氢丹参酮I细胞毒性以及原儿茶醛减毒作用的体外考察
(1)将接种于六孔板中的乳鼠原代心肌细胞置于10％胎牛血清的DMEM培养基中，于5％CO2培养箱37℃培养。
(2)用不同浓度二氢丹参酮I(0.1，0.5，1，2，4，8μM)作用24h，而后换液培养1周，1周后每孔加入200μL CCK8溶液，混匀后孵箱中继续培养2h。用酶标仪读取波长450nm处各孔的吸光度(OD)值，按下列公式计算细胞存活率。
细胞存活率＝[(As-Ab]/(Ac-Ab)]×100％
As：实验孔(含有细胞的培养基、CCK-8、药物)
Ac：对照孔(含有细胞的培养基、CCK-8、没有药物)
Ab：空白孔(不含细胞和药物的培养基、CCK-8)
(3)选取合适的二氢丹参酮I的浓度，与不同浓度原儿茶醛(5，20，40，80，160，320μM)混合作用乳鼠原代心肌细胞24h，而后换液培养1周，1周后每孔加入200μL CCK8溶液，混匀后孵箱中继续培养2h。用酶标仪读取波长450nm处各孔的吸光度(OD)值，计算细胞存活率。
2.4大鼠急性心肌梗死模型复制
本实验采用冠脉左前降支结扎法制作大鼠急性心肌梗死再灌模型[A novel andefficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in themouse,Circ Res.2010；107(12):1445-53]。方法为：取健康SD大鼠，体重250-280g，测定大鼠肢导联II导心电图，取心电图正常的大鼠进行手术。设定呼吸机参数为：呼吸频率为80次/min，潮气量为10ml/kg体重，呼吸比为2:1。大鼠采用3％水合氯醛腹腔注射(300mg/kg)麻醉后，气管切开连呼吸机行人工呼吸，开胸并暴露心脏上左冠状动脉前降支(Leftanterior descending，LAD)的结扎点，于左心耳下缘2mm处用3/8弧3×6无菌带线眼科缝合针(6-0丝线)穿过心肌浅层，结扎LAD，以心电图ST段明显上抬且结扎线以下心肌颜色变暗为心肌缺血标志，结扎后，关胸，逐层缝合肋骨、肌肉和皮肤；伪手术组开胸后，在造模对等位置仅穿线不结扎。
2.5二氢丹参酮I体内给药剂量考察
设定二氢丹参酮I 0.1mg/kg为低剂量、0.5mg/kg为中剂量、1mg/kg为高剂量，于手术造模前2天灌胃给药，每组4只，1次/天，共给药3次，最后一次给药为术前30min。再灌后24h测定心肌梗死面积，以确定给药剂量。
2.6二氢丹参酮I体内毒性试验以及原儿茶醛减毒作用的体内考察
分别给予不同浓度的二氢丹参酮I，于手术造模前2天开始灌胃给药，每组20只，1次/天，手术造模后持续灌胃给药1周，长期饲养观察15天，比较其与模型组的死亡率的差异。
选定二氢丹参酮I的浓度，与不同剂量的原儿茶醛混合一起给药，原儿茶醛的给药剂量分别为5mg/kg、20mg/kg、80mg/kg、160mg/kg，于手术造模前2天开始灌胃给药，每组20只，1次/天，手术造模后持续灌胃给药1周，长期饲养观察15天，比较其与单独给予二氢丹参酮I组的死亡率差异。
2.5心肌梗死面积的测定
大鼠称重，20％乌拉坦(1g/kg)麻醉，迅速开胸摘取心脏，剪去周围结缔组织，用冰生理盐水清洗，滤纸吸干水分后快速过液氮速冻，心脏组织均匀切为1～2mm的薄片，置于1％TTC染色液中37℃水浴染色10min。经TTC染色后，正常心肌组织呈玫瑰红色，梗死组织呈白色。用数码相机拍摄照片后输入电脑，用Image-Pro Plus 6图像分析软件计算梗死面积百分比，计算公式为：梗死部分面积/左心室面积×100％。
3.实验结果
3.1二氢丹参酮I细胞毒性以及原儿茶醛减毒作用的体外考察
乳鼠原代心肌细胞用二氢丹参酮I处理24h，培养1周后测定其细胞活力，实验结果显示，当二氢丹参酮I的浓度高于2μM时，有一定的细胞毒作用(相比于对照组，P<0.05)，见图1和表1。在二氢丹参酮I的给药浓度为4μM时，给以不同浓度的原儿茶醛，当加入原儿茶醛的浓度高于40μM时，可有效逆转二氢丹参酮I导致的细胞死亡(P<0.05)，见图2和表2。
表1不同浓度二氢丹参酮I对乳鼠原代心肌细胞活力的影响
表2二氢丹参酮I(4μM)辅以不同浓度原儿茶醛对乳鼠原代心肌细胞活力的影响
3.2二氢丹参酮I体内给药剂量考察
急性心肌梗死模型中，心脏切片病理染色的差异往往是作为金指标来评价心肌组织的损伤程度，通常采用TTC染色的方法，用图像处理软件分析心肌梗死面积。结扎大鼠冠脉左前降支造成心肌缺血24h后，测定其在不同给药浓度下的梗死面积。实验结果显示，结扎冠状动脉左降支后，模型组出现大面积的缺血区，与模型组相比，各给药组用药后梗死面积均有不同程度的缩小。由图3-4和表3可知，二氢丹参酮I为0.5mg/kg时具有显著的药效，且与1mg/kg的高剂量组无显著差异。
表3不同浓度二氢丹参酮I对大鼠心肌梗死面积的影响
3.3二氢丹参酮I体内毒性试验以及原儿茶醛减毒作用的体内考察
结扎大鼠冠脉左前降支造成心肌缺血后，术后一周持续给药，长期观察饲养15天，测定其死亡率。实验结果显示(表4)，二氢丹参酮I的剂量为0.5mg/kg时，其死亡率比模型组略高，差异不明显；二氢丹参酮I的剂量为1mg/kg时，其死亡率明显高于模型组和0.5mg/kg剂量组。当给予二氢丹参酮I为0.5mg/kg时，同时给予不同剂量的原儿茶醛可有效降低其死亡率，当给予原儿茶醛的剂量高于80mg/kg时，相比于单独给予二氢丹参酮I组，其死亡率显著降低，由此可见，二氢丹参酮I联合原儿茶醛可有效降低二氢丹参酮I的毒性致死率。
表4二氢丹参酮I体内毒性试验以及原儿茶醛减毒作用(n＝20)
结果讨论
1、二氢丹参酮I的浓度高于2_μM时，对乳鼠原代心肌细胞具有一定的细胞毒作用，细胞活力明显降低；二氢丹参酮I的浓度在4_μM的前提下，辅以不同浓度的原儿茶醛可有效逆转二氢丹参酮I导致的细胞死亡。
2、关于二氢丹参酮I体内对心肌梗死大鼠的心梗改善率和毒性致死率
实验3.2证明，二氢丹参酮I 0.5mg/kg可以有效改善心肌梗死大鼠心梗，且与二氢丹参酮I 1mg/kg无显著性差异；实验3.3表明，二氢丹参酮I 1mg/kg对心梗大鼠的毒性致死率显著高于二氢丹参酮I 0.5mg/kg，二氢丹参酮I 0.5mg/kg对心梗大鼠的毒性致死率高于模型组。综合实验3.2、3.3可知，二氢丹参酮I体内具有明显的致死毒性。
实验3.3中，给予二氢丹参酮I 0.5mg/kg的同时辅以给予不同剂量的原儿茶醛可以有效降低二氢丹参酮I对心梗大鼠的毒性致死率。
本实施例证明：原儿茶醛对二氢丹参酮I的体内外毒性具有减毒作用。
实施例2：原儿茶醛与二氢丹参酮I的协同作用
1.1仪器与设备
多功能酶标仪FLUOstar Omega(BMG LABTECH，德国)；80-2台式低速离心机(上海医疗器械(集团)有限公司手术器械厂)；5804R型台式冷冻高速离心机(Eppendorf，德国)；Sartorius分析天平(北京多利斯天平有限公司)电子秤(天津天马衡基仪器有限公司)；Sartorius分析天平(北京多利斯天平有限公司)；BL-420S生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)；HX-100E小动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司)；HW-1000水浴锅(成都泰盟科技有限公司)。
1.2试剂
标准品：二氢丹参酮I，原儿茶醛，均购自成都曼思特。
试剂：乌拉坦(国药集团化学试剂有限公司，上海)；水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司，上海)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(sigma，美国)；肝素钠(阿拉丁，上海)；DMSO(sigma，美国)；羧甲基纤维素钠(国药集团化学试剂有限公司，上海)；肌酸激酶同工酶(CK-MB)试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(建成生物工程研究所，南京)；肌钙蛋白(cTn-I)ELISA试剂盒(武汉华美生物工程有限公司，武汉)。
1.3动物来源
Sprage-Dawley大鼠购置于上海西普尔-必凯实验动物有限公司，合格证号SCXK(沪)2013-0016。
2.实验方法
2.1溶液配制
乌拉坦：生理盐水充分溶解乌拉坦，配制成20％溶液，常温保存。
水合氯醛：生理盐水充分溶解水合氯醛，配制成3％溶液，常温保存。
1％2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)：磷酸缓冲盐溶液充分溶解TTC，配制成1％溶液，避光保存。
二氢丹参酮I、原儿茶醛药液的配制：二氢丹参酮I用DMSO配成5mg/ml的母液，用0.5％CMC-Na溶液混悬；原儿茶醛直接用0.5％CMC-Na溶液溶解。
2.2大鼠急性心肌梗死模型复制
本实验采用冠脉左前降支结扎法制作大鼠急性心肌梗死再灌模型(Circ Res，2010，107(12)：1445-1453)：取健康SD大鼠，体重250-280g，测定大鼠肢导联II导心电图，取心电图正常的大鼠进行手术。设定呼吸机参数为：呼吸频率为80次/min，潮气量为10ml/kg体重，呼吸比为2:1。大鼠采用3％水合氯醛腹腔注射(300mg/kg)麻醉后，气管切开连呼吸机行人工呼吸，开胸并暴露心脏上左冠状动脉前降支(Left anterior descending，LAD)的结扎点，于左心耳下缘2mm处用3/8弧3×6无菌带线眼科缝合针(6-0丝线)穿过心肌浅层，结扎LAD，以心电图ST段明显上抬且结扎线以下心肌颜色变暗为心肌缺血标志，结扎后，关胸，逐层缝合肋骨、肌肉和皮肤；伪手术组开胸后，在造模对等位置仅穿线不结扎。
2.3动物血浆的收集以及心肌梗死面积的测定
大鼠称重，20％乌拉坦(1g/kg)麻醉，分离左颈总动脉，插管取血，3000rpm离心10min，取上清-80℃冰箱保存备用。迅速开胸摘取心脏，剪去周围结缔组织，用冰生理盐水清洗，滤纸吸干水分后快速过液氮速冻，心脏组织均匀切为1～2mm的薄片，置于1％TTC染色液中37℃水浴染色10min。经TTC染色后，正常心肌组织呈玫瑰红色，梗死组织呈白色。用数码相机拍摄照片后输入电脑，用Image-Pro Plus 6图像分析软件计算梗死面积百分比，计算公式为：梗死部分面积/左心室面积×100％。
2.4动物分组及给药方法
将心电图正常的健康雄性SD大鼠随机分为以下11组：(1)假手术组：仅开胸，穿线不结扎，灌胃给予等量生理盐水；(2)模型组：复制大鼠急性心肌梗死模型，手术造模前2天给予等量生理盐水灌胃，1次/天，手术造模前30min最后一次灌胃等量的生理盐水；(3)二氢丹参酮I组：同模型组一样进行手术，于手术造模前2天灌胃给予二氢丹参酮I(0.5mg/kg)，1次/天，手术造模前30min最后一次灌胃；(4)原儿茶醛组：同模型组一样进行手术，于手术造模前2天灌胃给予原儿茶醛，其剂量分别为5mg/kg、20mg/kg、80mg/kg、160mg/kg，1次/天，手术造模前30min最后一次灌胃；(5)二氢丹参酮I+原儿茶醛组：同模型组一样进行手术，于手术造模前2天灌胃给予二氢丹参酮I与原儿茶醛混合药液，二氢丹参酮I的剂量固定为0.5mg/kg，原儿茶醛的剂量分别为5mg/kg、20mg/kg、80mg/kg、160mg/kg，1次/天，手术造模前30min最后一次灌胃。
3.实验结果
3.1二氢丹参酮I联合不同剂量的原儿茶醛对心肌梗死面积的影响
为考察二氢丹参酮I联合原儿茶醛的最优给药剂量，造模后24h取心脏，测定梗死面积。实验结果显示，二氢丹参酮I联合原儿茶醛给药时，高剂量的原儿茶醛与二氢丹参酮I存在协同作用，其药效优于单独给于该剂量的原儿茶醛或者二氢丹参酮I，但是当原儿茶醛高于80mg/kg时，其协同的效应减弱(图5、图6和表5)。
3.2二氢丹参酮I联合不同剂量的原儿茶醛对心肌损伤生化指标的影响
心肌缺血损伤使心肌细胞膜受损，细胞膜通透性升高，心肌细胞内的大分子物质如CK-MB、LDH、cTn-I等外漏到细胞间质，然后进入淋巴管和心肌微血管，导致它们在血液中的浓度升高。血液心肌酶和肌钙蛋白水平是反应心肌缺血损伤的重要生化指标，是诊断心肌坏死的生化标志物。
结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠血清中CK-MB、LDH、cTn-I含量显著增加，提示造模成功。各给药组与模型组相比，均有显著降低CK-MB、LDH、cTn-I的释放的作用，其中，二氢丹参酮I组、原儿茶醛给药剂量为80mg/kg和160mg/kg组以及原儿茶醛在80mg/kg和160mg/kg剂量下联合二氢丹参酮I组均能显著降低CK-MB、LDH、cTn-I含量，具有心肌保护作用，当原儿茶醛的剂量为80mg/kg时，联合二氢丹参酮I给药组比单独给予该剂量的二氢丹参酮I或者原儿茶醛降低CK-MB、LDH、cTn-I的作用存在显著差异(图7-9和表5)。
表5联合给药对心肌梗死面积(n＝4)和心肌损伤生化指标(n＝3)的影响
本实施例证明：二氢丹参酮I给药同时辅以不同剂量的原儿茶醛可以明显提高其对心肌梗死大鼠的治疗效果，二者存在药效协同作用。
实施例3：丹参素(DSS)对丹参酮I(TI)的减毒增效作用
实验材料和实验方法同实施例1和实施例2，实验结果如下。
1、丹参酮I细胞毒性以及丹参素减毒作用的体外考察
乳鼠原代心肌细胞用丹参酮I处理24h，培养1周后测定其细胞活力，实验结果显示，当丹参酮I的浓度高于2μM时，有一定的细胞毒作用(相比于对照组，P<0.05)，见图10和表6。在丹参酮I的给药浓度为4μM时，给以不同浓度的丹参素，当加入丹参素的浓度高于37.5μM时，可有效逆转丹参酮I导致的细胞死亡(P<0.05)，见图11和表7。
表6不同浓度丹参酮I对乳鼠原代心肌细胞活力的影响
表7丹参酮I(4μM)辅以不同浓度丹参素对乳鼠原代心肌细胞活力的影响
2、丹参酮I体内给药剂量考察
急性心肌梗死模型中，心脏切片病理染色的差异往往是作为金指标来评价心肌组织的损伤程度，通常采用TTC染色的方法，用图像处理软件分析心肌梗死面积。结扎大鼠冠脉左前降支造成心肌缺血24h后，测定其在不同给药浓度下的梗死面积。实验结果显示，结扎冠状动脉左降支后，模型组出现大面积的缺血区，与模型组相比，各给药组用药后梗死面积均有不同程度的缩小。由图12和表8可知，丹参酮I为0.5mg/kg时具有显著的药效，且与1mg/kg的高剂量组无显著差异。
表8不同浓度丹参酮I对大鼠心肌梗死面积的影响
3、丹参酮I体内毒性试验以及丹参素减毒作用的体内考察
结扎大鼠冠脉左前降支造成心肌缺血后，术后一周持续给药，长期观察饲养15天，测定其死亡率。实验结果显示(表9)，丹参酮I的剂量为0.5mg/kg时，其死亡率比模型组相同，但是1-5天死亡率较高；丹参酮I的剂量为1mg/kg时，其死亡率明显高于模型组和0.5mg/kg剂量组。当给予丹参酮I为0.5mg/kg时，同时给予不同剂量的丹参素可有效降低其死亡率，当给予丹参素的剂量高于100mg/kg时，相比于单独给予丹参酮I组，其死亡率显著降低，由此可见，丹参素可有效降低丹参酮I的毒性致死率。
表9丹参酮I体内毒性试验以及丹参素减毒作用(n＝20)
4、丹参素与丹参酮I的协同作用
4.1丹参酮I联合不同剂量的丹参素对心肌梗死面积的影响
实验结果显示，丹参酮I联合丹参素给药时，丹参素与丹参酮I存在协同作用，其药效优于单独给于该剂量的丹参素或者丹参酮I(图13和表10)。
4.2丹参酮I联合不同剂量的丹参素对心肌损伤生化指标的影响
结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠血清中CK-MB、LDH、cTn-I含量显著增加，提示造模成功。各给药组与模型组相比，均有显著降低CK-MB、LDH、cTn-I的释放的作用，其中，丹参酮I组、丹参素给药剂量为100mg/kg和200mg/kg组以及丹参素在100mg/kg和200mg/kg剂量下联合丹参酮I组均能显著降低CK-MB、LDH、cTn-I含量，具有心肌保护作用，且联合给药的保护作用强于单独给药各自的保护作用(图14-16和表10)。
表10联合给药对心肌梗死面积(n＝4)和心肌损伤生化指标(n＝3)的影响
实施例4：丹酚酸B(SAB)对丹参酮IIA(TIIA)的减毒增效作用
实验材料和实验方法同实施例1和实施例2，实验结果如下。
1、丹参酮IIA细胞毒性以及丹酚酸B减毒作用的体外考察
乳鼠原代心肌细胞用丹参酮IIA处理24h，培养1周后测定其细胞活力，实验结果显示，当丹参酮IIA的浓度高于4μM时，有一定的细胞毒作用(相比于对照组，P<0.05)，见图17和表11。在丹参酮IIA的给药浓度为8μM时，给以不同浓度的丹酚酸B，当加入丹酚酸B的浓度高于25μM时可有效逆转丹参酮IIA导致的细胞死亡(P<0.05)，见图18和表12。
表11不同浓度丹参酮IIA对乳鼠原代心肌细胞活力的影响
表12丹参酮IIA(8μM)辅以不同浓度丹酚酸B对乳鼠原代心肌细胞活力的影响
2、丹参酮IIA体内给药剂量考察
急性心肌梗死模型中，心脏切片病理染色的差异往往是作为金指标来评价心肌组织的损伤程度，通常采用TTC染色的方法，用图像处理软件分析心肌梗死面积。结扎大鼠冠脉左前降支造成心肌缺血24h后，测定其在不同给药浓度下的梗死面积。实验结果显示，结扎冠状动脉左降支后，模型组出现大面积的缺血区，与模型组相比，各给药组用药后梗死面积均有不同程度的缩小。由图19和表13可知，丹参酮IIA为1mg/kg时具有显著的药效，且与2mg/kg的高剂量组无显著差异。
表13不同浓度丹参酮IIA对大鼠心肌梗死面积的影响
3、丹参酮IIA体内毒性试验以及丹酚酸B减毒作用的体内考察
结扎大鼠冠脉左前降支造成心肌缺血后，术后一周持续给药，长期观察饲养15天，测定其死亡率。实验结果显示(表14)，丹参酮IIA的剂量为1mg/kg时，其死亡率比模型组相同，但是1-5天死亡率较高；丹参酮IIA的剂量为2mg/kg时，其死亡率明显高于模型组和1mg/kg剂量组。当给予丹参酮IIA为1mg/kg时，同时给予不同剂量的丹酚酸B可有效降低其死亡率，当给予丹酚酸B的剂量高于100mg/kg时，相比于单独给予丹参酮IIA组，其死亡率显著降低，由此可见，丹酚酸B可有效降低丹参酮IIA的毒性致死率。
表14丹参酮IIA体内毒性试验以及丹酚酸B减毒作用(n＝20)
4、丹酚酸B与丹参酮IIA的协同作用
4.1丹参酮IIA联合不同剂量的丹酚酸B对心肌梗死面积的影响
实验结果显示，丹参酮IIA联合丹酚酸B给药时，丹酚酸B与丹参酮IIA存在协同作用，其药效优于单独给于该剂量的丹酚酸B或者丹参酮IIA(图20和表15)。
4.2丹参酮IIA联合不同剂量的丹酚酸B对心肌损伤生化指标的影响
结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠血清中CK-MB、LDH、cTn-I含量显著增加，提示造模成功。各给药组与模型组相比，均有显著降低CK-MB、LDH、cTn-I的释放的作用，其中，丹参酮IIA组、丹酚酸B给药剂量为100mg/kg和200mg/kg组以及丹酚酸B在100mg/kg和200mg/kg剂量下联合丹参酮IIA组均能显著降低CK-MB、LDH、cTn-I含量，具有心肌保护作用，且联合给药的保护作用强于单独给药各自的保护作用(图21-23和表15)。
表15联合给药对心肌梗死面积(n＝4)和心肌损伤生化指标(n＝3)的影响
实施例5：丹酚酸C对隐丹参酮的减毒增效作用
实验材料和实验方法同实施例1和实施例2，实验结果如下。
1、隐丹参酮细胞毒性以及丹酚酸C减毒作用的体外考察
乳鼠原代心肌细胞用隐丹参酮处理24h，培养1周后测定其细胞活力，实验结果显示，当隐丹参酮的浓度高于4μM时，有一定的细胞毒作用(相比于对照组，P<0.05)，见图24和表16。在隐丹参酮的给药浓度为8μM时，给以不同浓度的丹酚酸C，当加入丹酚酸C的浓度高于45μM时，可有效逆转隐丹参酮导致的细胞死亡(P<0.05)，见图25和表17。
表16不同浓度隐丹参酮对乳鼠原代心肌细胞活力的影响
表17隐丹参酮(8μM)辅以不同浓度丹酚酸C对乳鼠原代心肌细胞活力的影响
2、隐丹参酮体内给药剂量考察
急性心肌梗死模型中，心脏切片病理染色的差异往往是作为金指标来评价心肌组织的损伤程度，通常采用TTC染色的方法，用图像处理软件分析心肌梗死面积。结扎大鼠冠脉左前降支造成心肌缺血24h后，测定其在不同给药浓度下的梗死面积。实验结果显示，结扎冠状动脉左降支后，模型组出现大面积的缺血区，与模型组相比，各给药组用药后梗死面积均有不同程度的缩小。由图26和表18可知，隐丹参酮为1mg/kg时具有显著的药效，且与2mg/kg的高剂量组无显著差异。
表18不同浓度隐丹参酮对大鼠心肌梗死面积的影响
3、隐丹参酮体内毒性试验以及丹酚酸C减毒作用的体内考察
结扎大鼠冠脉左前降支造成心肌缺血后，术后一周持续给药，长期观察饲养15天，测定其死亡率。实验结果显示(表4)，隐丹参酮的剂量为1mg/kg时，其死亡率比模型组略高，但差异不明显；隐丹参酮的剂量为2mg/kg时，其死亡率明显高于模型组和1mg/kg剂量组。当给予隐丹参酮为1mg/kg时，同时给予不同剂量的丹酚酸C可有效降低其死亡率，当给予丹酚酸C的剂量高于100mg/kg时，相比于单独给予隐丹参酮组，其死亡率显著降低，由此可见，丹酚酸C可有效降低隐丹参酮的毒性致死率。
表19隐丹参酮体内毒性试验以及丹酚酸C减毒作用(n＝20)
4、丹酚酸C与隐丹参酮的协同作用
4.1隐丹参酮联合不同剂量的丹酚酸C对心肌梗死面积的影响
实验结果显示，隐丹参酮联合丹酚酸C给药时，丹酚酸C与隐丹参酮存在协同作用，其药效优于单独给于该剂量的丹酚酸C或者隐丹参酮(图27和表20)。
4.2隐丹参酮联合不同剂量的丹酚酸C对心肌损伤生化指标的影响
结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠血清中CK-MB、LDH、cTn-I含量显著增加，提示造模成功。各给药组与模型组相比，均有显著降低CK-MB、LDH、cTn-I的释放的作用，其中，隐丹参酮组、丹酚酸C给药剂量为100mg/kg和200mg/kg组以及丹酚酸C在100mg/kg和200mg/kg剂量下联合隐丹参酮组均能显著降低CK-MB、LDH、cTn-I含量，具有心肌保护作用，且联合给药的保护作用强于单独给药各自的保护作用(图28-30和表20)。
表20联合给药对心肌梗死面积(n＝4)和心肌损伤生化指标(n＝3)的影响
上述试验证明，联合使用丹参酮I和丹参素或丹参酮IIA和丹酚酸B或二氢丹参酮I和原儿茶醛或隐丹参酮和丹酚酸C治疗急性心肌梗死具有意料不到的技术效果，这种技术效果是本领域技术人员预料不到的，可以以丹参酮I和丹参素或丹参酮IIA和丹酚酸B或二氢丹参酮I和原儿茶醛或隐丹参酮和丹酚酸C为活性成分制备用于治疗急性心肌梗死的药物，药效优异且毒性低。本领域技术人员可以制成治疗急性心肌梗死的药物制剂，包括上述活性成分，还包括药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。丹参酮类化合物水溶性较差，而酚酸类化合物水溶性较好，发明人发现，在制备上述组合物时添加适量的枸橼酸可以显著增加丹参酮类化合物的水溶性，使其在水中易溶(上述丹参酮和丹酚酸类化合物在质量体积浓度0.2-5％的枸橼酸水溶液中可以达到易溶)，降低水性制剂的制备难度。药学上可以接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料，药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂、液体制剂。

Claims (10)

1.一种治疗急性心肌梗死的药物组合物，其特征在于：包括式(Ⅰ)所示的丹参酮类化合物和含有一个或多个式(Ⅱ)所示取代基的酚酸类化合物；
其中，R为-H或-CH3；R为-H时，C3-C4和C5-C6为双键；R为-CH3时，C3-C4和C5-C6为单键；C1-C2为单键或双键。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于：所述丹参酮类化合物为丹参酮I，所述酚酸类化合物为丹参素。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于：所述丹参酮类化合物为丹参酮IIA，所述酚酸类化合物为丹酚酸B。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于：所述丹参酮类化合物为二氢丹参酮I，所述酚酸类化合物为原儿茶醛。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于：所述丹参酮类化合物为隐丹参酮，所述酚酸类化合物为丹酚酸C。
6.一种治疗急性心肌梗死的药物制剂，其特征在于：包括权利要求1-5任一所述的药物组合物，还包括药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。
7.根据权利要求6所述的治疗急性心肌梗死的药物制剂，其特征在于：所述药学上可以接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。
8.根据权利要求6所述的治疗急性心肌梗死的药物制剂，其特征在于：所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂、液体制剂。
9.酚酸类化合物在降低丹参酮类化合物对机体毒性方面的应用，所述丹参酮类化合物如式(Ⅰ)所示，所述酚酸类化合物含有一个或多个式(Ⅱ)所示的取代基；
R为-H或-CH3，R为-H时C3-C4、C5-C6为双键，R为-CH3时C3-C4、C5-C6为单键。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述丹参酮类化合物为丹参酮I，酚酸类化合物为丹参素；或所述丹参酮类化合物为丹参酮IIA，酚酸类化合物为丹酚酸B；或所述丹参酮类化合物为二氢丹参酮I，酚酸类化合物为原儿茶醛；或所述丹参酮类化合物为隐丹参酮，酚酸类化合物为丹酚酸C。
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